引起呼吸道感染的典型病原体课件.ppt

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1、主要引起呼吸道感染的非典型病原体,引起社区呼吸道感染的典型病原体肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌引起社区呼吸道感染的非典型病原体肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌,国内CAP流行病学,肺炎链球菌和非典型病原体为主要致病菌,N=126,N=63,N=56,N=40,N=62,刘又宁等。中华结核和呼吸杂志。2006;29(l):3-8.,阳性率(%),一项自2003年2004年我国7个城市12个研究中心，对665例CAP患者病原体监测结果，肺炎链球菌检出率日趋升高。,支原体,支原体（Mycoplasma）是一类无细胞壁的原核微生物，在自然界广泛分布，比细菌小，能够通过除菌滤器，是目前能够在人工

2、培养基上生长的最小微生物。,1898年由法国人Nocard和Roux首先从患有胸膜炎的牛胸腔积液中分离，当时因未鉴定其种属，故称之为牛胸膜肺炎微生物。后来相继从其它动物疾病，如羊无乳症、犬瘟热病等分离出类似的病原体，统称为类胸膜肺炎微生物(pleuropneumonia like organisms, PPLO)。Dienes等于1937年首次从前庭腺炎患者脓液中分离出支原体。Chanock等于1962年成功进行支原体人工培养。1967年正式命名。,分布与分类,支原体在自然界中广泛分布，迄今已分离到150余种，其中寄生性的有90多种，而人体支原体至少有16种。支原体归属柔膜体纲(Mollicu

3、tes)、支原体目(Mycoplamatales)。下再分三科：支原体科(Mycoplasmaceae)、无胆甾支原体科(Acholeplasmataceae)、螺旋原体科(Spiroplasmataceae)。其中支原体科又分两个属：支原体属(Mycoplasma)和脲原体属(Ureaplasma)。对人致病的主要为肺炎支原体(M. pneumoniae)、人型支原体(M. hominis)、生殖器支原体(M. genitalium)、穿通支原体(M. penetraus)和溶脲脲原体(U. urealyticum)。,肺炎支原体,肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae, M

4、P)，是引起呼吸道感染的一种病原体，所引起的人类支原体肺炎病理变化以间质性肺炎为主，又称之为原发性非典型性肺炎。,一、临床意义,肺炎支原体感染呈全球性分布，以温带为主。平时散在发病，35年出现一次地区性流行。本病传染源为病人或带菌者，主要经飞沫传染，主要是在学校、家庭和军队流行，长期密切接触才能感染发病。流行特点为间歇性，长时期缓慢播散，可持续数月至一年。,（一）致病性,肺炎支原体主要侵犯呼吸系统。粘附作用 肺炎支原体借滑行运动穿过粘膜上皮细胞纤毛屏障，隐藏在细胞间隐窝内，以其尖端特殊结构（P1蛋白）粘附于上皮细胞的表面受体上。粘附后吸取宿主细胞的养料赖以生长、繁殖，同时释放有毒代谢产物如过氧

5、化氢、超氧阴离子和核酸酶等使细胞受损。致病也与引起迟发型变态反应有关。如MP与人心肌、肺和脑组织有共同抗原，能产生交叉免疫反应，形成抗原-抗体复合物，引起肺外组织病变。,（二）所致疾病,肺炎支原体是青少年急性呼吸道感染的主要病原体之一，临床上大多数表现为上呼吸道感染综合征，发展为肺炎者仅占3%10%，占非细菌性肺炎的1/3以上。首先引起上呼吸道感染，然后下行引起气管炎、支气管炎、毛细支气管炎和肺炎。X线可见两侧肺部呈羽毛状浸润。可引起严重的双侧肺炎和其他系统的肺外并发症，如脑膜炎、脑干炎、脊髓炎、心肌炎、心包炎、免疫性溶血性贫血、肾炎等。,二、生物学特性,（一）形态与结构肺炎支原体形态呈短细丝

6、状，长约25m，在近细胞丝状体尖端有一球状的特殊结构，典型的肺炎支原体形态类似酒瓶状，没有细胞壁，仅有细胞膜。革兰染色阴性，但不易着色，Giemsa染色呈淡紫色。电镜下观察，支原体的细胞膜由三层结构所组成，厚7.510nm，内外两层主要为蛋白质，中间层系脂质，其中胆固醇含量占36%。所有肺炎支原体株均有17104Da的P1膜蛋白和43103Da菌体蛋白，是肺炎支原体的主要特异性免疫原，是目前血清学诊断推选的主要抗原。,（二）培养特性,营养要求高，培养基中必须添加10%20%的人或动物血清，以提供支原体不能合成的固醇和长链脂肪酸，并可稳定其细胞膜。初次分离培养支原体，尚须添加10%的酵母浸膏，并

