第三章菌种选育课件.ppt

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1、第三章 菌种选育的理论与技术,微生物发酵制药工艺过程：,菌种,斜面培养,种子制备,发酵,发酵液预处理,提取精制,成品检验,成品包装,菌种选育,发酵工艺,提取工艺,微生物发酵工业化生产生物药物的三大环节：,发酵工艺,提取工艺,菌种选育,第一节 概述,一、菌种选育的目的（掌握）提高发酵产量改进菌种性能产生新的发酵产物去除多余的组分,青霉素：20IU/ml-85000IU/ml,青霉素产黄色素、土霉素产泡沫的消除,提高有用组分含量，方便纯化,二、菌种选育的基本理论,（一）遗传与变异（理解）菌种选育的最基本理论遗传：子代和亲代间的连续性，相似性的现象。变异：子代与亲代间的不连续性，差异性。基因型：一个

2、个体所具有的内在遗传基础表型：基因突变形成新的基因型在一定条件下表现出来的个体性状。意义：遗传性使高产菌株能够保留下来，供后人使用；变异性使诱变育种提高发酵水平得以施行。微生物菌种的遗传特性使菌种能够不断延续其后代，保持菌种稳定性。,本质：亲代的遗传基因传递给子代，使子代具有与亲代相同的基因，从而发育成相似的个体。,（二）遗传与变异的物质基础（了解）,物质基础：DNA,DNA中核苷酸的特定排列顺序，对遗传起决定作用。基因的产物为蛋白质或酶，基因的改变，导致相应蛋白质或酶的改变，从而引起生物体表型的变化。,脱氧核糖核酸（DNA），是染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。有时被称为“遗传微

3、粒”，因为在繁殖过程中，父代把它们自己DNA的一部分复制传递到子代中，从而完成性状的传播。,三联密码,（三）基因突变的本质与类型（了解）,基因突变的本质：DNA中核苷酸碱基的化学结构和排列顺序或数目发生变化，导致生物体表型改变。这种表型改变可稳定地一代代传递下去，也可称为遗传变异。,遗传变异的类型（熟悉）,一、自发突变二、诱发突变,微生物未经人为诱变处理或杂交等生物技术手段而自然发生地突变。原因：环境中存在低剂量的物理、化学诱变因素（宇宙紫外线、短波辐射、高温、病毒等）生长过程中，DNA复制过程中发生错误。微生物自身代谢过程中产生一些具有诱变作用的物质，如过氧化氢、硫氰化合物等。特点：速度慢，

4、时间长、突变频率低，一般为107109,一、自发突变：,二、诱发突变：,人为用化学、物理诱变剂（紫外线、亚硝酸等）去处理微生物而引起的突变。特点：速度快、时间短、突变频率高，一般大于104。,突变类型,按遗传变异后DNA结构发生改变的程度、突变又可分为基因突变、染色体畸变和染色体组突变。,1）基因突变：DNA结构发生较小的损伤，碱基发生变化，包括碱基置换（P37）：DNA链上的碱基序列中一个碱基被另一个碱基代替的现象。其中嘌呤（A和G）之间或嘧啶（T和C）之间发生的互换称转换。嘌呤和嘧啶之间的替换称颠换。移码突变（P38）：碱基序列中有一个或几个碱基增加或减少而产生的变异。易位突变（P38）：

5、DNA链上一个密码子中的某个碱基和临近密码子中的一个碱基对换，造成两个密码子编写的氨基酸都发生改变，从而引起突变。,2）染色体畸变：染色体结构的变化导致遗传信息的改变，具遗传效应。多数由于染色体受巨大损伤，使其断裂。根据断裂数目、位置、断裂端连接方式等的不同，可分为缺失（P38）：同一染色体上具有一个或多个基因的DNA片段丢失引起的突变。重复（P38）：在同一条染色体的某处增加一段DNA片段，使该染色体的某些基因重复出现产生突变。倒位（P38）：染色体受外来因素的破坏，造成染色体部分节段的位置顺序颠倒，极性相反。易位（P38）：同源染色体之间部分连接或交换。断裂后的一段染色体，加入到另一条非同

