单克隆抗体技术课件.ppt

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1、单克隆抗体技术,提纲,单克隆抗体的概念单克隆抗体的制备单克隆抗体的应用,1975年英国科学家将产生抗体的B淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。 每个B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大量单克隆抗体。 单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。,单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）,通过B细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体。细胞克隆：由一个细胞

2、增殖而成的细胞集团。,B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。,杂交瘤技术,通过融合经免疫的小鼠脾细胞和建系小鼠骨髓瘤细胞，以获得同时具有抗体分泌功能和保持细胞永生性特征的杂交瘤细胞克隆。是获取单克隆抗体的主要技术途径。,单克隆抗体制备原理,用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT

3、-）或胸腺嘧啶核苷酸酶（TK-）的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合。采用HAT选择性培养基对融合细胞进行培养和筛选。HAT选择性培养基：培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷Thymidine T。,单克隆抗体制备原理,-,-,-,-,-,单克隆抗体的制备步骤,1. 免疫原的制备 颗粒性抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白质等 分子量大于5000Da生物物质。 可溶性抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于 5000 Da 物质。 可溶性抗原需与BSA、OA等载体交联后成颗粒性抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体。,2. 免疫动物,

4、可溶性抗原（蛋白质） 以1mg/ml5mgml的溶液加等量的弗氏完全佐剂乳化，分多点小鼠皮下注射，总量为0.3ml0.6ml，间隔周再同样注射一次，10天后，断尾取血一滴，测抗体效价，选滴度高的小鼠做融合试验。一个月后可以经静脉（尾静脉）给予无佐剂抗原0.2ml0.4ml，天后，杀死小鼠取脾做融合用。颗粒性抗原 如抗原来源方便，可以不加佐剂而增加免疫次数，缩短间隔时间。例如用羊红血球免疫小白鼠，以浓度每只皮下注射.ml，每周次，共免疫次，取脾前天，再免疫一次即可。,为什么要反复注射抗原？,正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞，一只纯种小白鼠估计能产生1.01075.0107种不同的抗

5、体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤融合，只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到某种杂交瘤的机会，必须加强免疫，使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加。,3. 骨髓瘤细胞的准备,细胞株处于良好的生长状态，本身不 能分泌任何抗体或免疫球蛋白； 瘤细胞的来源应与制备脾细胞小鼠为同 一品系，以便两者组织相容性抗原一致； 细胞株保持HGPRT缺陷状态或TK缺陷状态。,4. 细胞融合,取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按5-10：1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50% PEG作为融合剂，在37下水浴下加入0.5-0

6、.7ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37，5%CO2的细胞培养器皿中培养。,在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。,许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹

7、腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。,细胞融合方式,物理融合法： 电融合、激光融合 化学融合法 ：PEG融合 生物融合法 ：仙台病毒,5. 杂交瘤细胞及阳性孔的筛选,细胞培养器皿中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HAT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获50多个对上述抗原有反应的阳性孔。,6.阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆,经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体

8、。 克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。,阳性孔的检测,7. 单克隆抗体的制取,制取方式：体外培养罐法体内腹腔接种纯化：盐析、层析、制备型HPLC鉴定：特征鉴定Ig类型、亲和力、效价、特异性决定簇鉴定是否针对同一决定簇,杂交瘤细胞的冻存,当获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，必须将一部分杂交瘤细胞保存，否则在连续传代的过程中，可能产生突变或染色体的漂移以至丧失固有特性或丢失产生抗体的特性。另外在长期的培养过程中，难免不发生污染以至于毁灭。所以必须冷藏保存一部分。,单克隆抗体的特性, 单一特异性，与一个抗原决定簇反应； 可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂； 一经制出，可无限量地供应； 生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原； 能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。,四、单克隆抗体靶向技术与靶向单抗应用,单克隆抗体靶向制剂利用抗体的特异性，将药物连接到抗体上，在特定的部位发挥作用的制剂。,应用：特异性溶解血栓药物抗肿瘤药物其它药物,