第七章 微生物遗传课件.ppt

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1、Chapter 6 Microbial Genetics and mutations,微生物的遗传与变异,基本概念：Genotype 基因型：指某一个生物个体所含有的全部遗传因子（即基因组genome）所携带的遗传信息。Phenotype 表 型:：指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是其遗传型在合适环境条件下通过代谢和发育而得到的具体体现。Variation 变 异：指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变。Modification 饰 变：指一种不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。,微生物是遗传学研究的最好材料和对象,微生物结构

2、简单,营养体一般都是单倍体,微生物繁殖速度快,易积累不同的中间及最终代谢产物,环境条件对微生物作用直接均匀,存在多种方式的繁殖类型,微生物的变异易被识别,参与基因工程的载体供体受体三角色,内容提要,遗传的物质基础 基因突变和诱变育种 基因重组和杂交育种 基因工程 菌种的衰退复壮和保藏,第一节 遗传的物质基础,三个经典实验证明核酸是微生物遗传物质,转化实验,噬菌体感染实验,植物病毒的重建实验,遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式,转化实验,材料,方法,动物实验,细菌培养实验,S型菌无细胞抽提液试验,转化实验（1）动物实验,转化实验（2）细菌培养实验,转化实验（3）S型菌无细胞抽提液试验,大量R

3、菌落+少量的S菌落,S菌落,噬菌体感染实验,2、步骤,1：用含同位素35, P32的培养基培养大肠杆菌,4、结果：上清液中含15%放射击性；沉淀中含85%放射性,2：让T2感染上述大肠杆菌使其打上S35P32标记,3、,上清液,沉 淀,结果：上清液中含85%放射击性；沉淀中含15%放射性,植物病毒的重建实验,植物病毒蛋白质和RNA可以人为地分开,同时又可把它们重新组合成具感染性的病毒.,甲乙r 感染症状同甲病毒；分离得到甲病毒,乙甲r 感染症状同乙病毒；分离得到乙病毒,原始株 拆开 重建 感染 分离纯化,植物病毒的重建实验,基因是什么?,基因是生命的密码,基因记录和传递遗传信息,基因决定生物体

4、的生、长、病、老死等一切生命现象,基因是一段DNA,DNA就是脱氧核糖核酸（长链）,腺嘌呤（A）,鸟嘌呤（G）,胸腺嘧啶（T）,胞嘧啶（C）,A,T,C,G,A,A,A,T,T,T,T,T,T,A,A,A,G,G,G,G,G,C,C,C,C,C,G,C,基因测序就是读出 A-C-G-T-G-G-A-C-G.,细菌的结构基因,遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式,（一）遗传物质在7个水平上的形式1、细胞水平2、细胞核水平3、染色体水平4、核酸水平5、基因水平6、密码子水平7、核苷酸水平,1、细胞水平真核微生物：细胞核原核微生物：核区细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的,2、细胞核水平真核

5、生物 细胞核 核染色体原核生物 核区 DNA链,核基因组,在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质,3、染色体水平染色体是由组蛋白与DNA构成的线状结构染色体的数目在不同的生物中是不同的染色体的倍数在同一生物的不同生活时期是不同的,4、核酸水平核酸种类：DNA，RNA核酸结构：双链、单链； 环状，线状，超螺旋状DNA长度：因种而异,微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力的手段。,5、基因水平,6、密码子水平,7、核苷酸水平核苷酸是最小突变单位和交换单位,（二）微生物基因组结构的特点,1、原核生物（细菌、古生菌）的

6、基因组,1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；2）基因组上遗传信息具有连续性； 基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数 一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。 3）功能相关的结构基因组成操纵子结构； 4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝； 5）基因组的重复序列少而短； 个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌)和古生菌的 rRNA和tRNA中也发现有内含子或间插序列,2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组,1）典型的真核染色体结构； 啤酒酵母基因组大小为13.5106bp， 分布在16条染色体中。 2）没有明显的操纵子结构；3）有间隔区（即非编码区）和内含子序列； 4）重复序列

7、多。,Plasmid 质粒,原核生物遗传物质存在的另一种方式,质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。,种类,F因子 与有性接合有关,R因子 与抗药性有关,CoL 编码细菌素,Ti质粒 诱癌质粒,降解质粒：编码降解有害物质的酶,质粒在基因工程中的应用质粒的优点：（1）体积小，易分离和操作（2）环状，稳定（3）独立复制（4）拷贝数多（5）存在标记位点，易筛选,E. coli的pBR322质粒是一个常用的克隆载体,（1