7、置于5%CO2 的的条件下生长较好。生长最适PH为7.88.0，PH 7.0以下可使其死亡，最适温度为3637。支原体主要以二分裂繁殖，由于基因组小，代谢能力有限，故繁殖较慢，16小时分裂一代，反复传代后生长快，对数生长期细胞数可达107CFU/ml；在液体培养基中常呈极浅淡的混浊，在相差显微镜下为球形或双球形及长丝状，以滑行方式进行运动；在固体培养基上形成直径10100m的菌落。初次分离时菌落呈细小的草莓状，反复传代后呈典型的“荷包蛋”状菌落；菌落能吸附豚鼠红细胞；能产生溶血素，可迅速而完全地溶解哺乳动物红细胞；半固体培养基中呈现肉眼可见的细小粒状菌落。,初分离时，一般10d左右长出菌落，呈

8、致密圆形，常不出现油煎蛋状，需经数次传代后，菌落开始出现典型的油煎蛋状。肺炎支原体的分离培养阳性率不高，需20d或更长时间，对临床快速诊断意义不大。但对流行病学调查有意义。,三、微生物检查,（一）标本采集 一般可取病人痰、咽拭子、鼻咽洗液、支气管分泌物、血清标本等。因肺炎支原体有粘附细胞作用，以拭子标本为好。支原体对热和干燥敏感，取材后宜立即接种，或置于转运培养基中（蔗糖磷酸盐缓冲液），4能保存72h，70或液氮能长期保存。,（二）标本直接检查 1标本涂片 革兰染色不易着色，电子显微镜观察无细胞壁，易与细菌鉴别。2核酸检测 PCR法快速、敏感和特异，目前某些临床实验室以特异性引物通过这一技术从

9、患者痰中检测肺炎支原体DNA。由于此方法相当敏感，故实验操作时应特别小心，避免污染。,（三）分离与鉴定,1分离培养 常用的培养基是以牛心消化液为基础另加20%小牛血清及新鲜酵母浸液制成的液体或固体培养基。肺炎支原体对美蓝、醋酸铊、青霉素不敏感，在培养基中加入适当浓度醋酸铊、青霉素可作为分离培养时防止杂菌污染的抑制物。初次分离生长缓慢，通常先将标本接种于加有葡萄糖以及酚红、美蓝指示剂的液体培养基中增菌，在1周后培养基由紫变绿，液体清晰，可考虑肺炎支原体生长，此时，可转种于固体培养基上。在含5% CO2大气环境下培养。,2鉴定 支原体缺乏细胞壁，在固体培养基上生长出典型油煎蛋样菌落表明标本中有支原

10、体，需进一步进行生化反应和血清学鉴定。肺炎支原体能发酵葡萄糖产酸，不能利用精氨酸与尿素，可还原美蓝。如呼吸道标本能使含葡萄糖培养基pH缓慢地降低(颜色由红变黄)，生长的菌落能发生红细胞吸附等，则可推测标本中存在肺炎支原体。,人类主要支原体生物学性状,（四）血清学诊断方法,有ELISA、冷凝集试验、补体结合试验、间接血凝试验等。1ELISA 此法敏感，特异性高，快速经济，用170KDa的P1蛋白和43KDa多肽检测相应抗体，为目前诊断MP感染的可靠的方法。用ELISA捕捉法，以抗P1 McAb检测标本中肺炎支原体分子量43KDa多肽或170KDa的P1蛋白，3h可完成试验，特异性高，敏感性为10

11、4CFU/l标本。,2补体结合(CF)试验 是诊断肺炎支原体感染常用的血清学方法，试验所用的抗原常为氯仿-甲醇提取的糖脂类抗原。取急性期和恢复期双份血清试验，效价呈4倍增长者，或单份血清效价1 641128者，80%的病例表明近期有肺炎支原体感染。但是在老年病人中；CF试验阴性尚不能排除肺炎支原体感染。该试验敏感性与特异性90%左右。此试验主要检测IgM抗体，故初次感染时出现阳性，再次感染时常不出现阳性反应。,3间接血凝试验 此试验操作简便，敏感度略高于补体结合试验，感染发病后7d出现阳性，1030d达高峰，1226周逐渐降低。本试验与补体结合试验类似，主要测IgM抗体，特异性不理想，突出地表

