循环伏安法研究电极的可逆性课件.ppt

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1、1.1循环伏安分析基础,定义：循环伏安法 (Cyclic Voltammetry) 一种常用的电化学研究方法。该法控制电极电势以不同的速率，随时间以三角波形一次或多次反复扫描，电势范围是使电极上能交替发生不同的还原和氧化反应，并记录电流-电势曲线。属于线性扫描伏安法一种，循环伏安法的原理与线性扫描伏安法相同，只是比线性扫描伏安法多了一个回扫。关键词：电势（激励信号）；线性变化；三角波扫描；电流（响应信号）；电流-电势曲线,1,装置图,WE工作电极CE辅助电极RE参比电极,2,循环伏安法中-三角波扫描,3,1.2 CV图形解析,峰高测量1.切线法（半峰法） 起点（转折点）做切线，切线到最高点位置

2、。,4,从循环伏安图可获得以下电化学参数 氧化峰电流ipa还原峰电流ipc氧化峰电位Epa还原峰电位Epc2.条件电位 ： 3.半峰宽W1/2：电流等于极限电流（最大）的一半时峰宽。,5,半峰电位Ep1/2 ：当电流等于极限电流（最大）的一半时相应的电极电位。适用于宽峰，峰电位不易确定。 注意：半峰电位有两个， Ep1/2是起峰一侧的那个电位。,6,不规则峰解析，倾斜基线，前后基线突变，根据具体情况处理，考虑基线-起点与终点联线，以起峰一侧的电位进行测量。 某些电化学工作站软件在起峰前测量基线的斜率可人工修整，以求获得更精确的测量值。 高斯法：适用于差示脉冲等具有高斯分布特征的曲线。方法：从起

3、峰前一点向峰后一点拉直线，得到峰电位Ep、峰电流ip和峰面积Ap数据。起峰前后的点同样可以调整。,7,CV图形解析,8,CV图形解析,9,1.3 循环伏安法研究电极的可逆性,电极反应可逆指某个电极反应的正向速度和逆向速度相等,对于ZnZn2+电极，平衡指该状态下Zn2+还原速度与Zn氧化速度相等，两个方向的电子和物质交换速度相等。意味着此时通过电极的电流接近零。即所谓的平衡状态，因此，可逆状态是在平衡条件进行的。遵从能斯特公式 电极的可逆性是电化反应中的非常重要的性质。,不可逆电极反应,10,正向电压扫描时，发生还原反应上半部分的还原波，也称为阴极支；当反向电压扫描时，发生氧化反应到下半部分的

4、氧化波，称为阳极支。可逆过程：阴极支和阳极支应该接近重合。即峰电位接近，峰电流（与电子数有关）接近。,循环伏安法研究电极的可逆性,循环伏安法是研究电极的可逆性的非常有用的手段,11,电极过程的可逆性判断,1.可逆电极,1.可逆电极反应，上下两条曲线是对称的,两峰电流 之比:ipa/ipc1。,2.阳极峰电位与阴极峰电位之差较小:,3.改变扫描速度，峰电位不变，峰电位差与扫描速率无关。,12,电极过程的可逆性判断,扫描速率的影响，峰电位差与扫描速率无关。但峰电流与v1/2线性,核黄素在玻碳电极上,13,电极过程的可逆性判断,2.不可逆电极,1.通常为单峰，无回扫峰，或正向峰，或上下两条曲线是不对

5、称的,两峰电流之比:ipa/ipc明显大于或小于1。,2.阳极峰电位与阴极峰电位之差较间，相距越大不可逆程度越大:,3.改变扫描速度，Ep随v移动,峰电位明显受到与扫描速率影响。,14,准可逆过程,准可逆（部分可逆，半可逆）电极过程来说，仍是接近可逆过程，具有氧化峰和还原峰双峰。E=Epa-Epc0.058/n(V)（两峰比可逆过程更开）。ipa/ipc大于或小于1（有人认为不大于1.5）。改变扫描速度，氧化峰正移（说明更难于被氧化），还原峰负移（说明更难于被还原）。ipa、ipc且随扫速的增大而变大，仍正比于1/2。,15,各种峰形比较,16,可逆峰与尖峰,Hemamala I. Karun

6、adasa, Jeffrey R. Long, et. al. J. Nature. 464, 1329(2010).,17,1.4 电极过程的性质,电极过程的基本过程,18,电极性质-控制步骤,电活性的物质首先经过扩散过程到达电极表面然后通过吸附过程吸附在电极表面参与反应两个连续过程那一个慢就是受那个控制扩散控制：扩散过程速度较慢，为整个反应的控制过程。动力学控制：动力学反应速度较慢，为整个反应的控制过程。,19,电极过程控制机理氧化峰或还原峰峰电流与扫描速率成正比（线性关系），表明电极过程主要受动力学反应控制。不可逆电极反应峰电流与扫描速率的平方根成线性关系，电极过程主要受扩散控制。可逆电

