色谱分析检测技术 GC要点课件.ppt

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1、生物活性物质分析检测技术,色谱分析检测技术 Chromatography,胡蒋宁,色谱的基本概念,气相色谱,提纲,液相色谱,1. 色谱法概述,重现,1903年俄罗斯植物学家Tsweet茨维特,植物提取液CaCO3玻璃柱石油醚淋洗,色谱,创建,石油醚,流动相石油醚固定相 CaCO3,两相,本质：混合物分离,色谱法分离过程,色谱分离法的原理？,迁移,t,s,1941 Martin和Synge提出液-液色谱理论；,1952 James和Martin发展了气相色谱；,1956 Van Deemter提出速率理论；,1967 Kirkland等研制高效液相色谱法；,2. 分类,色谱流出曲线示意图,Wb,

2、W1/2,1/2h,0.607h,3. 基本概念与术语,1、色谱流出曲线 （chromatogram）指样品注入色谱柱后，信号随时间变化的曲线。,2、常用术语,（1）基线无组分通过色谱柱时，检测器的噪音随时间变化的曲线。,（2）峰宽峰底宽Wb 峰半宽W1/2标准偏差,色谱参数示意图,1/2h,0.607h,W1/2,Wb,tR,t0,（3）保留值保留时间tR进样到出现色谱峰的时间保留体积VR进样到出现色谱峰时消耗的流动相体积死时间t0流动相流过色谱柱的时间死体积V0色谱柱的空隙体积,F流动相流动线速度,（4）相对保留值,（5）分配系数和分配比（容量因子）,分配系数：一定温度与压力下两相达平衡后

3、，组分在固定相和流动相浓度的比值,分配比（容量因子）：一定温度与压力下两相达平衡后，组分在固定相和流动相量的比值,固定相重量流动相重量,K与k的关系：,（6）容量因子k与保留值的关系,4. 分离效能指标,1、选择性（相对保留值）,相对保留值由两组分的热力学性质决定，与色谱柱的长短粗细无关。,2、峰宽度,3、分离度,分离度考虑了保留时间和峰宽度，是一个综合指标：,R 1.0两峰明显重叠R = 1.0两峰达97.7%分离R 1.5两峰完全分开,第二节色谱理论,一、塔板理论 (马丁， 1904),目的从理论上得到描述色谱流出曲线的方程，并通过这一方程各参数来研究影响分离的因素。,假设（1）色谱柱存在

4、多级塔板;（2）组分通过时在每级塔板两相间达到一次平衡;,neff 与 n 的关系：,二、速率理论,1、塔板理论的不足塔板理论虽然指出了理论板数n或理论板高度H对色谱柱效率的影响，但是没有指出影响塔板高度的因素，因此无法在理论指导下从实验上提高色谱柱的效率。,2、Van Deemter方程1956年Van Deemter提出速率方程，指出了提高柱效率的途径：,涡流扩散示意图,式中： r弯曲因子，填充柱 r 1 空心柱r = 1 Dm组分在流动相中的扩散系数,由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，因此在液相色谱中B可以忽略。,（3）Cu传质阻力项指组分在流动相和固定相之间传质的阻力,

5、固定相传质阻力流动相传质阻力,q 和 为与两相的构型和性质有关的常数dp 和 df 为固定相颗粒直径和固定液膜的厚度,问题：1、怎样装柱才能使色谱柱的效率提高？ 提高柱效，与柱的种类（毛细管柱还是填充柱）、柱的填充均匀性、载体的颗粒度、载气的种类和相对分子量质量、固定液、也莫得涂覆厚度也和均匀度、柱温等多种因素有关。,2、空心柱是否能够用于色谱分离？,3、如何获得色谱最佳流速？,u 在上述方程各项中存在矛盾，因此，应求出最佳值：,H-u曲线,GC: H= A + B/u +C. u,HPLC: H= A + C. u,3、影响谱带展宽的其它因素柱前展宽、柱后展宽、柱外效应,速率理论研究的是柱内