12、现在肺炎支原体和生殖道支原体之间存在着抗原交叉反应。,4冷凝集试验 冷凝集素是支原体感染后机体产生的一类IgM型自身抗体。冷凝集试验是检测患者血清中冷凝集素的一种非特异性试验。其方法是将患者的稀释血清与O型Rh阴性红细胞在4下作凝集试验。有33%76%肺炎支原体感染者为阳性(效价164)。效价越高或双份血清呈4倍以上升高，肺炎支原体近期感染的可能性越大。阳性者中85%的人有特异性肺炎支原体抗体存在。,四、药物敏感性及治疗建议,支原体对热的抵抗力一般与细菌相似。耐冷，70或液氮可长期冻存。如在4放置也不要超过3天。支原体对干燥敏感，干燥的标本难以分离出支原体。因此，标本到达实验室后应尽快接种。因

13、支原体无细胞壁，对青霉素、头孢菌素等作用于细胞壁的抗菌药物不敏感。支原体对作用于其核蛋白体，抑制或影响菌体蛋白合成的抗菌药物（四环素类和大环内酯类）敏感，如红霉素、强力霉素、螺旋霉素等。呼吸喹诺酮类有很好的活性。,衣原体,衣原体是一群细胞内寄生的原核微生物，有独特的生长发育周期，能在宿主细胞的胞质内复制，形成特征性的细胞内包涵体。,衣原体的发育周期,分类,衣原体目（chlamydiales）衣原体科（chlamydiceae）衣原体属（chlamydia）根据衣原体的抗原构造和DNA同源性的特点，将衣原体属分为四个种，包括沙眼衣原体（C. trachomatis）、肺炎衣原体（C. pneum

14、oniae）、鹦鹉热衣原体（C. psittaci），1992年之后又增加第4种衣原体家畜衣原体（C.pecorum）。对人致病的主要是前三种衣原体。,肺炎衣原体,第一株肺炎衣原体是于1965年从台湾省一名儿童的眼部用鸡胚分离出来的，暂名为TW-183T。1983年又从西雅图患咽炎的一名大学生咽部分离到一株AR-39，后来发现这两株衣原体抗原性相同，因此将TW-183T和AR-39两株衣原体组合成TWAR株。1989年正式定名为肺炎衣原体（chlamydia pneumoniae）。肺炎衣原体只有一个血清型，98kD蛋白为其特异性抗原，代表株为TWAR。目前已新分离出10多株肺炎衣原体。是一种

15、重要的呼吸道病原体。,抗原构造与基因组,抗原构造TWAR只有一个血清型，外膜蛋白顺序分析完全相同。98KDa蛋白质为种特异性抗原。其单克隆抗体与沙眼衣原体及鹦鹉热衣原体无交叉反应。基因组TWAR全基因组测序已于1998年完成，全基因组含1230230bp，推测其含蛋白质基因1052个，RNA基因43个。与鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体的DNA同源性10%，而不同来源的TWAR株都具有94%以上的DNA同源性，其限制性内切酶的图谱相同。,一、临床意义,肺炎衣原体寄生于人类，过去认为人类是肺炎衣原体的唯一宿主，但近来从马和树熊体内分离出肺炎衣原体株。一般认为TWAR的感染是通过人与人之间经飞沫或呼吸道的

16、分泌物传播，在密切接触的家庭或在人群密集的公共场所更易传播。TWAR的感染具有散发和流行交替出现的周期性，感染扩散速度较为缓慢，在人群中流行持续6个月左右。,TWAR主要引起青少年急性呼吸道感染，可引起肺炎、支气管炎、咽炎和鼻窦炎等。起病缓慢，临床常表现有咽痛、声音嘶哑等症状。还可引起心包炎、心肌炎和心内膜炎。肺炎衣原体慢性感染与急性心肌梗死和慢性冠心病的关系，越来越引起人们的注意。,与冠心病有关,50%至60%的急性心肌梗死或慢性冠心病人血清肺炎衣原体抗体水平增高，或存在含衣原体LPS的免疫复合物；同时用电镜、免疫组化和分子生物学方法证明在冠状动脉粥样硬化病变中有肺炎衣原体存在（有肺炎衣原体

17、类似的梨形结构；病理切片用抗肺炎衣原体特异性单克隆抗体处理后呈阳性；病变标本PCR产物的序列与肺炎衣原体DNA完全一致）。慢性肺炎衣原体感染及其形成的免疫复合物，可引发自身免疫应答而损伤内皮细胞，还可诱生许多炎症介质如TNF、IL-1、IL-2等，这可能是冠心病发病的一个重要因素，但需进一步证实。,二、微生物检验,（一）标本采集由于痰标本对培养细胞有毒性作用，通常取咽拭标本或支气管肺泡灌洗液较好。采样拭子经鼻前庭插入鼻咽部，旋转后取出，置转运培养基冷藏送检，24h内接种分离或置-70保存。亦可由气管镜采集气管内痰液或肺泡灌洗液。接种细胞培养的标本最好用膜式滤菌器除去杂菌，不加抗生素。若进行血清