7、极反应,判断其控制步骤,20,多巴胺氧化峰与还原峰峰电流与扫描速率成线性关系，说明电极过程主要受动力学反应控制。,判断其控制步骤,21,顺铂氧化峰还原峰峰电流与扫描速率的1/2方成线性关系，说明电极过程主要受扩散控制。,判断其控制步骤,22,一般低扫描速度下，电极受到动力学反应控制影响，高扫描速度下电极受到扩散控制的影响。,不同浓度控制步骤不一样，一般高浓度下，电极受到动力学反应控制影响，低浓度下电极受到扩散控制的影响。,23,1.5 循环伏安研究电极反应参数-参与反应的电子数n与质子数m,24,参与反应的电子数n,1. 基于电量的方法-法拉第定律 法拉第定律的数学表达式为：Q=nZF 式中Q

8、是通过电极的电量，n是沉积出该金属的物质的量。法拉第电解定律不仅适用于电解过程，并且适用于一切电极反应的氧化和还原过程。 根据Laviron理论，峰电流ip与电子转移数n有如下关系：式中，F为法拉第常数96485 Cmol-1，A为电极表面积，T为298K，电量Q=nFAT为循环伏安某单一过程的峰面积（以电量计，通常由仪器给出），由ip与扫描速度v的线性关系，求出现斜率，从而解出现n。,E. Laviron. General expression of the linear potential sweep voltammogram in the case of Diffusionless el

9、ectrochemical systems. Electroanal Chem, 1979, 101(1):19-28,25,参与反应的电子数n,2. 基于能斯特定律-氧化峰和还原峰电位之差（该方程是否适合不可逆过程？），不同扫描速度取平均值（适合于可逆与准可逆）。,3.根据Laviron半峰宽法可设为0.5,Laviron E ,J Electroanal chem,1974,52:355,26,参与反应的电子数n,4. 不可逆电极根据Laviron，峰电位与扫描速度关系应遵循关系式：,式中，称为转换系数(传递系数),在01之间，描述电极电势对阳极反应和阴极反应影响的程度，v扫描速度，ks为

10、反应动力学速率常数。,测定不同扫描速度下的峰电位，做出现Eplnv直线，根据式（1）斜率计算n，结合式（2）解出和n 。,Laviron E ,J Electroanal chem,1974,52:355,（2）为不可逆反应的峰电位Ep与Ep/2和的关系,27,电子数 由Ep(V) -ln直线斜率=RT/2nF，已知，可求得：n=0.71。,28,参与反应的电子数n,或者根据文献，测定不同扫描速度下的峰电位。,Bard A J, Faulkner L R. Electrochemical Methods. New York: John Wiley & Sons, 1980. 223, 143,

11、 253.,29,单扫描过程伏安法峰电流与浓度等因素关系：,Randles-Savcik方程求A和D,1.Randles-Savcik方程,循环伏安属于线性扫描伏安法一种，也遵守线性扫描伏安法的规律,30,电极过程动力学参数 A、D,1. 以浓度为1.010-3 mol/L的K3Fe(CN)6为模型物（扩散系数D0=7.610-6 cm2/s，n=1），固定其它因素，改变扫描速度，根据Randles-Sevcik公式，测定ipa与1/2的关系，作图求得K3Fe(CN)6 的ipa1/2斜率。2. 测得氧化峰电流与扫描速度的关系为： ipa(A)=2.073510-5+3.768510-41/2

12、(V/s)1/2) 直线斜率K=2.69105n3/2AD01/2c，求得电极有效面积A（ cm2）。,31,电极过程动力学参数A、D,3.固定其它因素，改变扫描速度，根据Randles-Sevcik公式，测定被测样品ipa与1/2的关系，作图求得ipa1/2斜率，在已知A、n的情况下，根据ipa1/2斜率求出现扩散系数D（cm2/s）。,以多巴胺DA为例,32,参与反应的质子数-酸度对电极反应的影响,33,多酚类物质具有抗氧化作用，可以清除自由基，有防治心血管疾病、抑制肿瘤、抗衰老等作用。并具有抑制癌症发生的功能。1989年，WHO世界心血管疾病控制系统流行病学调查证实，法国人摄取大量动物性

