第五章 工业微生物产生菌的分离筛选课件.ppt

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1、第五章 工业微生物产生菌的分离筛选,第一节 含微生物样品的采集 第二节 含微生物样品的富集培养 第三节 好养微生物的分离 第四节 厌氧微生物的分离第五节 野生型菌株的筛选和菌株鉴定第六节 极端环境微生物的分离筛选第七节 生物可降解塑料菌株的分离筛选,菌株分离（separation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需的微生物的过程。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。,菌种是发酵工业的关键,菌种可从以下几个

2、途径进行收集和筛选： （1）向菌种保藏机构和个人索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。 国际承认的培养物保藏单位 保藏单位(简称) 所在国家 保藏范围澳大利亚国家分析试验室(AGAL) 澳大利亚 微生物菌种比利时微生物保藏中心(BCCM) 比利时 大部分微生物菌种保加利亚菌种保藏库(NBIMCC) 保加利亚 微生物菌种中国典型培养物保藏中心(CCTCC) 中国 几乎所有的培养物中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)中国 普通菌种捷克微生物保藏所(CCM) 捷克 普通微生物菌种法国微生物保藏中心(CNCM) 法国 几乎所有的培养物德国微生物保藏中心(DSM) 德国 普通微生物菌种匈牙利国家农业和

3、工业微生物保藏中心(NCAIM) 匈牙利 工业菌种 日本国家生命科学 和人类技术研究所(NIBH) 日本 几乎所有的培养物荷兰真菌保藏所(CBS) 荷兰 真菌类韩国细胞系研究联盟(KCLRF) 韩国 动植物细胞系 韩国微生物保藏中心(KCCM) 韩国 微生物菌种,韩国典型培养物保藏中心(KCTC) 韩国 培养物俄罗斯微生物保藏中心(VKM) 俄罗斯 工业微生物俄罗斯科学院微生物理化所(IBFMVKM) 俄罗斯 所有培养物俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM) 俄罗斯 工业菌种斯洛伐克酵母保存所(CCY) 斯洛伐克 酵母菌西班牙普通微生物保藏中心(CECT) 西班牙 普通微生物菌种英国藻类和原

4、生物动物保藏中心(CCAP) 英国 藻类、原生动物欧洲动物细胞保藏中心(ECACC) 英国 动物细胞系等国际真菌学研究所(IMI) 英国 真菌、细菌等英国国家食品细胞保藏中心(NCFB) 英国 工业细菌英国国家典型培养物保藏中心(NCTC) 英国 普通微生物英国国家酵母菌保藏中心(NCYC) 英国 酵母菌英国国家工业和海洋细菌保藏中心(NCIMB) 英国 工业及海洋细菌美国北方农业研究所培养物保藏中心(NRRL) 美国 以微生物菌种为主美国典型培养物保藏中心(ATCC) 美国 几乎所有的培养物,（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。（3）从一些发酵制品中分离目的菌株

5、。,菌株的分离和筛选一般可分以下几个步骤:采样富集分离产物鉴别生化鉴定,第一节 含微生物样品的采集,一、从土壤中采样1克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）放线菌（107）霉菌（106）酵母菌（105）藻类（104）原生动物（103）,（一）根据土壤特点 1土壤有机质含量和通气状况 耕作土、菜园土、近郊土壤，森林土，贫瘠土壤 土样最好的土层是5-25cm、一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到。总的来说酵母菌分布土层最浅，约5-10 cm；霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。厌氧菌分布较深。 2土壤的酸碱度和植被状况 3地理条件：南方、北方 4

6、季节条件 ：710个月,（二）采样方法 用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5-25cm处的土样1025 g，装入事先准准备好的塑料袋内扎好。给塑料袋编号并记录地点、土壤土质、植被名称、时间及其他环境条件。 北方土壤干燥在10-30cm处取样。 一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。 样品较多时，可先采用选择性培养基做好试管斜面，随身带走。,二、根据微生物生理特点取样 1根据微生物的营养类型每种微生物对碳、氮源的需求不一样，分布也有差异。若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物，从大量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品，容易得到满意的效果。森林、肉类加工厂、面粉厂、糖厂、柑橘、油