6、源染色体的某个位置中。3）染色体组突变：染色体数目的变化，可分为整倍体和非整倍体。,突变的过程,诱变剂与微生物细胞的作用：诱变剂与DNA的作用：DNA是否处在复制状态与其接触诱变剂后能否发生基因突变有密切关系。,3、突变体的形成：突变不一定形成稳定突变体，当突变发生后，只有经过复制，才能成为突变体。,突变的修复,DNA结构被改变后有两种可能：一种是突变的DNA分子在复制过程中克服了修复系统的作用而成为突变体；另一种是被修复系统修补后恢复原有DNA分子结构不能形成突变体。,用紫外线诱发微生物突变，主要效应是使DNA单链上的临近两个嘧啶碱基结合形成嘧啶二聚体。由于在二聚体的位置上碱基不能正常配对，

7、使DNA复制和RNA转录不能正常进行。由紫外线诱发损伤的修复，可分为光修复和暗修复,修复方式,1、光修复：细菌经紫外线照射后，再用可见光照射，突变率降低的现象称为光复活。酶促反应，光复活酶可以将单链的嘧啶二聚体分解成单体。2、切补修复（暗修复）：切除嘧啶二聚体使DNA分子修复。可先切后补或先补后切，修复过程在限制性内切核酸酶、外切核酸酶等的作用下进行。3、重复修复：指损伤的DNA经过复制后完成修复过程。4、SOS修复5、DNA聚合酶的校正作用,突变后的表型变化,由基因突变引起的变异，能否产生表型改变有如下几种情况：突变不改变遗传性状显性突变和隐性突变的表型效应：突变的表型与环境,表型延迟（理解

8、）,表型延迟（P41）：指微生物表型的改变总是落后于基因型改变的现象。产生原因诱变剂作用的延迟多核细胞中的单个核突变原有基因产物的影响。,多核细胞中，通过几代繁殖分裂，直到一个细胞中所有细胞核都含突变基因时，表型才会发生改变。,原来产生的酶起着支配野生型细胞表型的作用，几代繁殖后，酶浓度降低，才表现出突变基因的表型。,第二节 自然选育,自然选育：利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持或高于原有生产水平菌株的过程。以达到稳定和提高生产能力的目的。优点：简单易行缺点：效率低、进展慢以微生物的自然变异作为基础的生产选种机率并不很高，一个基因的自然突变频率

9、仅10-6-10-10左右。,自然选育的一般过程（重点）,生产菌种斜面制备单孢子（或细胞）悬浮液涂布平板、培养后挑取单菌落斜面种子培养摇瓶发酵高产菌株初选菌种保藏斜面种子培养摇瓶种子培养摇瓶发酵高产菌株复选高产菌株验证,作用：对菌种进行分离纯化，获得遗传背景较为纯一的细胞群体。,初筛,复筛,自然选育的操作方法,1、单孢子悬液的制备：无菌生理盐水或缓冲液、摇瓶。2、稀释及单菌落培养：梯度稀释（50200/ml），平板培养（1050/皿）3、单菌落传斜面：接种环挑取，每个单菌落传一只斜面4、摇瓶初筛：将斜面培养成熟后直接入发酵摇瓶中，发酵后测定发酵单位，初筛高产菌株。5、菌种保藏：挑选高产菌株保藏

10、6、摇瓶复筛：对初筛高产菌株的验证，挑选稳定高产菌株。采用二级发酵（种子摇瓶发酵摇瓶），重复35次。须以出发菌株作对照。7、放大试验：改进发酵条件，达到工业化生产要求。,第三节 诱变育种,诱变育种：利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群体，促进其突变率大幅提高，然后采用简便、高效的筛选方法，从中选出少数具有优良性状的突变菌株。优点：速度快、收效大、方法简单,诱变剂,类型：物理诱变剂、化学诱变剂、生物诱变剂物理诱变剂：物理辐射，如紫外线、X射线，激光、电磁波等化学诱变剂：一类能与DNA发生作用、改变其结构、并引起遗传变异的化学物质，常用包括碱基类似物、烷化剂、移码突变剂等。生物诱变剂：一