6、峰展宽因素，实际在柱外还存在引起峰展宽的因素，即柱外效应（色谱峰在柱外死空间里的扩展效应）。色谱峰展宽的总方差等于各方差之和，即：22柱内2柱外2其它柱外效应主要由低劣的进样技术、从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起。为了减少柱外效应，首先应尽可能减少柱外死体积，如使用零死体积接头连接各部件，管道对接宜呈流线形，检测器的内腔体积应尽可能小。,三、分离条件的选择综合塔板理论和速率理论，可获得影响色谱分离效率的因素：,从式中看出，可以通过提高塔板数n，增加选择性r2,1、容量因子k来改善分离度。增加柱长、制备性能优良的色谱柱可以提高n值；改变固定相，使得各组分的分配系数有较大差别，

7、可以增加r2,1；改变柱温可以使得k改变。,色谱的基本概念,气相色谱,液相色谱,提纲,气相色谱法特点,1. 选择性高，能分离分析极性极为接近的物质。2. 灵敏度高 可以分析10-1110-13g的物质，非常适合于微量和痕量分析；3.分离效能高；能短时间分析复杂的混合物4. 分析速度快 一般只需几分钟到几十分钟便可以完成一个分析周期5.应用范围较广 可以分析气体、易挥发液体和可衍生为易挥发的固体物质,一、气相色谱仪,载气系统,进样系统,色谱柱,检测器,记录系统,1、载气系统载气由压缩气体钢瓶供给，经减压阀、稳压阀控制压强和流速，净化器净化，试样从进样器注入到气化室后，立即气化并被载气带入色谱柱进

8、行分离。分离后的组分依次进入检测器，产生的信号经放大后在记录仪上记录下来，得到色谱图。,常用的载气：氮气氢气氦气 氩气,气相色谱对载气的基本要求：（1）纯净通过活性炭或分子筛净化器，除去载气中的水分、氧等有害杂质。（2）稳定采用稳压阀或双气路方式：,气相色谱仪的流动相-载气,氦气（纯度99.99%以上）氮气（纯度99.99%以上）氩气（纯度99.99%以上）特殊分析使用氢气（纯度99.99%以上）注意安全,进样系统,将液体试样瞬间气化的装置对汽化室的要求是：（1）体积小；（2）热容量大；（3）对样品无催化作用,进样器,气化室,控制面板,Combi Pal 三合一装置,顶空加热装置,自动进样器,

9、利用被测样品（气-液和气-固）加热平衡后，取其挥发气体部分进入气相色谱仪分析。,静态顶空萃取,进样方式,固相微萃取,液体直接进样,载气入口,接色谱柱,散热片,加热块,汽化室示意图,热进样和冷进样,热进样分流/无分流进样直接进样（全量注入）宽口毛细柱和填充柱冷进样冷柱头进样PTV进样,歧视效应和热分解,热进样 (SPL, WBI)存在歧视现象和样品热分解冷进样 (OCI, PTV)进样是在较低温度下进行定量精度高歧视效应和热解效应的影响小,歧视效应的产生,歧视:蒸溜现象 形成气溶胶 分溜现象,低沸点组分百分比偏高,进针 退针,高沸点组分残留,进样体积越小，歧视现象越严重。,减小热进样歧视现象的方

10、法,快速进样法 溶剂冲洗法热针法,溶剂冲洗法,蒸溜和分溜减少,分流比常20:1,原因：柱容量小,分流技术,毛细管柱进样量必须极小（一般液样10-210-3微升，气样约1微升）,何时不用分流？,填充柱,毛细管柱(开管柱),色谱柱,3、分离系统,目前GC的主流,主要为开管柱 open tubular column,管内壁涂渍固定液，无载体空心管,主要特点,毛细管色谱柱的特点,（1）固体固定相：固体吸附剂包括活性碳、硅胶、Al2O3、分子筛等；用于H2、O2、N2、CO、CO2、C1-C4等气体分离；,固定相,担体选择：,（A）表面有微孔结构，孔径均匀，比表面积大。,（B）化学和物理惰性，即与样品组

