策略研究基础课件.ppt

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1、蛋白质组学,1.前言、定义（燕萍）2.研究策略和基础（秀华）3.研究内容（结瓜）4.研究意义和背景（文娜）5.研究技术（丽明）6.双向电泳（铭杰）7.SDS-聚凝胶电泳技术（百忍）8.发展回顾（克标）,蛋白质组学,20世纪中期以来，随着DNA双螺旋结构的提出和蛋白质空间结构的X射线解析，开始了分子生物学时代，对遗传信息载体DNA和生命功能的主要体现者蛋白质的研究，成为生命科学研究的主要内容。在这样的形势下，科学家们认为，生命科学已经入了后基因组时代。,蛋白质组学历史,在后基因组时代，生物学家们的研究重心已经从解释生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对生物功能的研究。这种转向的第一个标志就是产生

2、了一门成为功能基因组学（Functional Genomics）的新学科。它采用一些新的技术，如SAGE、DNA芯片，对成千上万的基因表达进行分析和比较，力图从基因组整体水平上对基因的活动规律进行阐述。,蛋白质组是指“由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质”。测定一个有机体的基因组所表达的全部蛋白质的设想，萌发在1975年双向凝胶电泳发明之时。1994年Williams正式提出了这个问题，而“蛋白质组”的名词则是由Wilkins创造的，发表在1995年7月的Electrophoresis杂志上。,蛋白质组与基因组相对应，但二者又有根本不同之处：一个有机体只有一个确定的基因组，组成

3、该有机体的所有不同细胞都共享用一个确定的基因组；而蛋白质组则是一个动态的概念，她不仅在同一个机体的不同组织和细胞中不同，在同一机体的不同发育阶段，在不同的生理状态下，乃至在不同的外界环境下都是不同的。,基因DNA的序列并不能提供这些信息，再加上由于基因剪接，蛋白质翻译后修饰和蛋白质剪接，基因遗传信息的表现规律就更加复杂，不再是经典的一个基因一个蛋白的对应关系，一个基因可以表达的蛋白质数目可能远大于一。,蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。通过对正常个体及病理个体间的蛋白质组比较分析，我们可以找到某些“疾病特异性的蛋白质分子”，

4、它们可成为新药物设计的分子靶点，或者也会为疾病的早期诊断提供分子标志。,定义1：阐明生物体各种生物基因组在细胞中表达的全部蛋白质的表达模式及功能模式的学科。包括鉴定蛋白质的表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能和相互作用等。,蛋白质组学定义,应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；总论（二级学科）,定义2：研究基因组编码的全部蛋白质的结构、性质和功能的学科。,定义3：研究细胞内全部蛋白质的组成、结构与功能的学科。,应用学科：细胞生物学（一级学科）；总论（二级学科）,应用学科：遗传学（一级学科）；总论（二级学科）,定义4：结构蛋白质组学又称组成蛋白质组学，这是一种针对有基因组或转录组数据库的

5、生物体或组织、细胞，建立其蛋白质或亚蛋白质组(或蛋白质表达谱)及其蛋白质组连锁群的一种全景式的蛋白组学研究，从而获得对有机体生命活动的全景式认识。,蛋白质组学,研究策略研究基础,蛋白质组学研究策略,依赖于分离的研究策略 不依赖于分离的研究策略,1.依赖于分离的研究策略,二维凝胶电泳结合质谱： 利用蛋白质两种相互独立的物理化学特性进行分离 利用红外 MALTI-TOF-MS 扫描分析分辨率一步分离法：一维凝胶电泳结合电喷雾质谱 利用电喷雾质谱能够分析蛋白质混合物的特性 利用一维凝胶进行初步分离，然后对蛋白质复合物快速分析其它垂直分离法：液相色谱和毛细管电泳分离结合质谱（为了克服二维凝胶电泳的局限

6、性） 利用两种或多种分离方法达到二维凝胶的分离能力和通量：主要 是 液相色谱和毛细管电泳,液相色谱/毛细管电泳,液相色谱：高效液相色谱优点：容易实现自动化，且快速，重复性高，灵敏度高 缺点：与质谱对接困难（将分离的蛋白移入质谱时易丢失和交叉污染）,2.不依赖于分离的研究策略,依赖分离的技术局限在于：需要较多样品；需要多步操作不依赖分离的技术可以减少分析需要样品的量主要包括：1）蛋白质芯片2）蛋白质识别分子,蛋白质芯片,蛋白质芯片关键：空间上固定能严格识别单一蛋白成分的分子（蛋白质识别分子）具备检测单一蛋白成分与其识别分子间相互作用的方法,蛋白质识别分子, 抗体：最明显，最有效要求：高度特异，甚

