植物细胞组织培养 课件.ppt

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1、02.12.2022,1,第一章 绪 论,讲授内容 第一节 植物组织培养的一般概念 第二节 植物组织培养的发展 第三节 植物组织培养的应用,02.12.2022,2,第一节 植物组织培养的一般概念,02.12.2022,3,一、植物细胞组织培养的概念（P1）, 植物细胞组织培养（Plant Cell and Tissue Culture）：是指在离体（in vitro）条件下利用人工培养基（medium）对植物器官、组织、细胞、原生质体等进行培养，使其长成完整的植株。 通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体explant），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）

2、进行培养，使其产生完整植株的过程。,02.12.2022,4,主要有:原生质体（Protoplast）培养悬浮细胞培养组织（愈伤组织Callus、茎尖分生组织）培养器官（胚，花药，子房，根和茎）培养其中最常见的是愈伤组织培养。,02.12.2022,5,（广义）又叫离体培养：指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。,（狭义）组织培养：指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植

3、物。,植物细胞组织培养范畴：,02.12.2022,6,原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在植物体切面上产生。,愈伤组织（callus）,02.12.2022,7,外植体（explant）：在植物细胞组织培养中，由活体（in vivo）植物体上取下来的，接种在培养基上无菌细胞、组织器官等用于离体培养的材料。,02.12.2022,8,二、植物组织培养的分类,固体培养,液体培养,1. 培养基,固体培养,液体培养,02.12.2022,9,二、植物组织培养的分类,植株培养器官培养组织培养细胞培养原生质体培养,2、组织培

4、养按培养对象可分为 （外植体）,02.12.2022,10,1. 植株培养(plant culture)：对完整植株材料的培养。,种子苗培养,扦插苗培养,02.12.2022,11,2. 器官培养(organ culture): 即离体器官的培养。,器官培养,根系培养,茎段培养,花器培养,果实培养,种子培养,叶片培养,根据作用和需要的不同，可以包括分离茎尖、茎段、根尖、叶片、叶原基、子叶、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果实等外植体的培养。,02.12.2022,12,3. 组织或愈伤组织培养(tissue，callus culture) ：是对植物体的各部分组织进行培养，如茎尖分生组织、形

5、成层、木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄壁组织等等；或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形成植株.,组织培养,分生组织培养,薄壁组织培养,输导组织培养,02.12.2022,13,4. 细胞培养(cell culture)：是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较好分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养.,细胞培养,看护培养,平板培养,悬浮培养,微室培养,02.12.2022,14,5. 原生质体培养(proplast culture)：是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。,原生质体培养,非融合培养,融合培养,02.12.2022,15

6、,三、植物组织培养的生理依据,细胞全能性(cell totipotency)：植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。植物细胞的再生性是指在植物中很多是靠种子生长来产生完整的植株，但也有不少可通过根、茎、叶等器官再生而成为完整的植株的特性。,02.12.2022,16,三、植物组织培养的生理依据,植物生长调节物质对于植物细胞组织的分化和决定具有关键性作用。它包括：生长素类、细胞分裂素类、赤霉素、脱落酸、乙烯等生长素类主要用于愈伤组织的形成，体细胞胚的产生及试管苗的生根。常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAA等。其作用强弱为2,4-DNAAIBAIAA。

7、细胞分裂素类则有促进细胞的分裂与分化，延迟组织的衰老，促进芽的产生等作用。常用的有Zip(异戊烯腺嘌呤)、KT、6-BA、ZT等作用强弱顺序为。ZipKT6-BAZT。赤霉素则有促进已分化的芽伸长生长，打破种子休眠的作用。常用的为GA3。,02.12.2022,17,植物细胞全能性（Cellular totipotency）： 任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植珠所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。 （Haberlandt, 1902）,四、植物组织培养的原理,02.12.2022,18,细胞全能性证实？,胡萝卜根韧皮部细胞,悬浮培养,体细胞胚,完整小植株,证实,全能性

8、,1958年，Steward和Shantz,诱导,02.12.2022,19,1.分化（differentiation）: 细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在个体发育中形成各类组织和器官完成整个生活周期。,02.12.2022,20,2.脱分化(dedifferentiation): 在细胞组织培养中，一个成熟细胞或分化细胞转变恢复分生能力成为分生状态的过程，即形成愈伤组织的过程。3.再分化(redifferentiation): 植物的成熟细胞经历了脱分化后，即形成愈伤组织能再形成完整的植株，这一过程叫做脱分化。,02.12.2022,21,02.12.2022,22,5.初代培

9、养：,芽、茎段、叶片、花、器官等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体过程,02.12.2022,23,6.继代培养： 更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织、芽）。,02.12.2022,24,7.生根培养：将芽苗转接到生根培养基上培养成为完整植株的过程。,02.12.2022,25,8.驯化移栽：组培苗经人工炼苗后移栽到驯化苗床上使之适应露地或保护地条件的过程。,02.12.2022,26,绪 论,组织培养技术的蓬勃发展只是近50年的事，但它的整个历史可以追溯至19世纪末和上世纪初。,第二节 植物细胞组织培养发展简史,02.12.2022,27,第二节 植物组织培养