8、）致育因子(Fertility factor，F因子),又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。,携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。,F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为附加体(episome)。,（2）抗性因子（Resistance factor，R因子）,包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。,R质粒,抗性转移因子（RTF）：转移和复制基因抗性决定因子：抗性基因,R100质粒(

9、89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：汞（mercuric ion ，mer）四环素（tetracycline，tet ）链霉素(Streptomycin, Str)、磺胺(Sulfonamide, Su)、氯霉素(Chlorampenicol, Cm)、夫西地酸（fusidic acid，fus）并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。,（3）产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）,一般都位于质粒或转座子上，因此，细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。,细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：大肠杆菌（E. coli）产生的细菌素为col

10、icins（大肠杆菌素），而质粒被称为Col质粒。,细菌素结构基因涉及细菌素运输及发挥作用的蛋白质的基因赋予宿主对该细菌素具有“免疫力”的相关产物的基因,（4）毒性质粒（virulence plasmid）,许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。,产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒。,苏云金杆菌含有编码内毒素(伴孢晶体中)的质粒,根癌土壤杆菌所含Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子,Ti质粒中的T-DNA可携带任何外源基因整合到植物基因组中，是植物基因工程中有

11、效的克隆载体,（5）代谢质粒（Metabolic plasmid）,质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。,将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。,降解质粒：,假单胞菌：具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、农药(2,4dichlorophenoxyacetic acid)、辛烷和樟脑等的能力。,（6）隐秘质粒（cryptic plasmid）,隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。 它们存在的生物学意义，目前

12、几乎不了解。,在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体（一般加上抗性基因）,第二节 基因突变和诱变育种,一、基因突变 一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，可遗传、自发或诱变产生。,基因突变 突变与育种,突变类型 突变率 突变的特点 诱变机制,条件致死突变型（株）,突变类型,突变株的表型,选择性突变株,非选择性突变株,营养缺陷型（株）,抗性缺陷型（株）,形态突变型（株）,抗原突变型（株）,产量突变型（株）,按方法分：按突变株的表型是否能在选择 性培养基上加以鉴别来区分。,突变率,突变的特点（证明）,不对应性,自发性,稀有性,独立性,诱变性,稳定性,可逆性,基因突变的自发性和突变

13、结果与原因不对 应性的证明三个经典实验 变量试验（Fluctuation test） 涂布试验（Newcombe experiment） 平板影印培养试验（Replica plating）,(在同一个大管中作整体培养),3 7 1 4 4 3 5,抗噬菌体菌落数 抗噬菌体菌落数,变量试验,Fluctuation test,Newcombe experiment 涂布试验,影印培养试验,Replica plating,诱变机制,移码突变,染色体畸变,碱基的置换,碱基的置换,直接引起置换的诱变剂,间接引起置换的诱变剂,碱基的置换,T：烯醇式,5-BU:酮式,5-BU:烯醇式,碱基的置换,间接引起置

14、换的诱变剂,碱基的置换,烯醇式,酮式,移码突变,分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起,造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误,增添一个碱基,缺少一个碱基,染色体畸变,某些理化因子，如射线，紫外线， 亚硝酸等，除能引起点突变外，还会引起DNA分子的损伤，包括染色体易位，倒位，缺失，重复等，即为染色体畸变。,染色体畸变的机制,紫外线诱变作用机理,可使链裂断，破坏核糖和磷酸间的键联,引起胞嘧啶和尿嘧啶产生水合作用造成氢键断裂,能使胸腺嘧啶成二聚体，使结构发生改变,紫外线损伤后修复,可移动遗传因子（Transposable element） 插入序列（Insertion sequence IS）

15、 转座子（Transposon Tn） Mu噬菌体（Mutator phage),插入序列（IS）和 转座子（ Tn）,自发突变（spontaneous mutation）及其原因 DNA复制 微生物自身产生诱变物质 环境对微生物的诱变作用突变热点：指同一基因内部突变频率特别高的位点。,定向育种：在一特定条件下，长期培养某一微生物菌群，通过不断转接传代以积累其自发突变，并最终获得优良菌株的过程。,诱发突变（induced mutation） 物理因素紫外线（ultraviolet light）X射线和射线 化学因素碱基结构类似物与核酸上碱基起化学反应的诱变剂移码诱变剂,诱变育种（breedin