18、学检查，取患者外周血及其血清标本。（二）标本直接检查1直接显微镜检查 2特异性核酸的检测 采用限制性内切限切酶Pst对TWAR DNA酶切后，可以获得一474bp的核酸片段，这是其它两种衣原体没有的DNA片段。采用扩增DNA的PCR技术，可以进行TWAR特异性核酸片段的检测。,（三）细胞分离、培养与鉴定常选用HEP-2和H-292细胞系分离培养，细胞培养时35优于37，在接种标本以前，先用DEAE-葡聚糖处理宿主细胞，接种后的单层细胞经过离心，加入抗代谢物质放线菌酮于含有10%小牛血清的Eagle MEM培养基中，经过以上这些措施可促进肺炎衣原体的生长。在5% CO2中，35培养，经48h培养

19、后，取出一片盖片，固定后，用单克隆抗体作直接或间接法荧光染色。观察并计算包涵体数目。若第1代培养包涵体阴性，则盲传至第2代，标本接种和培养条件同上，接种后48h取片，染色镜检。如果传至第2代仍未见包涵体则盲传至第3代，标本接种和培养条件同上，接种后48h，取片、染色、镜检。根据第3代的培养结果，以出现包涵体与否作出结论性报告（阳性或阴性）。,（四）抗体检测以微量免疫荧光试验（MIF）最为敏感，该试验阳性者50%70%可分离出TWAR，用此法检测特异性的IgM和IgG抗体，有利于区别近期感染和既往感染，也有利于区别原发感染和再感染，TWAR的再感染相当常见，特别是老年人，再感染时一般不出现IgM

20、和补体结合抗体。,血清学试验判断感染类型的标准,三、药物敏感性及治疗建议,肺炎衣原体抵抗力较弱，易受各种理化因素影响。对磺胺类耐药，对红霉素、强力霉素、氟喹诺酮类等抗菌药物敏感。四环素类、氟喹诺酮类和大环内酯类抗菌药物是治疗衣原体感染的主要药物。,军团菌属(Legionella),属于军团菌科（Legionellaceae），现有45种细菌，60多个血清群，超过一半的细菌与人类疾病有关。绝大多数病例均由嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）的血清群1、4、6引起。除嗜肺军团菌外，常见的与人类疾病有关的军团菌是米克戴德军团菌（L. micdadei）、长滩军团菌（L. lon

21、gbeachae）、杜莫夫军团菌（L. dumoffii）、波兹曼军团菌（L. bozemanii）等。,一、微生物特性,革兰阴性杆菌，着色浅，无芽胞，无荚膜，有端鞭毛或侧鞭毛。菌体大小0.3m23m，有时呈线状，严格需氧。触酶阳性，可液化明胶，不分解糖类，部份菌株氧化酶阳性。具有O、H抗原，H抗原无特异性，O抗原可将嗜肺军团菌分成15个血清型，将伯兹曼军团菌，菲利军团菌，长滩军团菌等分为2个血清型。,抵抗力,嗜肺军团菌的生存能力较强，在蒸馏水中可存活100天以上，在下水道污水中可存活1年。对热和常用化学消毒剂敏感，1%来苏尔处理数分钟即可杀死。对氯作用的抵抗力比肠道杆菌强，在21时水中含0.

22、1mg/L游离氯，杀死90%嗜肺军团菌需40分钟，而杀死大肠埃希菌则不到1分钟。,二、临床意义,该菌存在于水和土壤中，常经供水系统、溶洞和雾化吸入而引起肺炎型和非肺炎型感染。,肺炎型（重症）,主要由嗜肺军团菌（LP），特别是LP1、LP6血清型及米克戴德军团菌引起，潜伏期210天。除呼吸道症状外还有明显的多器官损害，头痛、畏寒、发热、伴消化道及神经系统症状及体征，病死率高。,非肺炎型（庞蒂亚克热）,病情较轻的自限性疾病。潜伏期短，症状轻，以乏力、肌痛、发热、干咳常见，发病率高，但一般不致死。,能引起医院感染,军团菌在机会感染或医院内感染中的位置越来越被人重视。CDC报导该菌引起的医院感染可高达