11、些能引起DNA结构改变，从而造成突变效应的生物体或生物分子。噬菌体、人工构建的质粒、转座子。,常用诱变剂（熟悉）,1、紫外线：有效波长：200300nm，15W紫外灯管诱变效果好。辐射剂量：灯管功率和距离固定时，剂量与照射时间成正比；照射剂量与杀菌率在一定范围成正比，高致死剂量（90-99%）、中等剂量（70-80%）,80%波长集中在253.7nm,出发菌株的培养,孢子悬液或菌悬浮液的制备,紫外线照射,后培养,稀释涂平板,诱变过程,2、亚硝基胍（NTG）黄色结晶，性质不稳定，遇光易分解；棕色瓶避光干燥保存。诱变作用极强，PH影响诱变效果，常用缓冲溶液配制。诱变处理方法：制备菌悬液配制NTG母

12、液NTG与菌体的作用NTG作用的终止稀释涂平皿3、硫酸二乙酯（DES）处理方法：同上终止处理：2%Na2S2O3溶液0.5ml4、亚硝酸：终止处理：pH8.6磷酸氢二钠缓冲液,生理盐水洗涤菌体，离心后重新制备菌悬液,13mg/ml、30120min、2632,新型诱变剂,激光、微波、离子注入、高能电子流,诱变的主要环节（重点）,（一）出发菌株的选择（二）诱变处理（三）突变株的筛选,（一）出发菌株的选择1、选择纯种菌株2、选择具有优良性状的菌株：产量高，产孢子早而多，色素少、生长速度快等。3、选择对诱变剂敏感的菌株4、选用多个出发菌株进行诱变收效较快,提高突变频率,（二）诱变处理（重点）,1、诱

13、变剂的选择：“量体裁衣”，不经常采用一种诱变剂反复处理，防止诱变效应饱和。2、诱变剂用量的选择：致死率高的剂量负变株多，但变异幅度大、效率高；中等剂量高产菌株出现率高，效率不高，速度慢。3、影响诱变效果的因素：菌种生理状态、被处理菌株的预培养和后培养条件、诱变处理时外界条件等。4、诱变的一般过程：单孢子悬浮液的制备诱变剂处理梯度稀释涂布分离平板,（三）突变株的筛选,筛选：将分离培养后的各型单菌落中性状优良、具有高发酵能力的突变菌株挑选出来过程。初筛：从大量菌株中发现有苗头的优良菌株，筛选量大，准确度要求不是很高。复筛：注重准确性和可重复性。一支菌种要接种35个发酵摇瓶，采用二级发酵，力求试验结

14、果准确可靠,筛选方法,1、随机筛选2、理性化筛选,1、随机筛选：随机挑选平板分离后的单菌落，从中筛选具有优良性状的菌株。（1）摇瓶筛选法（2）琼脂块筛选法,摇瓶筛选法,操作步骤,平板分离单菌落,接种斜面培养,摇瓶发酵,测定生物活性物质含量,高产菌株的筛选,初筛复筛,琼脂块筛选法,抗生素产生菌孢子悬液,诱变处理,涂布平板,打孔取单菌琼脂块，放入另一无菌空培养皿中,将琼脂块转移到生物鉴定平板上,12d,28、35d,通过抑菌圈的大小判定生物效价的高低，高效价的琼脂块，接种斜面培养基、摇瓶发酵筛选,抗生素高产菌株的筛选,2、理性化筛选：根据产物已知或可能的生物合成途径、代谢调控机制和分子结构设计的一

15、些筛选方法。打破微生物原有代谢调控机制，获得能大量形成发酵产物的高产突变株。,（1）初级代谢产物高产菌株的筛选,营养缺陷型突变株的筛选氨基酸结构类似物抗性突变菌株的筛选细胞膜透性突变株的筛选,初级代谢产物：与菌体的生长繁殖有密切关系的代谢产物，如氨基酸、核苷酸、维生素等小分子，以及蛋白质、多肽、核酸等大分子产物。,1、营养缺陷型突变菌株的筛选,营养缺陷型:诱变产生的缺乏合成某些营养物质的能力，须在基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。 野生型:与营养缺陷型对应的是野生型。,基本培养基(MM)： 能满足野生型菌株正常生长的培养基补充培养基(SM)：在基本培养基中加入相应的营养成分的