13、脂肪和胆固醇，但其冠心病发病率和死亡率比其它西方国家如英国人和美国人要低得多。进一步调查表明，与其他国家相比，法国人喝葡萄酒比其他国家多- “法兰西悖论” 。,植物多酚的循环伏安行为,34,植物多酚中的黄酮一般由3个环构成:A环、B环(连接有羟基)和C环(含氧碳环)构成。,35,类黄酮类化合物其结构如卜所示。它们的衍生物很多，其生物没有活性的核心是抗氧化作用。抗氧化作用本质是基于氧化还原反应，利用电化学对其进行电化学表征，并建立电化学行为与抗氧化、抗癌作用的关联关系具有重要的意义。,36,芦丁的循环伏安行为,芦丁(Rutin）是一种多轻基黄酮类化合物，存在于多种植物的茎和叶中，是一些中草药的有

14、效成分。在临床上它可用于治疗过敏性紫瘫及各种因毛细管脆性增加而引起的出血性疾病和冠状动脉高血压病 等。,37,芦丁的循环伏安表征,B-R缓冲溶液(pH=3.10)中，在 玻碳电极上用循环伏安法可得到芦丁的一对氧化还原峰：EPc=0.405V，EPa= 0.467V (v.s. SCE)E=62mV(v.s. SCE)IPa/ IPc=1:1.23,结论：电极反应为一准可逆过程,38,扫速的影响还原峰峰电位E0/随扫速的增大而负移，氧化峰正移。富集时间短，富集时间较短时，峰电流iPc与v1/2呈线性关系，而与v则成偏离直线向下弯曲，表明电极过程主要受扩散速率控制;富集时间较长时，氧化峰和还原峰峰

15、电流ip与v呈线性关系，峰电流iPc与v 呈线性关系，而与v1/2则成偏离直线向上弯曲，表明电极过程主要受动力学反应速率控制。,39,H值的影响pH = 1.847.95的B-R缓冲溶液，Rt在玻碳电极上的峰电位随溶液pH值的增加而负移，说明Rt的电化学反应有质子参与。取氧化峰和还原峰的平均峰电位为式量电位E0/，对pH作图得一直线。线性回归方程为E0/=0.617-0.058pH (r= 0.9997)。,40,由W1/2= 62.5/n(1-)mV得，（1-)n= 1.1，若= 0. 45，则n=2，同时计算出参与反应的质子数为2。 说明在玻碳电极上，在实验条件下，芦丁氧化还原为两电子、两

16、质子准可逆吸附波。,41,槲皮素的循环伏安表征,槲皮素(Quercetin)是人类饮食中最丰富的黄酮类化合物。槲皮素具有很强的抗氧化性,能够消除体内过剩的超氧自由基,使DNA和细胞免受氧化损伤,具有抗肿瘤、抗炎、抗衰老等广泛的药理作用。,42,第一次循环在0.50V、0.62V、0.72V呈现三个氧化峰峰1、峰2和峰3，反扫时0.47V和0.18 V呈现两个对应的还原峰峰4和峰5。氧化峰1的峰形最好、峰电流最大，是槲皮素的主氧化峰。峰4是一个复合峰，与峰1和峰2对应。,43,扫描速度的影响主氧化峰电位随着扫描速度增大而正移，峰电流ip也随之增大,得到拟合曲线方程为：ip=-0.7716+1.5

17、72v-1/2+0.176v。这种关系既不同于浓差控制的ipv-1/2,也不同于吸附态反ipv。扩散及吸附控制的过程。利用E关系求出现n。,44,在酸性较强的条件下(pH=1.81)，槲皮素主氧化峰的峰形较好、峰电流也较大。主氧化峰电位随溶液pH值的增加而负移，说明主氧化反应有质子参与。以峰电位E对pH值作图得一直线,其线性回归方程为E=0.6243-0.0545pH (r=0.9936)，其斜率表明有等数量的电子和质子参与反应,印证了前述的反应式。,45,氧化还原为两电子、两质子准可逆吸附波。参与氧化反应的既有吸附态的反应物,又有溶液相中的反应物。,46,灯盏花素在多壁碳纳米管修饰玻碳电极上

18、的电化学行为,灯盏花素（Breviscapine ）是从一种灯盏细辛中提取的以灯盏花乙素为主的黄酮类成分1。药理研究表明，灯盏花素具有扩张脑血管的作用，能降低脑血管阻力，增加脑血流量，改善微循环，抗血小板凝聚、抗氧自由基等作用。,47,灯盏花素在裸GCE上没有发现明显的氧化还原峰，灯盏花素在MWNT/GCE电极上出现一对氧化还原峰，Epa=0.19 V，Epc=0.07 V，E=0.12V，ipa=11.7 A，ipc=8.16 A，ipa/ipc1.43。准可逆过程。,48,扫速在0.040.10 V/s，氧化峰电流Ipa和还原峰电流Ipc与扫速的关系式为 Ipa=63.19-0.5005

