第五章 反胶团萃取要点课件.ppt

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1、第五章 反胶团萃取与双水相萃取,2013.2,第一节、反胶团萃取,基本要求：1、掌握反胶团的构造、反胶团的物理化学特性及制备2、反胶团萃取原理，了解反胶团在分离工艺中的应用。重点：反胶团萃取原理。难点：反胶团的构造；反胶团的物理化学特性及制备。,第一节 反胶团萃取,一、概述传统的萃取，难以应用于一些生物活性物质的提取与分离。因为绝大多数蛋白质不溶于有机溶剂，若使蛋白质接触有机溶剂，会引起蛋白质的变性。另外，蛋白质分子表面带有许多电荷，普通的离子缔合型萃取难以奏效，因次研究和开发易与工业化的、高效的生化物质分离方法已成为当务之急。反胶团萃取（reversed micellar extrceion

2、）就是在这一背景下发展起来的一种新型分离技术。,1977年，瑞士学者Luisi等人首次提出用反胶团萃取蛋白质，但未引起人们的广泛关注。直到20世纪80年代生物学家们才开始认识到反胶团萃取的重要性。反胶团萃取的本质仍然是液液萃取，但与一般溶剂萃取所不同的是，反胶团萃取是利用表面活性剂在有机溶剂相中形成反胶团进行萃取，即反胶团在有机相内形成一个亲水微环境，使蛋白质类生物活性物质溶解于其中，从而避免在有机相中发生不可逆变性的现象。此外，构成反胶团的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，因此可以用于直接从完整细胞中提取蛋白质和酶，省却了细胞破壁。,1、反胶团的形成及特性胶团和反胶团的形成胶团或反胶团的形成

3、均是表面活性剂分子自聚的结果，是热力学稳定体系。将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶团浓度（criticalmicelle concentration,CMC）时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起形成聚集体，称为胶团（micelles）。水溶液中胶团的表面活性剂的极性基团向外与水相接触，而非极性基团在内，形成一个非极性的核心，此核心可以溶解非极性物质。若有机溶剂中加入表面活性剂，当其浓度超过临界浓度时，就会在有机相中也形成聚集体，称为反胶团。在反胶团中，表面活性剂的非极性基团在外，与有机相接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核（polarcore）。此极性核具有溶解极性物质的能力，极性

4、核溶解水后，就形成“水池”。由于周围水层和极性基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会造成失活。,反胶团：是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的、内含微小水滴的、空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。是一种自我组织和排列而成的，并具热力学稳定的有序构造。,反胶团的微小界面和微小水相具有两个特异性功能： (1)具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能； (2)在疏水性环境中具有使亲水性大分子如蛋白质等保持活性的功能。,反胶团萃取技术在分离生物大分子特别是分离蛋白质方面，具有突出优点： （1）有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性； （2）分离、浓缩可同时进行，过程简便； （3

5、）能解决蛋白质（如胞内酶）在非细胞环境中迅速失活的问题； （4）由于构成反胶团的表面活性剂往往具有细胞破壁功效，因而可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶； （5）反胶团萃取技术的成本低，溶剂可反复使用等。,反胶团的应用研究：（1）作为生物膜的简化模型；（2）作为显示酶类性质的一种模型进行基础性研究；（3）作为具有新型功能的疏水性反应场；（4）作为酶和微生物的一种新型的固定化方法；（5）作为微小型的生物反应器；（6）作为生理活性物质及生物活性大分子的特异性分离场的应用性研究。,2、反胶团的构造1)、反胶团的构造 向非极性溶剂中加入表面活性剂时，当表面活性剂的浓度超过一定的数值时，会在非极性

6、溶剂内形成表面活性剂的聚集体。与在水相中不同的是，非极性溶剂内形成的表面活性剂聚集体，其疏水性的非极性尾部向外，指向非极性溶剂，而极性头向内，与在水相中形成的微胶团方向相反，因而称之为反胶团或反向胶团。,图是表面活性剂聚集体的可能的微观构造,极性“头”,水,非极性的“核”,非极性“尾”,正胶团： 表面活性剂的极性头朝外，疏水的尾部朝内，中间形成非极性的“核”,极性“头”,有机溶剂,极性的“核”,非极性“尾”,反胶团： 表面活性剂的极性头朝内，疏水的尾部向外，中间形成极性的“核”,在反胶团中有一个极性核心，它包括由表面活性剂极性端组成的内表面、平衡离子和水，被称之为“水池”。 因为这个“水池”具