7、至可以区分修饰前后的蛋白分子噬菌体显示技术分子印迹聚合物：人造识别位点模仿通过形状起作用的生化位点，如抗原抗体作用，酶底物作 用，受体配体作用,研究基础,生命功能的主要执行者和直接体现者：蛋白质 基因组计划的局限性 基因组计划的成就与要求 蛋白质组研究自身发展的需求和研究技 术的突破,基因组计划的局限性1, 基因序列本身的局限性，并不是所有基因同时表达，而是根据环境和生理状况而定，即使知道全序列也 不能完全清楚表达状况。 基因产物何时被翻译，是否被翻译 不清楚 基因产物被翻译的量是多少 不清楚 翻译后修饰的程度 不清楚 基因表达的结果如何 不清楚 基因相对应的表型 不清楚,基因组计划的局限性2

8、, 尽管通常情况下mRNA表达丰度决定了对应的蛋白质量，但是不能仅仅以mRNA的数据为基础预测蛋白质表达水平。 例如，对数生长期的啤酒酵母，同样mRNA产生的蛋白质量不同； 蛋白质动态修饰和加工并非必须取决于基因序列，许多调节是在蛋白质的结构域中发生。 例如蛋白质转录后的糖基化，磷酸化等作用，以及许多蛋白质只有与其它分子结合才体现活性，这些修饰和 结合通常是动态和可逆的，而且不能由基因序列来决定。,基因组计划的成就与要求,世界对人类基因组的全部DNA序列进行测定，已经取 得巨大成功，生命科学进入了后基因组时代(post-genome era)。在后基因组时代，研究的重心从揭示人类所有的遗传信息

9、转移到在整体水平上 对生物功能的研究。,自身发展的需求和研究技术的突破,蛋白质组学因为是对细胞内的总蛋白同时进行研究，所以需要高通量鉴定蛋白质点，对自动化程度要求高，且对样品的需求越少越好，纳米技术，电喷雾质谱，蛋白质芯片等新技术的全新登场也促进了蛋白质组学的产生和发展。,蛋白质组学的研究内容,一、蛋白质研究 二、细胞甚至亚细胞研究 三、二维电泳分离蛋白,蛋白质研究,1.蛋白质鉴定(Protein identification) 2.翻译后修饰(Post-translational modifications) 3.蛋白质功能确定(Determining function) 4.分子药学(Mo

10、lecular medicine),蛋白质研究,1.蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合western等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。一维胶电泳(One-dimensional gels)：如亲和纯化后样品的分析(analysis after affinity purification)二维胶电泳(Two-dimensional gels): 如纯化液或生物流体的分析等电喷雾质谱(Electrospray ionization mass spectrometry):如肽的指纹图谱以及肽序列的测定蛋白芯片(Protein chips):如用蛋白或抗

11、体包被的芯片成批鉴定蛋白质 (chips coated with proteins or antibodies)非电泳技术鉴定溶液中的蛋白或蛋白复合物(Proteins/protein complexes in solution identified without electrophoresis),蛋白质研究,2.翻译后修饰：很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。 磷酸化修饰 (Phosphorylation)最被关注，方法：2D电泳分离后，用P32标记或用磷

12、酸化酪氨酸或磷酸化丝氨酸特异性抗体做Western印迹检测 磷酸化蛋白质，再用质谱鉴定。糖苷化修饰(Glycosylation)脂质修饰（Lipolyzation）,蛋白质研究,3.蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析及配基-受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。Clontech的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具。,蛋白质研究,4.对人类而言，蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子药学的发展。 发现药物分子（蛋白）的作

13、用靶点（Finding molecular (protein) drug targets） 用药物破坏蛋白质-蛋白质之间的相互作用（Disrupting proteinprotein interactions using drugs）重组蛋白质、抗体、抑制剂的动物实验（Large-scale animal assays for recombinant proteins, antibodies and inhibitors）,细胞甚至亚细胞研究,免疫组织化学技术：缺点是通量低。LCM技术：可以精确地从组织切片中取出研究者感兴趣的细胞类型，是一种原位技术。,二维电泳分离蛋白质,二维电泳可以将不同种