19、(r=0.9996)， Ipc=43.181+0.3141 (r=0.9953) 说明此时灯盏花素在玻碳电极表面上的电极反应过程是受吸附控制。,扫速对电极过程的影响,49,当扫速在0.100.50 V/s时，无论是氧化峰电流Ipa还是还原峰电流Ipc与扫速的平方根成正比，其关系式为Ipa= 44.2061/2-7.7125 (r =0.9974)， Ipc= 19.0121/2+1.3177 (r =0.9986)， 说明此时灯盏花素在玻碳电极表面上的电极反应过程是扩散控制。,电极反应的电子数可由式 IP=nFQ/4RT求得。其中Q= nFATT为循环伏安单一过程的峰面积(以电量计)，当扫速=

20、0.15 V/s时的氧化峰求得电极反应电子数n=1.22约为1。,50,H = 2.777.65的PBS缓冲溶液，灯盏花素在电极上的峰电位随溶液pH值的增加而负移，说明灯盏花素的电化学反应有质子参与。取氧化峰和还原峰的平均峰电位为式量电位E0/，对pH作图得一直线。线性回归方程为E0/=0.725-0.032pH (r= 0.9993) 。结论：在研究条件下，灯盏花素的电化学氧化反应为一个质子一个电子的反应。,H的影响,51,1.6 循环伏安分析的应用,1.6 .1 小分子与大分子相互作用的电化学研究,1.6.2 植物多酚抗氧化活性的电化学氧化机理研究,1.6 .0 电极反应机理研究,52,1

21、.6 .0 电极反应机理研究,对氨基苯酚的循环伏安图,53,54,55,56,小分子生物活性物质与DNA相互作用是生物化学研究中的前沿领域之一，研究DNA与小分子之间的相互作用有助于深刻理解DNA与识别分子的反应机理以及DNA与药物分子的作用机理，对了解药物的作用机理，进而通过分子设计寻找有效的治疗药物等均具有重要意义。,DNA和其他分子的相互作用主要有3种模式: 非共价结合、共价结合和剪切作用; 而非共价结合包括静电作用、嵌入作用、沟槽作用。,1.6.1 小分子与大分子相互作用的电化学研究,57,DNA与小分子的相互作用,研究表明，DNA是药物小分子（抗癌药物、金属配合物、有机染料分子等）的

22、作用靶点。,58,(1)静电结合，分子通过非特异性的相互作用结合于带负电荷的DNA双螺旋外部磷酸残基，没有选择性，通常认为这种作用模式作为药物应用上价值不大。,59,(2)沟槽结合，即靶向分子与DNA的大沟或小沟的碱基对边缘直接发生相互作用。大分子蛋白质结合于DNA的大沟槽中，而大多数小分子则是在小沟槽区作用。,60,(3)嵌插结合，即在碱基对之间嵌入几乎平面的芳香环。嵌插结合的作用力来自芳环的离域P体系与碱基的P体系之间的P-P相互作用及疏水相互作用。是药物与DNA作用的最重要的形式之一。,61,凝胶电泳、印迹技术、紫外-可见光谱、荧光光谱、原子力显微镜等已广泛应用于这项研究。电化学方法越来

23、越多地用于研究电氧化还原物质如抗癌物质与DNA的相互作用。 根据电化学方法CV峰电位的位移可判断药物分子与DNA相作用模式。并计算出电化学方法可计算出复合物的结合比和结合常数。,研究方法,62,铂类抗癌药物与DNA相互作用电化学研究,铂类抗癌药物,铂类药物是疗效最好的抗肿瘤药物之一，其发展经过了三代，典型代表为顺铂、卡铂、奥沙利铂。,顺铂,卡铂,奥沙利铂,63,实验内容,制备多壁碳纳米管修饰电极。采用线性扫描循环伏安法研究顺铂、奥沙利铂、卡铂在多壁碳纳米管修饰电极上的电化学行为，建立电化学测定方法。探寻三种铂类药物与DNA的相互作用方式，测定结合数、结合常数等。,64,多壁碳纳米管（MWNT）