16、培养基完全培养基(CM)：能满足各种营养缺陷型生长的培养基,选育高产赖氨酸产生菌，可以筛选高丝氨酸的营养缺陷型突变菌株，由于突变株中高丝氨酸脱氢酶失活，不能合成高丝氨酸，使其全部用于赖氨酸的生物合成，有利于赖氨酸的合成。,天冬氨酸,天冬氨酰磷酸,天冬氨酰半醛,高丝氨酸,蛋氨酸,苏氨酸,丙酮酸,异亮氨酸,天冬氨酸激酶,反馈抑制,赖氨酸,高丝氨酸脱氢酶（HD）,争夺底物，解除反馈抑制,2、氨基酸结构类似物抗性突变菌株的筛选,氨基酸结构类似物：与某种氨基酸在化学结构上仅有微小差异的化合物。与氨基酸具有相似生物学功能，不能被菌体用来合成蛋白质。结构类似物：结构与代谢产物类似的化合物 特点：有反馈调节作

17、用 无正常生理功能,结构类似物抗性突变株的筛选,氨基酸类似物反馈阻遏或反馈抑制对应氨基酸的生物合成，使该种氨基酸产生菌不能在该平板生长。经诱变后，能在该培养基上生长的突变菌株解除了终产物的反馈调节，因而可以积累过量相应氨基酸。,基本培养基,加入氨基酸结构类似物,涂布氨基酸产生菌,解除了终产物反馈调节的突变菌株,3、细胞膜通透性突变株的筛选,微生物产生的代谢产物如果累积在细胞内的浓度高，容易产生反馈调节作用阻止这种代谢产物的继续合成。改变细胞通透性，使发酵产物大量分泌到胞外，可避免终产物的反馈调节。改变细胞的通透性可采用：油酸缺陷型突变株生物素缺陷型突变株,丧失合成油酸能力，形成渗漏型细胞,磷脂

18、合成受影响，改变细胞膜结构，提高细胞通透性。,（2）次级代谢产物高产菌株的筛选,营养缺陷型生物合成阻断变株的回复突变株去磷酸盐调节突变株（等）,次级代谢产物：与菌体的生长繁殖没有密切关系的一类代谢产物，如抗生素、色素、毒素、酶抑制剂等。,突变菌株高产基因的表达,突变株遗传特性改变，原有发酵条件已不适应新菌种的代谢需求，需对其培养条件作相应改变。对发酵培养基及发酵条件进行系统优化和筛选，可使高产基因在新的发酵条件下充分表达，进一步提高菌种的生产能力。,第四节 杂交育种,杂交育种（P60）：将两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状菌株的过程。,诱变育种长期

19、使用会使菌种产生诱变饱和现象，同时可能导致菌种生活能力下降等弊端。,各种微生物进行杂交的方式原核：转化 转导 接合 原生质体融合真核：有性杂交准性杂交 (parasexual hybridization),杂交的意义,遗传物质进行交换和重新组合，使两亲优良性状集中于重组体内，获得新品种。重组体可克服因长期诱变造成的生产力下降，代谢缓慢等缺陷，提高对诱变剂的敏感性。,基因重组,面包酵母:对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强，产生 CO2 多，生长快 酒精酵母:产酒率高而对麦芽糖、葡萄糖的发酵力弱 杂交:就得到了既能生产酒精，又能将其残余菌体用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种。,杂交过程：,两亲本菌株细胞间

20、接合染色体部分转移形成部分结合子交换、重组重组体的产生,接合：是细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质从供体菌转移给受体菌。,细菌的杂交育种,原理：通过供体向受体转移部分染色体，经过遗传物质交换，达到基因重组。细菌的遗传物质转移是单相、不可逆的，由供体菌转向受体菌。F因子（P61）：性因子，是一种质粒，存在于细胞中，是一种稳定的遗传物质，环状DNA双链结构，复制与染色体不同步。具有性因子的菌株为供体菌，具有性因子的细胞称为有性因子细胞F+，不具性因子的菌株为受体菌，称无性因子菌株F-。Hfr菌株：当供体菌的F因子整合到细胞染色体DNA上时，F菌株成为高度致育细胞，称Hfr菌株。,F+,环状染色