7、有极性，可以溶解具有极性的分子和亲水性的生物大分子，而极性分子和/或亲水性的生物大分子也因此可溶解在非极性的有机溶剂中。,3、常用表面活性剂 表面活性剂的存在是构成反胶团的必要条件，有三类表面活性剂都可在非极性溶剂中形成反胶团。 （1）阴离子型表面活性剂（2）阳离子型表面活性剂（3）非离子型表面活性剂,常用的表面活性剂及其相应的有机溶剂,在反胶团萃取蛋白质使用最多的是阴离子型表面活性剂AOT ，AOT容易获得，它具有双链，形成反胶团时无需添加辅助表面活性剂且有较好的强度；它的极性基团较小，所形成的反胶团空间较大，有利于生物大分子进入。,3、反胶团的分类,1）、单一表面活性剂反胶团体系： 是指在

8、使用时无须加入助剂的表面活性剂，具有多条中等长度的烷基尾和一个较小的极性头。 A、 阴离子型，如AOT。该体系结构简单和稳定，反胶团体积较大，适用于等电点较高的、相对分子量较小的蛋白质的分离； B、阳离子型，如CTAB，DAP等。该体系适用于等电点较低的、相对分子量较大的蛋白质的分离； C、非离子型表面活性剂，能形成更大的反胶团体系，能分离相对分子量更大的蛋白质，但这类体系容易乳化。,2）、混合表面活性剂反胶团体系： 是指两种或两种以上表面活性剂构成的体系，一般来说，混合表面活性剂反胶团对蛋白质有更高的分离效率。 3）、亲和反胶团体系： 是指除了有组成反胶团的表面活性剂以外，还有具有亲和特征的

9、助剂，它的亲和配基与蛋白质有特异的结合能力，往往极少量亲和配基的加入就可使萃取蛋白质的选择性大大提高。,二、反胶团的物理化学特性及制备 1、反胶团的物理化学特性 影响反胶团的大小的因素： 表面活性剂和非极性有机溶剂的种类、浓度； 操作时体系的温度、压力； 微小水池中的离子强度等。,（1）反胶团的临界胶团浓度 表面活性剂在非极性有机溶剂相中能形成反胶团的最小浓度称为临界胶团浓度 （CMC）。 大多数在0.11.0mmol/L之间。 CMC与表面活性剂的种类有关。 见下表,某些表面活性剂的临界胶束浓度(molL),（2）反胶团含水率W ： W用水和表面活性剂的摩尔浓度之比来定义，即 ： C 水 W

10、 = C表面活性剂 如表面活性剂是AOT，则 C 水 W = CAOT W越大，反胶团的半径越大。,当W 6-8 时， “水池”（微水相）中水分子被表面活性剂亲水基团强烈地束缚，其表观粘度可增大到普通水粘度的50倍，且疏水性非常强。另外，其冰点通常低于0。 这一部分水使表面活性剂的亲水性基团水合化，即被牢固地束缚着，所以粘度很大，流动性很差。,在AOT反胶团中，水合化一分子AOT需要68个水分子，而其它水分子则不受束缚，可与普通水一样自由流动。 故当W 16时，“水池”中的水逐渐接近主体水相粘度，胶团内也形成二重电荷层。 见下图。,假定反胶团为球形（除了W或表面活性剂浓度很大外），反胶团平均直

11、径dm的增加和W的增加基本成正比，W=050之间，dm=230nm。 AOT的Wmax=60，若W值再增大，反胶团溶液变浑浊，并开始分层。,2、反胶团的制备 制备反胶团系统一般有以下三种方法： （1）注入法 将含有蛋白质的水溶液直接注入到含有表面活性剂的非极性有机溶剂中去，然后进行搅拌直到形成透明的溶液为止。 该方法过程快，并能较好地控制反胶团的平均直径和含水量。,（2）相转移法 将酶或蛋白质从主体水相转移到含表面活性剂的非极性有机溶剂中形成反胶团-蛋白质溶液，即把含有表面活性剂的有机相和含有蛋白质的水相接触，在缓慢的搅拌下，一部分蛋白质缓慢转入（萃入）有机相。 该过程较慢，但形成的体系处于稳