14、类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率分离.成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离。,比较两种样品之间蛋白质表达的异同,法一：制备蛋白质样品-二维电泳-染色比较两块胶法二：制备蛋白质样品-荧光染料标记-在同一块胶上进行二维电泳-荧光扫描技术分析,胶染色-利用凝胶图像分析系统成像-定量分析-定位-切割-酶切消化-脱盐或浓缩处理-质谱系统分析得定位数据-构建数据库或和已有的数据库比较分析,LCM-抗体芯片,LCM技术获细胞类型-制备蛋白质样品-荧光标记-与抗体芯片杂交-比较两种蛋白质样品蛋白质表达的异同,研究方法,酵母双杂交技术利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能利用

15、酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药 物对蛋白质之间相互作用的影响利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）噬菌体展示技术制作成蛋白质芯片,发展回顾,核酸与蛋白质是构成生物体的主要大分子。随着人类基因组等大量生物体全基因组序列的破译和功能基因组研究的展开，生命科学家越来越关注如何用基因组研究的模式开展蛋白质组学的研究。,一、主要进展二、发展趋势,一、主要进展,主要从以下两方面分析：启动研究重要成就,启动研究,在国家支持下，中国科学院生物化学研究所、军事医学科学院、复旦大学与北京师范大学等单位迅速启动了

16、蛋白质组研究建立并组合了二维电泳蛋白质组分离技术、图象分析技术和蛋白质鉴定的质谱技术；举办了三次全国性的蛋白质组学术研讨会，并在国际上较早提出了功能蛋白质组学的研究战略。,重要成就1, 从1995年 “proteome” 一词问世至1997年底两年多时间内，相关文献42篇，其中研究论文28篇，各类评述、综述13篇。研究论文中1995年1篇，1996年4篇，1997年23篇。呈现一种研究和实际应用并驾齐驱的态势。 1997年成立专门研究机构和公司5个，参与国家有澳大利亚、美国、丹麦、瑞士、英、法、日、瑞典、意、德等10国,重要成就2, 1995年 Wasinger等第一篇关于蛋白质组研究文章的对

17、象为目前已知最小，但能自主复制的原核微生物-阴道支原体(Mycoplasma genitalium) 1997年研究对象扩展到14种生物，其中绝大多数为原核生物，但也含多细胞真核生物，如线虫。初步建立了包括人心脏、肝脏在内10余个蛋白质组数据库，其中包括一个完整的酵母蛋白质组数据库(YPD, 8021个蛋白质) 2004年中国科学家首次在国际蛋白质组学最权威的专业刊物分子细胞蛋白质组学发表文章，据统计，中国科学家在国际蛋白质组学主要刊物分子细胞蛋白质组学、蛋白质组研究和蛋白质组学上发表的论文数量已位列世界第二位。,二、发展趋势,在胚胎干细胞诱导向神经干细胞方向分化前后虽然我国蛋白质组学研究启动

18、不久， 已经在重大疾病比较蛋白质组研究获得了重要成就一些重要生理和病理体系的蛋白质组成分研究方面获得了重要成就蛋白质组学不仅自身发展迅速，而且作为生命科学与生物高技术的新一代引擎，将带动大量相关学科领域的快速发展，为生命科学的研究、生物技术的应用和人类疾病的预防诊治带来新的革命。,发展趋势,1.在基础研究方面2.在应用研究方面3.在技术发展方面,蛋白质组学是一门新兴但发展迅速的学科。近年来，国际上主要发达国家和地区纷纷加大了对蛋白质组学的支持力度，这一研究领域也由此成为各强国科技角力的新战场。2010年10月1213日，以“蛋白质组学：前沿与挑战”为主题的第381次香山科学会议在北京举行，与会

19、的59名海内外科学家围绕蛋白质组学发展趋势及需求等议题展开了深入讨论。,1.在基础研究方面,应用到生命科学领域：细胞生物学、神经生物学等在研究对象：原核微生物、真核微生物、植物和动物等涉及的生物学现象：信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等等,在未来的发展中，蛋白质组学的研究领域将更加广泛。,返回,2.在应用研究方面,蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一。临床诊断治疗方面,返回,发展新方法,从全蛋白质组研究向亚细胞蛋白质组研究转变从定性描述向定量分析转变由静态研究向动态研究转变由体外研究向体内研究转变从实验室研究向临床应用拓展从数据产出由数量向质量转变从由简单积累向有效整合以及知识挖掘转变,3.在技术发展方面,发展新方法更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征。蛋白质组学与其它学科的交叉也将日益显著和重要，（如与基因组学，生物信息学等领域的交叉，构成组学（omics）生物技术研究方法，所呈现出的系统生物学（System Biology）研究模式，将成为未来生命科学最令人激动的新前沿。）,谢谢,