23、23%，中老年人有慢性心、肺、肾病变、糖尿病、血液病、恶性肿瘤、艾滋病或接受免疫抑制剂者易发本病，且死亡率高达45%，并易合并其它微生物感染，形成难治性肺炎。,临床表现多样,军团菌病的临床表现是多种多样的。本病夏秋季节高发，易侵犯患有慢性器质性疾病或免疫功能低下患者，如恶性肿瘤、慢性支气管炎或肺气肿等患者，以及使用激素及免疫抑制剂和器官移植的患者。,传染与免疫,通过空气传播，直接进入肺部，在肺泡巨噬细胞内生长，造成肺泡和终末支气管产生炎症反应。发生感染时，宿主的免疫反应较为复杂。能产生抗体反应，在动物实验中抗体具有保护作用，人类军团菌感染时，体液免疫在免疫机制中不起主要作用。由于军团菌是胞内菌

24、，能在巨嗜细胞内繁殖，所以其免疫主要是细胞免疫。,发病机理,涉及多种因素：内毒素和细胞产生的多种酶。裂解红细胞的作用，亦可使豚鼠红细胞裂解。有消化卵黄囊的能力，在含5%卵黄的F-G琼脂上可表现，此种作用可能和外毒素有关。,三、微生物检验,（一）标本采集及处理 1.临床标本以痰、气管分泌物、胸水和血液为主。其中除胸水和血液外，均混有正常菌群及其它病原菌，在分离军团菌的同时也要分离其它菌，正常菌群对军团菌有抑制作用，取材后必须及时分离培养，并使用加抗生素的选择培养基抑制杂菌。2.病理组织标本，如：尸体或活检及实验动物的肝、脾等标本必须制成悬液，再进行涂片和分离培养。3.环境污染标本，如：水和土壤等

25、，水标本多应先浓缩再接种，土壤标本加入水中振荡30分钟取水样，参照水标本处理。,（二）标本直接检查,1.直接显微镜检查 涂片革兰染色及姬美尼兹染色（Gimenez）意义不大。2. 核酸检测 是快速特异的方法，采用DNA探针及PCR扩增rRNA的方法均可用于军团菌的快速诊断。原位杂交技术可利用特异性核酸作为探针对组织细胞进行杂交，以确定有无军团菌感染。PCR与传统方法比较有着更高的灵敏度，如果实验过程操作严格，引物选择适当，有较好的特异性。,（三）分离培养与鉴定,1.分离培养 本菌营养要求苛刻，生长缓慢，氧气含量低生长速度减慢，部分菌株在2.5%5%的CO2环境中生长良好，最适生长温度为35，最

26、适pH6.77.0。初次分离必须采用L-半胱氨酸和铁离子，在活性炭酵母浸液琼脂培养基(buffered charcoal-yeast extract agar ,BCYE)上35天可形成12mm直径的光泽菌落，在F-G(Feeley-Garman)琼脂培养基上,35天可见针尖大小的菌落，在紫外线照射下可产生荧光。,2.鉴定 色素产生试验：军团菌在MH-LH琼脂上可产生褐色色素，此种色素可能是由于酪氨酸酶或 L-苯丙氨酸羟化酶介导的黑色素所形成。为此，若在培养基中加入L-酪氨酸或L-苯丙氨酸，军团菌在此培养基上均可产生色素。军团菌产生的色素可分为在培养基中产生的褐色素；细胞外荧光，用长波紫外线照

27、射时可出现黄色或黄绿色荧光；细胞内荧光，在紫外线照射时，细菌菌落呈蓝白色或暗黄色荧光。,（四）抗体检测,作为检测军团菌感染临床常用手段，检测病人血清中抗军团菌IgM及IgG抗体可以做出特异性诊断。出现IgM抗体为近期感染，IgG抗体可在体内持续数月，供流行病学的调查。常采用方法包括：间接免疫荧光法（IFA）、微量凝集实验(MAA)、血试管凝集实验（TAT）、ELISA法等。几种方法的检测效果大致相同。以较为经典的IFA法为例，其敏感性约为75%，特异性几乎为100%。,军团菌的最终鉴定是综合它的生物学特性进行的综合分析，即形态、生化性状、分子生物学检测（PCR、16SrRNA）、抗体检测（IFA、ELISA）。,军 团 菌 感 染 诊 断 试 验,四、药物敏感性及治疗建议,临床首选治疗药物为红霉素，可加用利福平，氨曲南。氨基糖苷类抗生素、青霉素、头孢菌素类抗生素对本菌无效（部分菌株产生-内酰胺酶），体外药敏试验不作为临床常规监测项目。,Thank You!,