12、定的热力学平衡状态，有利于在有机溶剂相中获得较高的蛋白质浓度。,（3）溶解法 将含有反胶团（W330）的有机溶液与蛋白质固体粉末一齐搅拌，使蛋白质进入反胶团中 。 用于非水溶性蛋白质。 该法所需时间较长，含蛋白质的反胶团体系稳定。 说明反胶团“水池”中的水与普通水的性质有区别。,三、 生理活性物质的分离浓缩,反胶团萃取原理蛋白质的溶解反胶团的萃取,1、反胶团萃取原理 从宏观上看反胶团萃取，是有机相水相间的分配萃取，和普通的液液萃取在操作上具有相同特征。 微观上，是从主体水相向溶解于有机溶剂相中的反胶团微水相中的分配萃取。 从原理上，可当做“液膜”分离操作的一种。 如下图所示 ：,2、反胶团萃取

13、特点 （1）进入有机相的生物大分子被表面活性分子所屏蔽，从而避免了与有机溶剂相直接接触而引起的变性，失活。 （2）pH、离子强度、表面活性剂浓度等（如下表）因素会对反胶团萃取产生影响。 通过对它们的调整，对分离场（反胶团）待分离物质（生物大分子等）的相互作用加以控制，能实现对目的物质高选择性的萃取和反萃取。 （3）有机相内反胶团中微水相体积最多仅占有机相的几个百分点，所以它同时也是一个浓缩操作。,3、影响反胶团萃取生物分子的主要因素,（1）水相pH值的影响 表面活性剂的极性头是朝向反胶团的内部，使反胶团的内壁带有一定的电荷，而蛋白质是一种两性电解质，水相的pH值决定了蛋白质分子表面可电离基团的

14、离子化程度，当蛋白质所带电荷与反胶团内所带电荷的性质相反时，由于静电引力，可使蛋白质转移到反胶团中。 相反，当水相pH大于等电点时，由于静电斥力，使溶入反胶团的蛋白质反向萃取出来，实现了蛋白质的反萃取。,（2）水相离子强度的影响 a：离子强度影响到反胶团内壁的静电屏蔽的程度，降低了蛋白质分子和反胶团内壁的静电作用力。 b：减小了表面活性剂极性头之间的相互斥力，使反胶团变小。 这两方面的效应都会使蛋白质分子的溶解性下降，甚至使已溶解的蛋白质从反胶团中反萃取出来。,（3）助表面活性剂的影响 蛋白质的分子量往往很大，超过几万或几十万，使表面活性剂形成的反胶团的大小不足以包容大的蛋白质，而无法实现萃取

15、，此时加入一些非离子表面活性剂，使它们插入反胶团结构中，就可以增大反胶团的尺寸，溶解相对分子质量较大的蛋白质。,（4）溶剂体系的影响 溶剂的性质，尤其是极性，对反胶团的形成和大小都有影响。 常用的溶剂有：烷烃类（正己烷、环己烷、正辛烷、异辛烷等）。 有时也使用助溶剂，如醇类。可以调节溶剂体系的极性，改变反胶团的大小，增加蛋白质的溶解度。,4、蛋白质的溶解蛋白质向非极性溶剂中反胶团的纳米级水池中的溶解，有下图所示的四种可能。（1）为水壳模型；（2）蛋白质中的亲脂部分直接与非极性溶剂的碳氢化合物相接触；（3）蛋白质被吸附在微胶团的“内壁”上；（4）蛋白质被几个微胶团所溶解，微胶团的非极性尾端与蛋白

16、质的亲脂部分直接作用。,在水壳模型中，蛋白质居于“水池”的中心，水壳层保护了蛋白质，使它的生物活性不会改变。 蛋白质表面电荷与反胶团内表面电荷间的静电作用是使蛋白质进入反胶团的重要因素，因此凡能影响静电作用的因素都会影响蛋白质的溶入，如水溶液的pH、离子强度等。,5、反胶团萃取,与反胶团萃取有关的因素如表5-1.因分离中使用的表面活性剂种类不同，如阴离子型和阳离子型，其相互作用和分离原理也会不同。应用较多的反胶团体系为：AOT/异辛烷体系。以立体性、静电性、疏水性相互作用的分离特性及效果归纳如下：,1）、氨基酸分离特性 氨基酸分子量与反胶团相比太小，不存在反胶团-氨基酸分子间的立体性相互作用和