11、分不起化学反应，无吸附作用或吸附力很弱。,（C）有一定的机械强度和浸润性，不易破碎。,应用最普遍的担体为硅藻土型载体。,（D）具有一定的粒度和规则的形状，最好是球形,固定液的要求：,（A）在使用温度下是液体，应具有较低的挥发性。,（B）良好的热稳定性。,（C）对要分离的各组分应具有合适的分配系数。,（D）化学稳定性好，不与样品组分、载气、载体发生任何化学反应。,固定液的分类：,（A）非极性固定液 常见的固定液有角鲨烷（异三十烷）、阿皮松等，适合非极性和弱极性化合物分析。 组分按照沸点由低到高顺序流出。,（B）中等极性固定液 常见的固定液有邻苯二甲酸二壬酯、聚酯等，适合弱极性和中等极性化合物分析

12、。组分基本上按照沸点顺序出峰，通沸点的非极性组分先出峰。,（C）强极性固定液 常见的固定液有氧二丙腈等。适合极性化合物分析。,（D）氢键型固定液 常用的固定液有聚乙二醇、三乙醇胺等，适用于分析含F、N、O等化合物。,固定液的选择： 依据极性原则,（A）按极性相似原则选择 如果固定液与待测组分的极性相似，则两者之间的作用力就强，待测组分在固定液中的溶解度就打，分配系数就大保留时间长，若分离极性和非极性混合物时，一般选用极性固定液，此时非极性组分先出峰。,（B）按官能团相似选择 若待测组分为酯类，则祖安用酯或聚酯类固定液；若待测组分为醇类，可选用聚乙二固定液。,（C）按主要差别选择 若待测组分之间

13、的沸点是主要差别，可选择非极性固定液；若极性是主要差别，则选用极性固定液。,在实际工作中遇到的样品往往是比较复杂的，所以固定液的选择要根据样品而定，一般依靠经验或参考文献，按照最接近的性质来选择。,进样量的改变对分离的影响,1,2,1,2,1,2,67ng 完全分离,335ng 峰分離但峰较宽,670ng 不完全分离,色谱柱 ： CBP1-M25-025柱 温 ： 50分流比 ： 1:30, ，二恶烷 醋酸丙脂,膜厚对毛细柱分离的影响,毛细柱的内径、膜厚及柱容量,出现鬼峰的原因,1. 进样口污染2. 载气含水分及它不纯物其3. 不锈钢管及阀污染4. 进样垫及橡胶垫圈污染5. 填料老化不足6.

14、填充剂劣化,色谱柱的老化,为什么必须进行色谱柱老化？新色谱柱含有溶剂和高沸点物质，所以基线不稳，出现鬼峰和噪声；旧柱长时间未用，也存在同样问题。一般 采用升温老化，即从室温程序升温到最高温度，并在高温段保持数小时。新柱老化时，最好不要连接检测器。每天都要进行老化吗？视仪器基线情况，确定是否需要老化以及老化时间。,色谱柱分离效率评价,色谱柱效率：峰尖评价：理论板高(HETP)、理论塔板数(N)对策：将Van Deemter 各因素优化选择性：峰的分离度评价：分离因子或分离度对策：选择极性相当的固定相峰的对称性：吸附现象评价：拖尾因子对策：色谱柱进一步老化,进样口、色谱柱、检测器的温度设定,进样口

15、温度考虑样品中各组分的沸点，设定温度使样品瞬间汽化。色谱柱温度考虑样品中各组分的沸点，及希望的分析周期，宽沸程样品应使用程序升温。检测器温度防止检测器污染，一般比色谱柱温度高20-30。DET.TINJ.TCOL.T+20,恒温和程序升温分析烃类化合物,5、检测器作用：将色谱分离后的各组分的量转变成可测量的电信号，然后纪录下来。,要求：灵敏度高线性范围宽响应速度快结构简单通用性强,常用检测器：热导检测器氢火焰离子化检测器电子捕获检测器,气相色谱的检测器,一、热导检测器(Thermal Conductivity Detector, TCD),热敏电阻不同气体的热扩散作用改变电阻， “万能”检测器