24、修饰玻碳电极（MWNT/GCE）,65,No. 9,支持电解质的选择,顺铂在KCl缓冲溶液中有一对明显的氧化还原峰，峰形好。 顺铂在多壁碳纳米管修饰电极上的峰电流明显高于在裸电极上的峰电流。,结果与讨论,(1)cDDPMWCNTs/GCE; (2)cDDPGCE; (3)空白值,66,No. 12,扫速的影响,图2. 顺铂在不同扫速下的CV图,随着扫速的增加，峰电流升高，氧化峰电位正移，还原峰电位负移。,67,No. 13,扫速在0.040.10 V/s范围内，氧化反应的电极过程为扩散控制，还原反应的电极过程为吸附控制。,图 3. 顺铂氧化峰电流与扫速的关系,图 4. 顺铂还原峰电流与扫速的关

25、系,68,No. 15,电子转移数的测定,顺铂的峰电流与扫速有线性关系，根据Laviron理论：,无需知道电极吸附量及电极面积的绝对值，只需测得某扫描速度下CV图上的峰面即可求得n 。最后测得顺铂的电子转移数为2。,为循环伏安单一过程的峰面积(以电量计),69,No. 16,电子转移系数的测定,转移系数是电极反应能量势垒对称性的量度，也是动力学参数之一，对于准可逆反应，有如下关系式：,其中R为摩尔集体常数，T为298K，F为法拉第常数，k为常数，n为电子转移数。已知n，根据ln与Epa线性关系斜率可以解出= 0.331。,70,表观电子传递速率常数(ks)的测定,表观电子传递速率常数可根据下式

26、计算：,分别计算扫速为0.050.09 V/s时的速率常数(ks)，得到平均值为0.112 s-1。,71,顺铂与DNA相互作用,顺铂中加入DNA后，氧化峰电位正移，还原峰电位负移，峰高降低，且随着DNA浓度的增大，这种变化越明显。 峰电位外移，峰高下降,1.cDDP;2.cDDP + 0.02 mg/mL DNA; 3. cDDP + 0.03 mg/mL DNA,72,dsDNA、ssDNA分别和顺铂相互作用的对比研究,dsDNA（双链）、ssDNA（单链）均能够使顺铂的氧化峰电位正移、还原峰电位负移，峰高降低。但dsDNA使峰高降低、峰电位位移更明显，表明顺铂与dsDNA的相互作用强于s

27、sDNA。,A.氧化峰；B.还原峰.(1)cDDP; (2)cDDP + 0.2 mg/mL ssDNA; (3)cDDP + 0.2 mg/mL dsDNA.,73,顺铂与DNA相互作用的紫外吸收光谱,顺铂在220600 nm吸收波长范围内没有吸收峰，DNA在260 nm处有一个特征吸收峰。顺铂和DNA作用后，DNA在260 nm处的吸收峰降低，且发生了红移现象。随着顺铂浓度的增加，DNA特征吸收峰的减色效应越明显。,(1)1.510-5 mol/L cDDP；(2)0.03 mg/mL DNA；(3)1.510-5 mol/L cDDP +0.03 mg/mL DNA；(4)2.010-5

28、 mol/L cDDP +0.03 mg/mL DNA；(5)6.510-5 mol/L cDDP +0.03 mg/mL DNA.,74,顺铂与DNA相互作用方式,根据参考文献，峰电位外移，峰高下降，表明了顺铂和DNA发生的是嵌插结合的作用方式，紫外吸收光谱实验验证了嵌插方式。 嵌插结合：即药物分子几乎平面的嵌入DNA双螺旋结构的碱基对之间。,75,相互作用前后电化学参数对比,cDDP、L-OHP、CBP与DNA相互作用前后电化学参数对比,从表可以看出，顺铂、奥沙利铂、卡铂与DNA作用后, 电化学参数降低，表明形成的复合物是非电活性的，进一步说明了三种铂类药物与DNA存在嵌插结合。,76,相

29、互作用的结合常数和结合数m,结合常数()和结合数(m)表观DNA与小分子结合的能力，假定DNA和顺铂只形成一种简单的复合物DNAcDDP，其结合反应： DNA + mcDDPDNAcDDPm,DNA= DNA0- DNAcDDPm,77,结合数m和结合常数,结合数和结合常数的测定参考文献*方法，分别计算得到顺铂、奥沙利铂、卡铂的结合数、结合常数,表 4 结合数和结合常数,顺铂明显高于奥沙利铂、卡铂,*Feng Qu, Nan-Qiang Li, Yu-Yang Jiang. Electrochemical studies of NiTMpyP and interaction with DNAJ