7、田、化工厂等不少微生物对碳源的利用是不完全专一的，如以油脂为碳源的某些脂肪酶产生菌同样也可以分解淀粉获得能源而生长。 2.根据微生物的生理特性高温、低温、耐压、耐高渗等,三、特殊环境下采样1局部环境条件的影响2极端环境条件的影响,特定微生物的分离,嗜 极 菌嗜压、嗜酸嗜减,一、控制培养基的营养成分1 根据环境条件选择合适的培养基2、根据微生物的类型3、根据微生物对环境的耐受范围具有可塑性的特点(抗性菌株、污染物分解菌）,第二节 含微生物样品的富集培养,富集培养（enrichment breeding)：是在目的微生物含量较少时根据微生物的特点设计一种选择培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物

8、在最适的环境下迅速生长繁殖，数量增加，由原来的自然条件下的劣势菌株变成人工环境下的优势种，以利分离到所需菌株。富集培养主要是根据微生物的碳源、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制。,二、控制培养条件 细菌、放线菌的生长繁殖要求偏碱（pH7.0-7.5)霉菌和酵母菌的生长繁殖要求偏酸（pH4.5-6.0）温度、通气量等,极端微生物,微生物的生理特点,三、抑制不需要的菌类 1、分离真菌时可在培养基中加入四环素等抗生素抑制细菌 2、分离放线菌时在培养基中加入10滴10%的酚或加青霉素、链霉素等抑制革兰氏阳性菌和阴性菌，或加入丙酸钠10ug/ml抑制霉菌和细菌生长 3、加入放线菌酮可以有效抑制真菌

9、的生长4、在富集培养基中加人适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长，对革兰阴性菌无抑制作用5、分离厌氧菌时，可加人少量硫乙醇酸钠作为还原剂,6、在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样在空气中干燥，再加热到100保温1h，可简少细菌和链霉菌的数量。7、分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时，可分别将样品在高浓度酒精和高浓度甘蔗溶液中处理一段时间。杀死非目的微生物后再进行分离。从土壤中分离芽孢杆菌对于含菌数量较少的样品或分离一些稀有微生物时，采用富集培养可以提高分离工作效率。,第三节 好氧微生物的分离,较粗放的分离方法 “菌落纯” 如稀释涂布法，划线分离法，组织分离法等 。组织分离法则通常是从有

10、病或特殊组织中分离菌株。 较细的分离方法 “菌株纯” 单细胞或单孢子分离方法” 这类方法需采用专门的仪器设备，复杂的如显微操纵装置，简单的可利用培养皿或凹玻片作分离小室进行分离、,一 稀释涂布法二 划线分离法三 利用平皿的生化反应进行分离1透明圈法2变色圈法 3生长圈法4抑菌圈法,饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片变色圈,指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液,固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。,利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养物的前体转化成营养物 能力，工

11、具菌就能围绕该菌生长,待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质,四 组织分离法1对一般有病组织的分离方法 用10%漂白粉或0.1升汞浸泡2食用菌孢子分离法 （1）多孢子分离法 （2）单孢子分离法：单孢子稀释,五 单细胞或单孢子分离法1、小滴分离纯化方法 稀释样品为1500/ml，滴管4000d/ml2、滤纸片法,六、通过控制营养和培养条件进行分离,1.培养基的营养成分 2.培养基的pH3.排除不需要的菌类4控制培养温度,50-6020-4015或更低,（1）分离细菌时，在培养基中加入浓度为50Uml制霉菌素；可以抑制霉菌和酵母菌的生长。 （2）分离放线菌时，在样品中加入 0.05 十二

12、烷基磺酸钠（SDS）不仅可以抑制细菌的主长；还能激活放线菌孢子的菌丝。加人氟哌酸（5mg/L）+制霉菌素（50mg/L）+青霉素（0.5mg/L）也可有效地抑制细菌和真菌，而不影响放线菌的生长。 （3）分离霉菌和酵母菌时，在培养基中加入青霉素、链霉素和四环素各30Uml，可以抑制细菌和放线菌生长。 （4）分离根霉和毛霉在培养基中添加0.1%去氧胆酸钠或山梨醇防止菌丝蔓延，使菌落长得小而紧密。,第四节 厌氧微生物的分离,一、厌氧培养中几种除氧的方法（一）加还原剂 分离培养基内加人还原剂，如半胱氨酸、D型维生素C、硫化钠等，操作时以最快的速度划线分离，然后立即置于事先已抽真空密闭的容器内（充CO2