16、，但是灵敏度低， 常用于填充柱和浓度较大时,R1*R4=R2*R3恒定载气时，R1=R2 （R1+ R1 ）*R4=（R2+ R2）*R3样品经测量池，R1R2 （R1+ R1 ）*R4（R2+ R2）*R3,R1,R2,R4,R3,惠斯顿电桥,提高TCD的灵敏度，应注意事项：,TCD是基于不同物质具有不同的导热系数的原理制成的，载气与样品的导热系数相差越大，热导池的灵敏度就越高，由于一般物质导热系数较小，因此宜选用导热系数较大的气体如H2和He作为载气。导热池的灵敏度S与热敏元件的电阻R及其桥路电流I的关系为SI3 * R2。当一定时，增加桥路电流，灵敏度迅速增加；但电流太大，噪声增大，热丝

17、易烧断。一般桥路电流控制在。当桥路电流一定时，则热丝温度一定，若池体温度低，它和热丝的温差大，灵敏度提高；但池体温度不能太低，否则待测组分将在检测器内冷凝。一般池体温度应等于或高于柱温。,二、氢火焰离子化检测器Flame Ionization Detector (FID),原理,（1）检测含碳氢有机化合物更通用（2）无机气体、水、四氯化碳等含氢少或不含氢的物质灵敏度低或不响应,（1）含碳物质氢火焰中离子化（2）外电场作用形成电流, 与待测物质量正比,适用范围,氢火焰离子化检测器的特点：（1）灵敏度高，线性范围宽（比高1001000倍）（2）适于有机物的检测（3）样品被破坏，无法进行收集。（4）

18、不能检测惰性气体、空气、水、CO、CO2、NO、SO2等气体 （5）选择FID的操作条件时应注意所用气体流量和工作电压，一般N2和H2流速的最佳比为1:11.5:1，H2和空气的比例为1:10，极化电压为100-300V。离子化反应温度可达2000度。,卤素等含电负性的原子捕获电子生成稳定的负离子，并与载气正离结合，使基流信号下降，根据信号是否降低和降低程度，可检测组分。,放射源（-）,不锈钢棒（+）,放大与检测系统,电子俘获检测器的特点：（1）对卤素、硫、磷、氮、氧有很强的响应；（2）灵敏度高，可用于痕量农药残留物的分析；（3）线性范围较窄,4、火焰光度检测器（Flame Photometr

19、ic Detector，FPD）是一种对硫磷选择性的检测器，这两种元素燃烧中被激发，从而、发射特征的光信号：,载气+组分,H2,PMT,滤光片,1800-29000C,5、其它检测器（1）GC-MS（2）GC-FTIR,R 峰高mV面积A=（mV）2,Q浓度mg/ml，ml/ml质量 g/s,S浓度mV ml/mgA ml/mg质量mV s/gA s/g,6、检测器的性能指标（1）灵敏度（Sensitivity）指样品量变化引起信号变化的程度，程度越大灵敏度越高。,（2）检测限（Detection Limit）三倍噪音所相当的物质的量称为检测限,N为噪音，单位为mV,（3）线性范围（Linea

20、r range）指检测器信号与样品浓度（或量）之间成正比关系的范围。,气相色谱法的分析方法,定性分析,定量分析,确定每个色谱峰代表何种物质,利用气相色谱的检测信号峰高或峰面积，进行定量和半定量分析,纯标准样对照,文献值对照,仪器联用定性,色谱自身定性保留值,气相色谱定性分析,气相色谱定量分析,定量依据：组分含量与峰面积成正比,定量分析方法,归一化法定量,外标法定量,内标法定量,14-6 色谱定性和定量分析,13-7-1 定性分析,1.利用纯物质定性的方法 通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。,2.利

21、用相对保留值定性,相对保留值指组分与基准物的tR的比值，它仅与柱温和固定液性质有关，与其他操作条件无关。因此比保留值定性更方便、可靠。基准物：选取易得到纯品的，而且与被分析组分保留值相近的物质，如：正丁烷、正戊烷、环己烷、苯、对二甲苯、环己醇、环己酮等。 在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。,若未知样品较复杂，可将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。 注意：当进样量很低时，若峰不重合，峰中出现转折，或半峰宽变宽，则一般可肯定试样中不含有与所加已知纯物质相同的化合物。,3.加入已知物增加峰高法,4.保留指数定性法,柯瓦指数（Kovats）指数，用