30、. Talanta, 1998, 45(5):787793.。,78,（1）植物多酚与DNA的相互作用,植物多酚(plant polyphenol)是一类广泛存在于植物体内的多酚类物质，其作为一类具有生物活性的大然化合物，其生理活性的研究是近年来研究的热点之一。,79,近年来研究发现多酚类化合物具有潜在的抗癌、抗肿瘤药物活性，多酚类化合物与DNA相互作用受到人们的关注。 已有的研究表明：不同的植物多酚可与多种方式与 DNA相互作用，具有多样性的特点，如芦丁与DNA形成一种非电活性化合物。槲皮素与DNA的作用模式是静电模式，葛根素通过沟槽结合，而苏木素、大黄素、桑色素是嵌插作用。,80,阿魏酸

31、(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，Ferulic acid )是种植物多酚，普遍存在于中药材中，具有抑制血小板聚集、抗血栓形成、抗氧化和自由基、调节免疫功能、利肝保湿等药理作用。近年来，有关阿魏酸及其衍生物抑制DNA氧化损伤，以及结肠癌、直肠癌和舌癌的报道在增加。,阿魏酸与DNA相互作用的光谱电化学研究,81,本文利用多壁碳纳米管（MWNT）修饰玻碳电极（MWNT/GCE）研究了阿魏酸与DNA的相互作用，对二者之间的作用机理进行研究，为深入了解阿魏酸类药物的生物活性进一步提供实验依据。,82,方法 三电极体系：工作电极为多壁碳纳米管（MWNT）修饰玻碳电极（MWNT/GCE），参比电极为饱和甘汞电

32、极（SCE），对电极为铂电极。 多壁碳纳米管使用前先功能化处理。 分析方法采用循环伏安法（CV）以及紫外可见光谱法。,83,2.1阿魏酸电化学行为,2. 结果与讨论,（1）阿魏酸电极过程为准可逆,（2）当扫速在0.040.10Vs-1时，氧化峰电流ipa与还原峰电流ipc与扫速的平方根成正比 ipa=23.375v1/2-3.8037 (r=0.9995)， ipc=38.262v1/2-5.4196 (r=0.9996)，阿魏酸电极反应过程是扩散控制。,84,2. 结果与讨论,（2）当扫速v在0.100.40 Vs-1，氧化峰电流ipa和还原峰电流ipc与扫速的一次方成正比 ipa=25.4

33、78 v+2.3722 (r=0.9984) ipc= 42.628 v+2.1097 (r = 0.9990) 此时阿魏酸电极反应过程是受吸附控制。,（3）电子转移数 根据Laviron理论，物质在电极上的过程为准可逆过程时：,85,当扫速v在0.040.10 Vs-1，氧化峰电流ipa和还原峰电流ipc与扫速的一次方成正比，说明此时灯盏花素在玻碳电极表面上的电极反应过程是受吸附控制。,86,2.2DNA和阿魏酸相互作用的电化学行为,（1）阿魏酸中加入DNA溶液后，Ep正移，峰电流ip显著下降，表明阿魏酸与DNA相互作用时形成电活性较低的复合物。,（2）氧化峰电位正移（），还原峰负移，峰电流

34、下降，可推测阿魏酸与DNA相互作用以嵌插作用为主。,87,dsDNA（双链）和ssDNA（单链）均使阿魏酸的峰电流降低。但dsDNA氧化峰电位正移明显高于ssDNA，峰电流降低更明显。 这是因为阿魏酸可以平面芳香环可嵌插到dsDNA的双螺旋结构中，电活性降低，而ssDNA不具备双螺旋结构，其峰电流降低和氧化峰电位正移的原因可能是静电作用所致。,88,在加入dsDNA后, 阿魏酸在310 nm的吸收峰降低，呈减色效应，且出现两个等电吸收点。减色效应，两个等电吸收点是嵌插作用的结果。吸收光谱进一步说明阿魏酸与DNA的相互作用以嵌插作用为主。,89,Laviron理论,相互作用电子转移系数和表观电子

35、传递速率常数ks,表观电子传递速率常数ks可由下式求算,90,阿魏酸与dsDNA作用后, 、ks值有所下降，说明阿魏酸与DNA的复合物是非电活性的。,91,92,阿魏酸和DNA之间由于阿魏酸嵌入DNA碱基对间形成DNA-阿魏酸的简单缔合物，即1mol DNA碱基对结合了1mol的阿魏酸分子，结合常数=1.01104。 结果电活性点被屏蔽，电子转移和传递能力降低。,93,小分子生物活性物质与DNA相互作用是生物化学研究中的前沿领域之一，研究DNA与小分子之间的相互作用有助于深刻理解DNA与识别分子的反应机理以及DNA与药物分子的作用机理，对了解药物的作用机理，进而通过分子设计寻找有效的治疗药物等