13、或N2），适温培养。,（二）焦性没食子酸法 （1,2,3-三羟基苯）（三）平皿厌气培养法（四）试管厌气培养法（五）玻璃板隔绝空气培养法（六）生物吸氧法 除以上的方法外，还有肝块肉汤培养，高层琼脂法，共栖培养法等 实例： 1）保加利亚乳杆菌的分离筛选 2）反硝化细菌的分离,（ 1 ）单个平皿法 按常规在琼脂平板上划线接种。将固体石蜡置于一容器中加热融化。取方形玻板一块 , 中央置纱布或重叠滤纸一小块 , 上面放焦性没食子酸 0.5g ，加 10 氢氧化钠溶液 0.5ml 后迅速将平皿底倒置于其上，周围立即用融化石蜡封闭。置 37 温箱培养 2-3d ，取出观察。,（ 2 ）试管培养法 取约 10

14、0cm3 容积的大试管一支，在管底放焦性没食子酸 10g 及玻璃珠数个。将已接种的培养管放入大试管中，加入 20 氢氧化钠溶液 1m1 ，立即将管口用橡皮塞塞紧，必要时四周围封以石蜡， 37培养 2-3d 观察。 3 ）干燥器（玻罐）法 计算好容器的体积，根据其体积称取焦性没食子酸（置于平皿内）和配制氢氧化钠溶液。将氢氧化钠溶液倒人干燥器底部，把盛有焦性没食子酸的平皿轻轻漂浮于液面上。放好隔板，将接种好的平板或试管置于隔板上，把干燥器盖盖上密封（可预先在罐口抹一薄层凡士林）。轻轻摇动干燥器，使焦性没食子酸和氢氧化钠溶液混合，置 37 温箱培养 2-3d ，取出观察,第五节 野生型目的菌株的筛选

15、 和菌株鉴定,一、初筛1平板筛选 较粗放的检筛方法 2摇瓶筛选 效果比较一致，由此筛选到的菌株易于推广,通过该法可淘汰85-90%不符合要求的微生物 二、复筛 一个菌株通常要重复3-5个瓶，培养后的发酵液采用精确分析方法测定,三 菌株鉴定 三个步骤：1、获得该微生物的纯种培养物； 2、测定一系列必要的鉴定指标； 3、根据权威性的鉴定手册进行菌种鉴定。 四个水平：细胞形态和习性水平；细胞组分水平；蛋白质水平；基因或DNA水平。,菌落形态，个体形态，革兰氏染色，生理生化，分子鉴定,例子：高产类胡萝卜素红酵母的分离筛选,取样,富集培养（初筛和复筛）,菌株鉴定,取样及筛选1、水池边红色附着物中红酵母的

16、分离2、公共浴室红色附着物中红酵母的分离3、空气中红酵母的分离,4、果园土壤、汽车修理厂土壤中红酵母的分离5、醪糟、葡萄汁中红酵母的分离,分离筛选用培养基1、平板筛选培养基（20%PDA）：马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂1.8%，自然pH，121灭菌30min；2、富集培养基：马铃薯20%，葡萄糖2%，自然pH，121灭菌30min；3、斜面保存培养基（20%PDA）：马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂1.8%，自然pH，121灭菌30min；,4、液体种子培养基(YEPD)9：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨1%，自然pH，121灭菌20min；5、液体发酵培养基(YEPD)9：葡萄糖4%，酵母膏

17、1%，蛋白胨1%，pH6.0，121灭菌20min；6、鉴定用培养基10：5%麦芽汁培养基，12.5%豆芽汁培养基，尿素液体培养基，无碳培养基，无氮培养基，尿素液体培养基，Gorodkowa培养基，马铃薯块培养基。,红酵母的鉴定参照BarenttJAYeastscharacteristicsandidentifaction17有选择性地对筛选所得酵母菌进行形态特征（细胞形态、群体培养特征、子囊孢子的形成、假菌丝的形成和形态、掷孢子的形成）生理生化特性（糖类发酵特性、碳源同化特性、氮源同化特性、耐高渗特性、脲酶试验特性、重氮基蓝B盐显色特性）鉴定。,第六节 极端环境微生物的分离筛选,一、极端环境