22、I表示，表示物质在固定液上的保留行为，是目前使用最广泛并被国际公认的定性指标，具有重现性好，标准统一及温度系数小等优点。,测定方法： 将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100（如正己烷的保留指数为600）。 其它物质的保留指数（IX）是通过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有n和n1个碳原子。被测物质X的调整保留时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如图所示：,5.用经验规律和文献值定性,当没有待测组分纯标准样品时，可用文献值定性，或用气相色谱中的经验规律定性。,（1）碳数规律（同系物） 大量实验证明，一定温度下，同系物的 lgtR与分子中碳原子数称线性关系，即,（2）沸

23、点规律（同族同碳数异构体化合物）,6.双柱、多柱定性,对复杂样品，组分较多，在一根柱上可能出现两组分有相同的保留值，若使用双柱或多柱，则原来在一根柱上出现相同保留值的组分，在另一柱上就可能出现不同的保留值，从而实现定性。,7.与其他方法结合,小型化的台式色质谱联用仪（GC-MS；LC-MS） 色谱-红外光谱仪联用仪； 组分的结构鉴定,13-7-2 定量分析,定量分析依据：操作条件一定时，被测组分的质量（或浓度）与检测器给出的响应信号成正比，即,定量分析要解决三个问题： 准确测量检测器的响应信号 峰面积或峰高； 准确求得比例常数 校正因子； 正确选择合适的定量计算方法，将测得的峰面积或峰高换算为

24、 组分的百分含量。,（1）峰高（h）乘半峰宽（W 1/2）法： 近似将色谱峰当作等腰三角形。此法算出的面积是实际峰面积的0.94倍： A = 1.065 hW1/2（2）峰高乘平均峰宽法： 当峰形不对称时，可在峰高0.15和0.85处分别测定峰宽，由下式计算峰面积：（3）峰高表示峰面积：（4）自动积分和微机处理法,1. 峰面积的测量,痕量分析中，峰高法的准确度较高。峰面积法适用于各种形状的峰，精度较好。,2. 定量校正因子,试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即： m i = fi Ai 绝对校正因子：比例系数 f i ，单位面积对应的物质量： f i =m i / Ai 相对校正因子f i

25、 ：即组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比。,当mi、mS以摩尔为单位时，所得相对校正因子称为相对摩尔校正因子（f N）,用表示；当mi、mS用质量单位时, 以（f W）,表示。,fi测定方法： 只与被测物和基准物及检测器有关，与操作条件无关。一般可查文献获得，自己测定时，常用基准物质：热导检测器 苯， 氢焰检测器 正庚烷 测定时用色谱纯试剂。若无纯品，要确知该物质的百分含量。测定时先准确称量基准和待测物，然后混合进样，分别测A，按上式计算。,（1）归一化法,特点及要求： 归一化法简便、准确； 进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大； 仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。,

26、3. 常用的几种定量方法,试样中所有组分的含量之和按100%计算，以它们相应的色谱峰面积或峰高为定量参数。,（2）外标法,外标法也称为标准曲线法。,外标法不使用校正因子，准确性较高； 操作条件变化对结果准确性影响较大； 对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。,特点及要求：,（3）内标法,内标法是将一定量的纯物质作为内标物加入到准确称量的试样中，根据试样和内标物的质量以及被测组分和内标物的峰面积求出被测组分的含量。,内标物要满足以下要求： 试样中不含有该物质，与被测组分性质比较接近，不与试样发生化学反应； 出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响； 质量与被测物质接近，以保持色谱峰大小差不多。,内标法特点,准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大； ms/m比值恒定，进样量不必准确； 适宜于低含量组分的分析，且不受归一法使用上的局限。 缺点：每次分析要准确称量内标物和试样的质量，对分离度的要求增高。,气相色谱的应用举例,色谱的基本概念,气相色谱,提纲,液相色谱,高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography, HPLC,