17、分子间的大小识别，实际是通过AOT-氨基酸分子间的相互作用进行萃取的。 但由于氨基酸因pH不同而发生正负电荷的变化和带有疏水性残基，所以，以静电和疏水性相互作用来定量评价氨基酸的萃取特性和效果。,各种氨基酸随pH值的变化，实际电荷量的变化和氨基酸萃取率变化之间的关系如图8-6。,如图，平均每单位正电荷量、每分子AOT，萃入的氨基酸分子数是一固定值，该值由氨基酸种类决定。 氨基酸残基的疏水性越大，该值越大。,2）、酶、蛋白质萃取特性 酶、蛋白质等生物大分子的空间尺度与反胶团的大小相接近，故存在立体性相互作用。 各种相互作用都很重要，在大多数情况下，是它们之间的复合作用。 有些蛋白质的构象发生很小

18、的变化时，就可能对这些相互作用的结果产生很大影响。,（1）静电性相互作用,以下表所示的酶、蛋白质为例，考察萃取或反萃取时静电性相互作用以及pH对这种作用的影响。,小分子蛋白质（Mr pI 时，蛋白质不能溶入胶团内，但在等电点附近，急速变为可溶。 当pH pI时，即在蛋白质带正电荷的pH范围内，它们几乎完全溶入胶团内 。,蛋白质分子量增大到一定程度，即使将pH向酸性一侧偏离pI，萃取率也会降低（即立体性相互作用效果增大）。 分子量更大的BSA，全pH范围内几乎都不能萃取（即静电相互作用效果无限小，可忽略不计）。 此时，AOT浓度如从通常条件（50100mmol/L）增加到200500mmol/L

19、，逐渐变为可萃取。,降低pH，正电荷量增加，萃取率从某一pH开始，急速减小。 这是因为pH导致蛋白质变性造成的。蛋白质和微量的AOT在静电、疏水性等的相互作用下，在水相中形成了复合体而变性。,添加KCl等无机盐，因离子强度的增加和静电屏蔽的作用，而使静电性相互作用变弱，一般地，萃取率下降。,添加KCl等无机盐，对有机相具有脱水作用（W减小），使立体性相互(排除)作用增大。,（2）立体性相互作用（空间位阻） 随蛋白质分子量的增大，蛋白质分子和胶团间的立体性相互作用增加，萃取率下降。,反胶团粒径并非一致，存在一粒径分布 。 反胶团的粒径分布（分离场）随盐浓度和AOT浓度的增加而发生显著的变化。 蛋

20、白质溶入与否，对它几乎没有影响。,即使萃取溶入胶团的蛋白质的种类和分子量不同，分离场的特性（胶团平均直径和含水率）几乎不变。随着蛋白质分子量的增加，分配系数KpI（蛋白质等电点处的分配系数）迅速下降。可以认为相对分子量20000左右的蛋白质的高效分离是通过立体性相互作用来实现的。,（3）其它的相互作用 关于疏水性相互作用和特异性相互作用，还研究不多。 一般认为疏水性相互作用对蛋白质分配特性的影响不大。,四、 在分离工艺中的应用,1、蛋白质分离 利用图8-8和图8-9的静电相互作用，通过三步分离核糖核酸a、细胞色素c和溶菌酶。 调整pH，进行正萃取分离，通过控制KCl浓度，反萃取分离，获得较好地

21、分离效果和收率。,第一步：在pH=9.0和较低的盐浓度下，核糖核酸酶a带负电荷，不能被反胶团萃取，留在水相中，而细胞色素C和溶菌酶由于都带正电荷，被萃取到反胶团中。 第二步：利用提高离子强度，将细胞色素C反萃到水相中，而溶菌酶仍留在反胶团中。 第三步：进一步提高pH值和离子强度，将溶菌酶反萃到水相中。,2、浓缩-淀粉酶,使用如图8.14所示，用2个混合槽和2个澄清槽组成连续萃取/反萃取流程，用TOMAC/0.1%(v/v)辛醇-异辛烷的反胶团体系循环萃取分离-淀粉酶，控制第一级水相中酶浓度在较低水平上，使失活速度很小，将-淀粉酶浓缩了8倍，酶活力损失约30%。 对该过程优化，在反胶团中加入非表