21、体,F因子,F-,Hfr,获得F因子,F因子与染色体结合,（二）细菌杂交过程与方法（理解）,杂交亲株的选择,亲本菌株遗传标记的确定,不同性别菌株的制备,重组体的形成,选择具有不同遗传特性的两个亲本菌株作为杂交亲本菌株。,通过诱变和选育使菌株带有一定遗传标记，常用：营养缺陷型和抗生素抗性标记,F菌株可用低浓度的丫啶橙处理F+菌株Hfr菌株可通过F和F菌株杂交获得。,细菌杂交方法,直接混合法将两个直接亲本菌株分别培养至对数期，移至新鲜肉汤培养液中振荡培养，以一定比例混合，37水浴缓慢振荡。亲本菌株间杂交。混合液稀释分离，选择性培养基上培养筛选。,放线菌的杂交育种,放线菌：原核生物，无完整细胞核结构

22、。有一条环状染色体核，以菌丝体形态生长，形成分生孢子。杂交原理：通过供体向受体转移部分染色体，经过遗传物质交换，达到基因重组。杂交方法：混合培养法平板培养法玻璃纸转移法,霉菌的杂交育种,真核微生物，可进行准性生殖。准性生殖：真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。包括三阶段：异核体的形成：在基本培养基上，接种两个营养缺陷型菌株，强制其互补营养。当具有不同性状的两个细胞或两条菌丝相互联结时，导致在一个细胞或一条菌丝中并存有两种或两种以上不同遗传型的核，这样的细胞或菌丝体叫做异核体。杂交双倍体的形成体细胞的重组,异核体菌丝繁殖过程中，偶尔发生两种不同遗传型核的融合，形成杂合细胞核。由于组成异核体的两个

23、亲本细胞核各具一个染色体组，所以杂合核是双倍体。,杂合双倍体在繁殖过程中发生染色体交换和染色体单倍化，形成各种分离子。这两个过程相对独立，总称体细胞重组。,第五节 原生质体融合育种（重点）,原生质体（P65）：微生物在酶的作用下，脱去细胞壁，剩下由原生质膜包围着的原生质部分。20世纪70年代以来，原生质体操作技术逐渐成熟，成为工业微生物育种的重要手段。,一、 原生质体的制备及影响因素（掌握）,制备：细菌、放线菌溶菌酶酵母菌、霉菌蜗牛酶、纤维素酶,影响因素（掌握）,培养基组成菌龄酶浓度酶解温度和pH酶解时间渗透压稳定剂,影响菌体生长和细胞壁对酶的敏感性,大多数微生物在对数生长期对溶菌酶作用最敏感

24、。,温度升高、酶解反应加快；温度过高、酶易失活一般：细菌3537；霉菌、酵母菌：2530 放线菌2832 pH57,酶解时间过长，再生率降低,高渗或等渗溶液中维持生存。细菌或放线菌：蔗糖、丁二酸钠；酵母菌：山梨醇、甘露醇；霉菌：氯化钠,酶浓度增加，原生质体形成率增大；过高使再生率降低；过低不利于原生质体形成,二、原生质体诱变育种,由于失去细胞壁，对外界环境的影响更加敏感。适宜时期：对数生长期适宜形态：单个分散细胞，,代谢旺盛、DNA复制活跃，易与诱变剂相互作用,与诱变剂接触面积大，诱变后易形成单菌落。,三、原生质体再生,原因：重新合成细胞壁，恢复完整细胞形态，使之进一步生长、分裂和增殖。,原生