16、g by induced mutation） 指通过人工方法处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的突变株的过程。在此过程中，诱变和筛选是两个主要环节。,诱变育种的基本环节,诱变育种的基本原则选择简便有效的诱变剂挑选优良的出发菌株处理单细胞或单孢子悬液选用最适的诱变剂量充分利用复合处理的协同效应利用和创造形态、生理与产量间的相关指标设计高效筛选方案创造新型筛选方法,突变株的筛选方法,高产突变菌株的筛选方法,抗性突变体的筛选方法,营养缺陷型的的筛选方法,与突变株的筛选相关的几个概念,与突变株的筛选相关的几个概念,相关培养

17、基,基本培养基 -,完全培养基,补充培养基,三类遗传型,野生型 A+B+,营养缺陷型型A+B-,原养型 A+B+,基本培养基：仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的组合培养基。完全培养基：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。补充培养基：凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基。,高产突变株的筛选,琼脂块培养法筛选 春日霉素高产菌种,抗性突变体的筛选方法,青霉素浓缩法,梯度培养皿法,青霉素筛选法,梯度培养皿法,含异烟肼,接敏感菌含突变株,营养缺陷型的筛选办法,诱变剂处理,淘汰野生型,检出缺陷型,夹层培养法,限量补充培养法,逐渐检出法,影印接种法,

18、鉴定缺陷型,夹层培养法及结果,逐个检出法,影印接种法,限量补充培养法,微量蛋白质的完全培养基上 小菌落是营养缺陷型突变株,菌丝 过滤法筛选营养突变株,第三节 基因重组和杂交育种 细菌基因转移的三种形式 转化（transformation） 转导（transduction） 接合（conjugation）共同点：基因转移导致遗传重组。不同点：获取外源DNA的方式不同。,转化(Transformation),几个概念：转化、转化因子、感受态,转化过程,转化的特点,转 化 (transformation),受体细胞直接吸收了来自供体细胞的DNA片断，并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变

19、化的现象叫转化。,供体菌,DNA片段,受体菌,转化因子,转化是游离的片断的转移和重组,游离的片断叫转化因子,转化因子由供体提供,自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生，,实验室里通过提取获得,双链有转化能力，单链没有,受体细胞能接受转化的生理状态称为感受态，只有处于感受态的细菌才能接受转化因子，从出现到消失约为分钟(对数期的中期),感受态,感觉态出现原因,细菌失去部分细胞壁的结果,细菌在细胞表面产生某种引起,每个受体细胞表面约有30 -80个转化因子结合点，当转化因子结合到受体表面结合点上时，DNA一条链被受体细胞膜上的核酸酶分解，另一条链进入受体细胞，通过整合与受体细胞进行基因重组，有人发现DN

20、A也可通过双链形式进入受体细胞形成双倍体的转化子。,转化过程,细菌的转化,转化机制,核酸酶,DNA结合蛋白,感受态特异蛋白,细菌的转化,用DNA片段的转化,用质粒的转化,转化过程的特点：a）对核酸酶敏感；b）不需要活的DNA供体细胞；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化供体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系； d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多。,转导的种类,遗传物质通过噬菌体的携带而转移的基因重组,转导的发现,Transduction 转导,转导的特点,完全普遍转导,流产普遍转导,降解,普遍性转导,局 限 性 转 导,转导的特点,需要噬菌体做媒介，不需要细胞间直接接触,噬菌体D

21、NA不接合到寄主染色体,噬菌体蛋白质包裹寄主任何一部分DNA片段,噬菌体DNA整合到寄主染色体上,噬菌体DNA与寄主染色体特定基因发生交换,普遍性转导,局限性转导,溶源转变,温和噬菌体的基因整合到宿主核基因组上的现象,温和噬菌体并不携带外源供体菌的基因,这种温和噬菌体是完整的，而不是缺陷的,获得新性状的是溶源化的宿主细胞，而不是转导子,获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失,接合及其发现,因子和接合,接合(Conjugation),雄性菌株与雌性菌株接合结果,接合及其发现,通过细胞间的直接接触能进行大段的转移的过程，叫接合,U型管实验表明，通过接合发生的遗传重组，需要细菌间直接的物理连接。,因子