36、均具有重要意义。,DNA和其他分子的相互作用主要有3种模式: 非共价结合、共价结合和剪切作用; 而非共价结合包括静电作用、嵌入作用、沟槽作用。,1.6.2 植物多酚抗氧化活性的电化学氧化机理研究,94,万病之源-氧自由基氧化损伤,自由基与疾病自由基与免疫自由基与衰老自由基与营养,95,从民族药中寻找抗氧化成分是当前研究的热点,本实验对近20种民族药进行研究，发现其中11种具有良好的抗氧化活性。,研究发现植物多酚是民族药抗氧化活性的重要成分,96,电化学研究方法在抗氧化研究中具有明显优势-氧化损伤和抗氧化作用本质是电子传递与转移过程。电化学方法能获得更多的微观信息。,97,以民族药诃子的几种多酚

37、化合物为研究对象。,98,研究方法 循环伏安法（CV） 与DPPH清除为对照 工作电极的制备 以环氧树脂为粘合剂，截取6 cm左右石墨棒，将其密封于适当长度的聚乙烯管中，一端伸出管外用作电极接线，另一端在不同粒径的金相砂纸（由粗到细）上打磨成镜面，冲洗干净备用，实验室将其置于底液中循环至稳定。,99,研究结果 优化了电化学测定条件，获得了灵敏的CV信号。,100,获得了动力学参数的测定和电极参数：主要是电子转移数和质子转移数,扫速为0.07 V/s时，没食子酸、咖啡酸、阿魏酸和香草酸的电子转移数n分别为3.01、1.98、1.31和1.29,101,获得了动力学参数的测定和电极参数：主要是电子

38、转移数和质子转移数,102,推导了植物多酚的电化学氧化机理,103,获得了电化学反应的特征,104,氧化峰电位：没食子酸（Epa = 0.48 V） 咖啡酸（ Epa = 0.51 V） 阿魏酸（ Epa = 0.60 V） 香草酸（ Epa = 0.48 V） 对香豆酸（Epa = 0.84 V）。,利用氧化峰电位评价抗氧化活性,结论：抗氧化能力（清除自由基）与其氧化电位(Epa)的高低一致，电位低能力强,105,1.7 线性扫描伏安法,1.7 .1 线性扫描伏安法,1.7.2 脉冲伏安法,106,*线性扫描伏安法,线性扫描伏安法在电极上施加一个线性变化的电压, 即电极电位是随外加电压线性变

39、化，记录工作电极上的电解电流的方法。记录的电流随电极电位变化的曲线称为线性扫描伏安图。 线性扫描伏安法一般用于定量分析，而循环伏安法则用于电极过程的定性、机理研究。,107,线性扫描伏安法-定量分析,单扫描极谱图,定量依据 Randles-Savcik方程,108,线性扫描伏安法直接测定苯酚,109,线性扫描伏安法测定胶囊中褪黑素的含量,110,林丹的电化学性质及线性扫描伏安法测定,H=9的硼砂-氢氧化钠缓冲溶液中,111,1.7.2 脉冲伏安法,脉冲伏安法（PV，Pulsed Voltammetry） 为克服毛细管噪声， Barker 于 1960 年提出了脉冲伏安法。通过在给定的直流电压或

40、线性增加的直流电压上叠加振幅逐渐增加或等振幅的脉冲电压，并在每个脉冲后期记录电解电流所得到的曲线，称为脉冲伏安法。 按施加脉冲电压和记录电解电流方式的不同，可分为常规脉冲伏安法和微分 (示差，差分) 脉冲伏安法（DPV, Differential pulse voltammetry ）。,112,PV两种激励方式 （1）恒定电压+振幅渐次增加矩形脉冲（2）线性增加的直流电压+等振幅的脉冲电压（微分 (示差，差分) 脉冲伏安，DPV）,113,PV电压扫描方式：恒定电压+幅渐次增加矩形脉冲 振幅增加速率为 0.1V/min， 描范围在02V，宽度40-60ms。DPV 微分 (示差，差分) 脉冲

41、伏安电压扫描方式：线性增加电压+恒定振幅矩形脉冲 振幅恒定于5 100mV内某一电压 脉冲宽 度40 80ms。,114,电容电流又称充电电流，来自电极与溶液的两相界面之间存在着相当于电容作用的双电层，产生噪声电流。极谱分析充电电流的大小为10-7A数量级 这与10-5mol/L物质所产的扩散电流相当，这已足以起较大的测量误差。所以电容电流的存在是提高极谱分析灵敏度的一个主要障碍。,目的消除电容电流,115,脉冲伏安法,每个脉冲后20ms， 电容电流趋于零，此时噪声小。规脉冲伏安法的灵敏度是线性伏安的7倍，因为消除电容电流，降低基线。,116,微分脉冲伏安法曲线,差分脉冲伏安法的电势波形是线性