25、质体再生是原生质体诱变、原生质体融合等技术处理细胞后，恢复微生物正常细胞形态的必经过程。,手段：再生培养基,影响原生质体再生因素,菌体的生理状态稳定剂酶的作用浓度及时间再生培养基的组成培养基中水分,年轻菌丝制备的原生质体再生能力强,维持高渗。1015蔗糖溶液、醇类、氯化钠等。,时间不宜过长、浓度不宜过高,通过试验确定最适培养基条件碳源种类和浓度、钙、镁离子浓度对再生率影响较大,再生培养基表面的水分应除去后，再涂布原生质体培养。,四、原生质体的融合,原生质体融合技术（P68）：把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂PEG和Ca+作用下，发生原生质体的融合，促使两亲本的遗传物质进行交换，从而实现

26、遗传重组。在适宜条件下，进行融合细胞的再生，获得具有新的遗传性状的重组菌株。,原生质体融合,原生质体融合的一般过程（重点）,遗传标记的选择两亲本原生质体的制备原生质体的融合再生融合子的选择,大多采用营养缺陷型或抗药性标记，或利用亲本菌株的颜色、色素等自身遗传标记更方便。,酶处理，注意酶解温度、时间及酶用量。,PEG融合、电融合,适合的再生培养基：高渗透压再生细胞壁形成完整细胞，恢复分裂繁殖能力,依靠两亲本的选择性遗传标记，在选择性培养基上，通过两亲本的遗传标记互补挑选出融合子。,本章小结,一、概述菌种选育的目的（P35）：菌种选育的基本理论：遗传和变异的物质基础：,提高产率、改进性能、产生新产

27、物、减少多余组分,遗传和变异、基因型和表型,DNA,遗传变异的类型（P37）（熟悉）自发突变:微生物未经人为诱变处理或杂交等生物技术手段而自然发生地突变。诱发突变:人为用化学、物理诱变剂（紫外线、亚硝酸等）去处理微生物而引起的突变。,原因：环境中存在低剂量的物理、化学诱变因素（宇宙紫外线、短波辐射、高温、病毒等）生长过程中，DNA复制过程中发生错误。微生物自身代谢过程中产生一些具有诱变作用的物质，如过氧化氢、硫氰化合物等。特点：速度慢，时间长、突变频率低，一般为107109,突变类型（P37）基因突变（碱基置换、移码突变、易位突变）、染色体畸变（缺失、重复、倒位、易位）、染色体组突变突变的过程

28、（P38）突变的修复：光修复、暗修复、重复修复、SOS修复、DNA聚合酶的校正作用。表型延迟（P41）：,诱变剂与微生物细胞的作用诱变剂与DNA的作用突变体的形成,指微生物表型的改变总是落后于基因型改变的现象。,产生原因诱变剂作用的延迟多核细胞中的单个核突变原有基因产物的影响。,二、自然选育（P41）,生产菌种斜面制备单孢子（或细胞）悬浮液涂布平板、培养后挑取单菌落斜面种子培养摇瓶发酵高产菌株初选菌种保藏斜面种子培养摇瓶种子培养摇瓶发酵高产菌株复选高产菌株验证,重点掌握自然选育流程和操作要点（P42-43）,三、诱变育种（P43）,诱变剂类型：物理诱变剂：紫外线、X射线化学诱变剂：碱基类似物、

29、烷化剂等生物诱变剂：噬菌体等常用诱变剂：紫外线、亚硝基胍、硫酸二乙酯、亚硝酸等诱变的主要环节： （一）出发菌株的选择：纯种、性状优良、敏感、几株（二）诱变处理：诱变剂品种、用量、诱变影响因素、操作（三）突变株的筛选筛选方法：随机筛选（摇瓶筛选法、琼脂块筛选法）、理性化筛选法,四、杂交育种（P61-63）概念、意义方法和过程五、原生质体融合技术（重点）原生质体概念原生质体的制备和影响因素原生质体诱变育种原生质体再生原生质体融合技术,课堂练习,名词解释：自发突变、诱变育种、F因子、原生质体填空：1、影响原生质体再生的因素有:_、_、_、_、 _。2、诱变的主要环节包括： _、_、_。3、诱变育种时常用诱变剂有： _、_、_。,4、诱变的一般过程包括：、四步骤。5、制备细菌的原生质体使用的酶是。6、突变的修复类型有_、_、_、_、_。简答：1、写出自然选育的流程和具体操作要点2、简述原生质体融合的一般过程,