18、微生物的采样、分离筛选,（一） 极端环境微生物选育主要流程,样品采集,富集培养,分离纯化,菌种鉴定,菌种改良,接种实验,效果明显菌,效果不明显菌,工业生产,菌种保藏,继续驯化,提取宏基因组,建立宏基因组文库,分析宏基因组文库,利用PCR或杂交筛选特定功能基因,筛选表达特定表型的基因,随机测序分析微生物生态,（二） 采集样品不同的微生物到不同的环境中去取样,（三）采集样品的方法,（四）样品的富集培养,（五）菌株分离,1、嗜热好氧菌培养基2、嗜热厌氧菌培养基,根据自己的需要，采用不同的方法：直接分离培养；带回培养；直接提取DNA,嗜热菌培养时注意哪些问题？液体或固体培养,嗜热菌与普通菌分离培养有什

19、么不同？,1、在固体平板分离培养时，由于水分的蒸发，而使平板培养容易发生皱裂。,2、液体培养基培养时，置于60培养，转速高于180rpm以上，蒸发和通氧均不会造成影响，而高于70时，蒸发成为突出问题。,二、极端微生物酶分子生物学研究,1、极端酶基因的克隆2、极端酶基因表达系统的构建,1、分离纯化极端酶2、测定目的蛋白的N和C端3、根据氨基酸序列推导核苷酸序列，设计引物4、通过PCR扩增基因5、构建基因文库或cDNA文库6、通过分子杂交或目的蛋白活性检测,研究极端微生物多样性及其应用的意义：1、极端环境微生物的基因是构建遗传工程菌的资源宝库。2、极端环境微生物的生态、结构、分类、代谢、遗传等均有

20、别于普通微生物，使得极端环境微生物的活性物质具有普通微生物活性物质所不具备的特性。3、为生物进化、生命起源的研究提供新的材料。,第七节 生物可降解塑料（PHA）菌株的分离筛选,一、生物可降解塑料概况二、获得生物可降解塑料的微生物途径和菌株分离 方法1、从自然界分离产生PHA的微生物2、利用食品工厂活性污泥生产PHA3、构建基因工程菌株合成生物可降解塑料,三、PHA合成机制和发酵特点1、碳源2、氮源3、溶氧4、pH、温度及无机元素,特殊菌类环保降解菌的分离1、自然界存在着大量废物及污染物，如多环芳烃（PAN）、有机染料和颜料、表面活性剂、农药、酚类和卤代烃等。在分离筛选这类物质的降解微生物时，通

21、常采用以该物质为唯一碳源或氮源的培养基进行富集培养。,2、分离平板可采用该污染物为底物的鉴别培养基，通过水解圈和变色圈进一步提高筛选效率。采用该方法分离苯胺、DDT、甲基对硫磷（MP）、石油、甲胺磷等污染物都取得了良好的效果。,3、在筛选环保降解菌时要注意，某些有毒污染物由于本身对微生物的生长有抑制作用，如果直接在培养基中加人该物质连续富集培养，可能效果不佳。这时就需根据不同情况设计更合理的筛选模型。如在分离以氰化物为氮源的细菌时，把浸透了KCN溶液的滤纸放到平皿盖上，滤纸所产生的含CN蒸气逐渐渗入含无机盐的分离培养基，每天用新制备的浸湿KCN的滤纸更换，培养一段时间后，从平皿上长出的菌落中进行分离，便容易得到能分解氰化物的菌株。,复习题1、名词解释菌株分离 筛选 富集培养 PHA 2、菌株分离的步骤、方法 3、从土壤中采集样品的依据是什么4、如何富集微生物5、好氧微生物的分离方法6、常用的厌氧培养的方法有哪些7、极端环境微生物的选育流程8、极端微生物的培养与普通微生物的培养有什么区别9、请你设计一实验，从海水中分离一株能够降解几丁质的酵母菌菌株（详细写明方法、培养基、培养条件等）,