22、面活性剂，以提高分配系数，同时加大搅拌速度，以提高传质速率，第二级反萃液中-淀粉酶的活力回收率为84%，浓缩了17倍。,3、直接提取胞内酶,用反胶团直接从全发酵液中提取和纯化棕色固氮菌的胞内脱氢酶： 将全细胞的悬浮液注入CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）/己醇-辛烷反胶团溶液中，完整的细胞在表面活性剂的作用下，析出酶进入反胶团的“水池”中，经反萃取，可选择性地回收浓度很高的酶。 该技术不利的一面是细胞碎片留在反胶团中，使得反胶团不能循环利用，但如果能够便利地回收有机溶剂和表面活性剂，那么这种细胞溶解和蛋白质萃取相结合的工艺方法，将成为从细胞中直接提取蛋白质的重要途径。,4、反胶团萃取用于蛋白质的

23、复性,反胶团萃取的另一个应用是蛋白质的复性。 重组DNA技术生产的大部分蛋白质，须溶于强变性剂中，以便从细胞中抽提出来。除去变性剂，进行复性的过程通常要在极稀的溶液中进行，以避免部分复性中间体的凝集。 利用反胶团包裹变性的蛋白质，通过调整系统组成的环境参数，使得每个微胶团只包裹一个蛋白质分子，然后改变胶团溶液组成进行复性，由于蛋白质被单独装在各个胶团中，复性时完全不接触，避免了有害作用，使酶的活性完全恢复。,5、从植物中提取油和蛋白质,用烃类有机溶剂对植物种子进行反胶团萃取，油被直接萃入有机相，蛋白质却萃入反胶团的“水池”中。 先用水溶液反萃取得到蛋白质，溶液再经冷却使表面活性剂沉淀分离，最后

24、用蒸馏的方法将油和烃类分离。 实验证明该方法相当优越。,6、分离膜型的反胶团萃取,分离膜型的液-液反胶团萃取是混合分离型的改进型，以疏水性多孔质膜（接触比表面积较大，30300cm2/cm3)作为液液两相的接触界面。 在膜的内外两侧，分别流过含有蛋白质的水相和含有反胶团的有机相，液液界面靠膜两侧的压力差保持。 因膜自身对蛋白质透过无选择性，与反胶团萃取分离法具有相同的原理。,其优点是： 没有在一般连续性液液萃取法中成为问题的进料和液泛等制约因素，可自由地改变液流的流速； 总物质移动速度和膜面积比一般方法大； 在原理上是连续式的，放大也较容易。,五、在液膜分离法中的应用,利用含有反胶团的有机相作

25、为液膜，从一水相中向另一水相中选择性地输送生理活性物质的液膜分离方法，和通常的液液萃取法相比，具有以下一些特征： 正萃取和反萃取能同时在一个装置内进行，表面活性剂的使用量及其损失较少，从原理上来看，速度差分离也是可能的。,六、反胶团萃取设备,要实现反胶团萃取的工业化，关键之一是开发适用于反胶团萃取的高效分离设备。 1、膜萃取器 膜萃取器有管状超滤膜和中空纤维膜两种。,（1）管状超滤膜,用管状陶瓷超滤膜截留含有磷脂酶的反胶团，实现了对生物产品的部分分离。 含有磷酯酶的发酵液经过泵进入到陶瓷超滤膜组件中，磷酯酶被截留在膜内，萃余相则返回到反应器，从而实现磷酯酶的分离。,（2） 中空纤维膜,中空纤维

26、管是另一类被广泛用于液-液分离的膜萃取器。它具有很大的比表面积，且与反胶团技术相结合能减少蛋白质的失活，是一项很有实用前景的生物分离技术。 将亲和配基（活性色素辛巴蓝）加入到大豆卵磷酯-正已烷系统中，制成亲和反胶团相，并将此胶团相固定于聚丙烯中空纤维膜内，从而构建起亲和反胶团萃取膜的分配色谱装置（AMPC）。,2、离心萃取器,反胶团溶液-水-蛋白质所组成的萃取体系，由于表面活性剂的存在，界面张力低，易乳化。另外，由于萃取的目标产物是蛋白质，易变性失活。为了尽量避免蛋白质的变性，应尽量缩短操作时间，因而反胶团离心萃取是一项很合适的蛋白质萃取分离技术。,3、混合澄清槽,混合-澄清式萃取器是一种最常