22、和接合,雄性菌株与雌性菌株接合结果,细菌接合作用的机制,FF-,HfrF-,Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。,Hfr F-杂交,Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leading region)结合着染色体DNA向受体细胞转移。F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中。HfrF-杂交后的受体细胞(或

23、接合子)大多数仍然是F-。,F接合作用,三者根本区别在于DNA转移的方式不同,转化：供体DNA片断注入受体细胞，通过细胞膜,接合：供体进入受体通过性纤毛,转导：供体DNA片断通过媒介噬菌体携带进入受体,真核微生物的基因重组,真核微生物的基因重组的方式有性杂交：一般指性细胞之间的结合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。准性杂交：同种生物的两个不同的体细胞发生融合，以有丝分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子的杂交方式。,准性生殖（parasexual hybridization）,存在范围：常见于某些真菌，尤其是半知菌基本过程： 菌丝连接 形成异核体 核融合 体细胞交

24、换Penicillium urticae的准性生殖育种过程 选择亲本：（用营养缺陷型作为遗传标记） 强制异合：（用基本培养基筛选形成异核体的细胞和杂合二 倍体细胞） 移单菌落：（将在基本培养基上生长的单菌落移种到基本培养基斜面上） 选择重组体：（ 采用各种选择培养基选择不同的融合子）,第四节 微生物遗传变异的应用 诱变育种 原生质体融合育种 基因工程,原生质体融合育种原生质体融合（protoplast fusion） 通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。,原生质体融合育种的优越性打破了微生物的种属界限，可以实现远 缘间菌株的基

25、因重组。可使遗传物质传递更为完整、获得更多基因重组体的机会，有利于提高育种速度。借助聚合剂可同时将几个亲本的原生质体随机融合在一起，从而获得几个亲本性状的重组体，加速育种进程。可与其他育种方法相结合，将二者所获得的优良性状进行融合。,原生质体融合技术及育种步骤,原生质体的制备原生质体再生原生质体融合融合子的检出与鉴定,原生质体再生 去壁后的原生质体能重建细胞壁，恢复细胞完整形态、并能生长、分裂的过程。,基因工程（gene engineering、gene technology）又称遗传工程（genetic engineering） 利用分子生物学的理论和技术，自觉设计、操纵、改造和重建细胞的遗

26、传核心基因组，从而使生物体的遗传性状发生定向变异的体外DNA重组技术。,获得目的基因选择基因载体体外重组外源基因导入（细菌、植物、动物、基因枪）筛选和鉴定应用,基因工程的基本操作,复制子限制性内切酶位点 选择性遗传标记可大量增殖,载体的特性,常用载体,原核受体细胞： 松弛型细菌质粒、噬菌体真核细胞受体： SV40病毒（动物）、Ti质粒（植物）,第五节 菌种退化、复壮与保藏,性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异 b）污染 c）死亡,几个概念菌种退化（degeneration）：指群体中退化细胞在数量上占一定数值后表现出菌

27、种生产性能下降的现象。菌种复壮：采取一定的措施，使退化的群体中保持原有菌种特性的细胞生长、繁殖以更新退化菌株的过程。,一、菌种的衰退与复壮,菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变,纯菌种,自发突变,不纯菌种,突变个体,传代增殖,原始个体,衰退菌种,衰退：菌种出现或表现出负变性状,1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。 a）纯种分离； b）通过寄主体进行复壮；,2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。,菌种的复壮：,二、防止衰退的措施1）减少传代次数；2）创造良好的培养条件；3）利用单核体传代4）经常进行纯种分离，

28、并对相应的性状指标进行检查；5）采用有效的菌种保藏方法；,菌种保藏的原理 人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。人工环境主要从低温、干燥、缺氧三方面设计。,三、菌种保藏,目 的：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，以供研究、生产、交换之用,基本原则：1、挑选典型菌种的优良纯种 2、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体 3、创造有利于休眠的保藏环境 4、尽可能多的采用不同的手段保藏一 些比较重要的微生物菌株,菌种保藏的原理： 人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。人工环境主要从低温、干燥、缺氧三方面设计。,基本方法,培养基传代培养（斜面、平板）,寄主传代培养,低温（液氮、低温冰箱）,干燥（沙土管、真空干燥）,生活态休眠态,