42、增加的电压与恒定振幅的矩形脉冲的叠加。脉冲波形脉冲高度|E|是固定的，典型值为50/n mV。脉冲宽度比其周期要短得多，一般取40-80ms。在对体系施加脉冲前20ms和脉冲期后20ms测量电流，将些两次电流相减，并输出这一个周期中的电解电流i。并用i对电势E作图，即得差分脉冲曲线。,117,微分脉冲伏安法（ DPV ）曲线,在脉冲施加前20ms,只有电容电流iC；在脉冲期后20ms, 所测电流为电解电流和电容电流的和， DPV是两次电流相减的到i，因此杂质的氧化还原电流导致的背景电流也被大大的扣除了，因而具有更高的检测灵敏度和更低的检出限，使其能够应用于浓度低至10-8mol/L(约1g/L

43、)的场合。,118,DPV理论基础,两次所测电流相减，得到i，通过即：。,因此，i与所测物质浓度成正比，这就是定量分析的基础。其中：tm为每个周期内从开始施加脉冲到进行电流采样所经历的时间。,119,DPV理论基础,当扩散电流等于极限扩散电流的一半时所对应的电位，称为半波电位(E1/2)。当溶液的组分和温度一定时，每种电活性物质的半波电位是一定的，不随其浓度的变化而改变。而其峰电位：,由Ep即可得到半波电位。这就是定性分析的依据。,120,脉冲极谱法的优点灵敏度高。由于背景电流得以充分衰减，可以将衰减了的法拉第电流if充分地放大，因此能达到很高的灵敏度.分辨能力高,可同时进行多元素，多物质的测

44、定。可大大地降低空白值。由于脉冲持续时间长，在保证ic和充分衰减的前提下，可以允许R增大10倍或更大些，这样只需使用0.01-0.1mol/L的支持电解质即可。仪器价格低廉，检测物用量少。,121,微分脉冲伏安法,微分脉冲伏安技术是目前所有伏安技术中最灵敏的方法。在2004年5月1日实施的国家标准GB/T 146662003 分析化学术语中，将微分脉冲伏安技术列为分析化学术语国家标准。 应用领域：卫生防疫、环境监测、矿物冶金、化妆与洗涤剂、生物和药物、人体血液及其他生物液体（尿液）中的微量元素及痕量元素等。,122,微分脉冲伏安法曲线,在施加脉冲前20ms（只有电容电流ic）和脉冲期后20ms

45、（电容电流ic+电解电流），将些两次电流相减得到电解电流 i。 在未达分解电流之前和达极限电流之后，i都很小，而在直流极谱曲线陡峭部分(1/2 附近)时，i 很大，最终形成峰形曲线。,123,微分脉冲伏安法应用-芦丁测定,芦丁在电位-0.25V、-0.79V、-1.34V有三个与浓度相关的还原电流峰，其中-1. 34V峰电位处的峰电流与芦丁的浓度呈良好的线性关系。,124,水飞蓟宾在-0.83 V、-1.17V有两个还原电流峰，-1.17V峰电位水飞蓟宾浓度与峰电流成线性关系，回归方程:Y=-2.75+0.00498C r=0.9975,水飞蓟宾测定,125,葛根素在一0.79V、-1.12V

46、、-1.324V有三个还原电流峰，-1.324V峰电位，葛根素的浓度与峰电流成线性关系，回归方程:Y二-6.4810-5+0.0079C r=0.9827,葛根素测定,126,黄芩苷测定,127,顺铂差分脉冲伏安法测定,图5. 顺铂的DPV图,图6.顺铂浓度与氧化峰电流的关系,顺铂的氧化峰电流随其浓度变化呈现线性关系 ，（浓度变化范围：6.510-53.010-4 mol/L），检出限为3.510-5 mol/L，可用于顺铂含量的分析测定。,128,顺铂差分脉冲伏安法测定,取市售的顺铂注射液3组，分别取一定量用0.05 mol/L KCl缓冲溶液定容至10mL，摇匀，再取一定量进行DPV测定，用标准曲线法计算顺铂含量（每个样品含量均为10次测定平均值），并进行样品回收测定，结果见表。,129,三 方波极谱,方波极谱是交流极谱方法的一种，它是在向电解池施加直流电压的同时，在叠加一个每秒225周的振幅很小的交流方波形电压。利用方波电压通过电解池产生的电容电流随时间而衰减特性，及在特定的时刻，方波电位所引起的电流突变来提高分析的灵敏度、分辨率与准确度。,130,