27、用的液-液萃取设备，该设备由料液与萃取剂的混合器和用于两相分离的澄清器组成，可进行间歇或连续的液-液萃取。 但该设备最大的缺点是反胶团相与水相相混合时，混合液易出现乳化现象，从而增加了相分离时间。,4 、微分萃取设备,（1）喷淋塔萃取器 喷淋塔是一种应用广泛的液-液微分萃取设备，具有结构简单和操作弹性大等优点，在反胶团萃取方面受到了人们的关注。尤为重要的是，当用于含有表面活性剂的反胶团体系时，所需输入的能量很低，故不易乳化，从而缩短了相分离时间。但喷淋塔的缺点是连续相易出现轴向反混，从而降低萃取效率。,（2） 转盘萃取塔 转盘萃取塔（RDC）可用于蛋白质的萃取分离。 下图是RDC萃取蛋白质的示

28、意图，反胶团相为分散相，水相为连续相。 转盘塔的优点是单位塔高的效率高、高产量、操作弹性大和低能耗等。 缺点是体系易出现乳化和返混现象。,研究转盘萃取塔中蛋白质的反胶团萃取 （1）考察d32（反胶团分散相中液滴直径）的分布。 d32随着反胶团特性的改变而改变。有溶菌酶存在时的d32比没有时要小的多。另外，溶菌酶的溶解和传质也会影响反胶团液滴的直径；随转盘转速的增大，液滴直径也会下降。 （2）研究转盘萃取塔中反胶团萃取溶菌酶的传质性能，所建立的轴向扩散模型可描述转盘萃取塔的萃取性能，可用于转盘萃取塔反胶团萃取的参数预测和指导过程设计。,第二节 双水相萃取,掌握：1.聚合物的不相容性；相图。2.双

29、水相体系的是的形成及组成3.影响双水相萃取的因素4.双水相萃取技术有什么优越性,利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。,双水相萃取？,双水相的形成将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这就是双水相体系。这种含有不同聚合物分子的溶液发生分相的现象叫聚合物的不相容性。形成原因：由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。,常用的双水相体系 高聚物/高聚物体系：聚乙二醇(简称PEG) / 葡聚糖(简称Dextran) 高聚物/无机盐体系：

30、硫酸盐体系。常见的高聚物/ 无机盐体系为: PEG/ 硫酸盐或磷酸盐体系。,双水相系统(aqueous two-phase system, ATPS),PEG = 聚已二醇(polyethylene glycol),Kpi = 磷酸钾,DX = 葡聚糖(dextran),双水相萃取的原理是生物物质在双水相体系中的选择性分配，当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种作用力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同，即分配系数不同。,第一节 双水相分离理论,双节线：把均相区和两相区域分隔开。 系线：连接双节线上两点的直线。,均相区,两相区,在同一条系线上

31、的各点分成的两相具有相同的组成，但体积比不同,临界点：当系线长度趋向于零时，即在图中的C点，两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1，成为单相体系。,ATPS相图,双节线(bi-nodal)：图中的曲线。双节线以下的区域为均相区,以上的区域为两相区，即ATPS 。 系线(tie line)：双节线上两点的直线。系线反映的信息A 杠杆规则：系线上各点均为分成组成相同，而体积不同的两相。两相体积近似服从杠杆规则B 性质差异：系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度,系线越长,两相间的性质差别越大；反之则越小.C临界点(critical point)：当系线长度趋于零时, 两相差别消失,任何溶质在

32、两相中的分配系数均为1。如K点。,对于PEG/Dextran所形成的双水相体系中，若降低PEG相对分子质量，则生物分子分配于富含PEG的上相中，使分配系数增大；而降低Dextran相对分子质量，则分配系数减小。若想在上相获得较高的蛋白质收率，对于PEG聚合物，应降低它的平均分子量，相反，若想在下相获得较高的蛋白质收率，则平均分子量应增加。,(1)成相聚合物的影响,A、成相聚合物分子量,B、成相聚合物的浓度,聚合物分相的最低浓度为临界点，系线的长度为零，此时分配系数为1，即组分均匀的分配于上下相. 随着成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合物的总浓度增大，系统远离临界点，系线长度增加，两相性质的差别

33、(疏水性等)增大，蛋白质分子的分配系数将偏离临界点处的值(m=1)，即大于1或小于1。因此,成相物质的总浓度越高，系线越长，蛋白质越容易分配于其中的某一相。,(2) 盐的种类和浓度,盐的种类和浓度对分配系数的影响主要反映在对相间电位和蛋白质疏水性的影响。,盐的种类,在双聚合物系统中，无机离子具有各自的分配系数，不同电解质的正负离子的分配系数不同，从而产生不同的相间电位。由于各相要保持电中性，使得带电生物大分子，如蛋白质和核酸等分别向两相移动分配。,盐的浓度,盐的浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰乱双水相系统，改变各相中成相物质的组成和相体积比。例如，PEG/磷酸盐体系中上下相的PEG和磷酸

34、盐浓度及Cl-在上下相中的分配平衡随添加NaCl浓度的增大而改变，这种相组成即相性质的改变直接影响蛋白质的分配系数，如图。离子强度对不同蛋白质的影响程度不同，利用这一特点，通过调节双水相系统的盐浓度，可有效地萃取分离不同的蛋白质。,（4）温度的影响 分配系数对温度的变化不敏感 成相聚合物对蛋白质有稳定化作用,所以室温操作活性收率依然很高,而且室温时粘度较冷却时(4 ) 低,有助于相的分离并节省了能源开支。,（一）目的物的萃取,1、如果目标产物在上相中的分配系数足够大，则细胞匀浆液中的目标产物可采用一步或两步双水相萃取工艺获得较高的纯化倍数。 一步双水相萃取：是把生物材料悬浮液和双水相系统混合后

35、，其中下相含有大多数杂质，而上相含目标产物。两步双水相萃取：把一步萃取体系中的上相分离出来后，再加入盐使其形成新的双水相体系，则富含PEG的上相得到回收，同时，含有目标产物的盐相通过超滤等操作得到分离目标。,三步双水相萃取酶的流程示意图,2、如果细胞匀浆液中的目标产物的分配系数较小，则可采用多步双水相萃取工艺以获得较高的纯化倍数。,（二）PEG循环,在大规模双水相萃取过程中，成相材料的回收和循环使用，不仅可以减少废水处理的费用，还可以节约化学试剂，降低成本。PEG的回收有三种方法：加入盐使目标产物转入富盐相来回收PEG；将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去PEG，再洗出蛋白质。超滤,（三

36、）无机盐的循环,一种方法使将含磷酸钠的盐相冷却到6，使盐结晶析出，然后用离心机分离收集；另一种方法是用电渗析法、膜分离法回收盐类。,二、大规模双水相萃取及其简单设备,两步萃取法连续分离胞内酶的流程示意图,第三节 双水相萃取技术在生物、食品工业中的应用,（1）提取酶和蛋白质。 （2）进行萃取性生物转化 （3）酸水解产物中提取二肽、氨基酸、核苷酸等风味物质 （4）萃取细胞、细胞器、膜等粒子 （5）应用于液液分配层析,双水相的应用举例分离和提纯各种蛋白质(酶） 用PEG/ -(NH4) 2SO4 双水相体系,经一次萃取从- 淀粉酶发酵液中分离提取 - 淀粉酶和蛋白酶, 萃取最适宜条件为PEG1000

37、 ( 15 %) -(NH4) 2SO4 (20 %) ,pH = 8 ,- 淀粉酶收率为90 % ,分配系数为19. 6 ,蛋白酶的分离系数高达15. 1。比活率为原发酵液的1. 5 倍,蛋白酶在水相中的收率高于60 %。,提取抗生素和分离生物粒子 采用PEG/ Na2HPO4 体系提取丙酰螺旋霉素，最佳萃取条件是pH= 8. 08. 5 ， PEG2000 (14 %) / Na2HPO4 (18 %) ,小试收率达69. 2 % ,对照的乙酸丁酯萃取工艺的收率为53. 4 %,第四节 双水相萃取分离技术的发展方向,一、开发廉价的新型双水相体系,例如：用粗dextran、变性淀粉、糊精、乙基羟乙基纤维素等取代葡聚糖（dextran ）,二、双水相分配与相关技术的集成化,集成化 ：不同分离技术上的相互渗透、实现优势互补，而达 到整体优化的目的。 具体表现3个方面：与常规技术结合解决双水相萃取本身的难点问题引进其他分离技术进行融合以提高分离效率，简化分离过程为已有的技术提供新的思路,实验（设计型）,设计一个PEG/磷酸盐的双水相体系，并从番木瓜中初步萃取木瓜蛋白酶。,思考题,名词解释：聚合物的不相容性；相图。双水相体系的是怎样形成的？其组成是什么？影响双水相萃取的因素有哪些？双水相萃取技术有什么优越性？,