10、发展简史,植物组织培养与细胞培养开始于19世纪后半叶，当时植物细胞全能性的概念还没有完全确定，但基于对自然状态下某些植物可以通过无性繁殖产生后代的观察，人们便产生了这样一种想法即能否将植物体的一部分在适当的条件下培养成一个完整的植物体，为此许多植物科学工作者开始了培养植物组织的尝试。,02.12.2022,28,第二节 植物组织培养发展简史,19世纪30年代，德国植物学家施莱登(M.J.Schleiden，18041881)和德国动物学家施旺(T.Schwann,18101882)创立了细胞学说： 细胞是有机体， 一切动植物都是由单细胞发育而来， 即生物是由细胞和细胞的产物所组成； 所有细胞在

11、结构和组成上基本相似； 新细胞是由已存在的细胞分裂而来； 生物的疾病是因为其细胞机能失常。 根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。 对组织培养技术的诞生起到了极大的推动作用。,02.12.2022,29,第二节 植物组织培养发展简史,植物组织培养发展简史可划分为三个阶段：,一、探索阶段,二、奠基阶段,三、迅速发展阶段,02.12.2022,30,第二节 植物组织培养发展简史,一、探索阶段（上世纪初至上世纪30年代中） 1902年德国著名的植物生理学家和植物学家哈伯兰特（Haberlandt） 在Schleiden和Schwann的细胞学说的推动下，提出了

12、高等植物细胞全能性理论。它是植物组织培养的理论依据，对植物组织培养的发展起了先导作用。 植物细胞全能性的理论：即植物的体细胞，在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的潜在能力。,02.12.2022,31,1904年，Hanning培养萝卜和辣根菜的胚成功； 1912年，Haberlandt的学生科特（Kotte）和美国的罗布林（Robins）在根尖培养中获得了组织培养的成功。Kotte采用了无机盐、葡萄糖、蛋白胨、天冬酰胺，及添加各种氨基酸的培养基。Robins用含无机盐、葡萄糖或果糖的琼脂培养基，培养了长度为1.45-3.75cm的豌豆、玉米和棉花的茎尖，形成了一些缺绿的茎和根

13、。 Laibach（1925,1929）亚麻种间杂种胚培养成功，证明胚培养在植物远缘杂交上可利用；,第二节 植物组织培养发展简史,02.12.2022,32,第二节 植物组织培养发展简史,二、奠基阶段（30年代中至50年代末） 1934年美国的怀特（White）由番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，并反复转移到新鲜培养基中继代培养，使根的离体培养实验获得了真正的成功，并在以后28年间培养了1600代。 之后，White又以小麦根尖为材料，研究了光、温度、通气、pH值、培养基组成等各种培养条件对生长的影响，并于1937年建立了第一个组织培养的综合培养基，其成分均为已知化合物，包括3种B族维生

14、素，即吡哆醇、硫胺素和烟酸，该培养基后来被定名为White培养基。,02.12.2022,33,第二节 植物组织培养发展简史,与此同时，高特里特（Gautheret） (1934)在研究山毛柳和黑杨等形成层的组织培养实验中，提出了B族维生素和生长素对组织培养的重要意义，并于1939年连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。同年，White由烟草种间杂种的瘤组织， 诺比考特（Nobecourt）由胡萝卜均建立了与上述类似的连续生长的组织培养物。,02.12.2022,34,因此，Gautheret，White和Nobecourt一起被誉为组织培养学科的奠基人。我们现在所用的培养方法和培养基，基本上都

15、是由这三位科学家建立的。他们三人的贡献在于：一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素是一种天然的生长调节物质。后来，White于1943年发表了植物组织培养手册专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。,第二节 植物组织培养发展简史,02.12.2022,35,第二节 植物组织培养发展简史,40年代斯库克（Skoog）和崔澂在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中发现，腺嘌呤或腺苷可以解除培养基中生长素(IAA)对芽形成的抑制作用，而能诱导形成芽，从而明确了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。即细胞分裂素与生长素比例高时，产生芽；这一比例低时，则形成根；相等

16、则不分化，形成愈伤组织。 器官分化的植物激素控制理论,02.12.2022,36,第二节 植物组织培养发展简史,50年代开始以后，组织培养研究日趋繁荣，10年当中引人注目的进展主要有7项：,1952年，莫雷尔（Morel）和马丁（Martin）通过茎尖分生组织的离体培养，从已受病毒侵染的大丽花中首次获得无病毒植株；,02.12.2022,37,第二节 植物组织培养发展简史,1953-1954年缪尔（Muir）把单细胞放在一张铺在愈伤组织上面的滤纸上培养，使细胞发生了分裂，即实施了看护接种技术，使单细胞培养获得初步成功。 1955年米勒（Miller）等人发现了激动素（kinetin）。不久即知

17、道激动素可以代替腺嘌呤促进发芽，并且效果可增加3万倍。,02.12.2022,38,第二节 植物组织培养发展简史,1957年，Skoog和Miller提出植物激素控制器官形成的概念；上述控制器官分化的激素模式变为激动素与生长素的比例关系。这方面的成功发现，有力地推动了植物组织培养的发展。,02.12.2022,39,第二节 植物组织培养发展简史,1958年，美国植物学家斯图尔德（Steward）等人，用胡萝卜根韧皮部的细胞进行培养，得到了完整植株，并且这一植株能够开花结实，首次证实了Haberlandt在五十多年前关于细胞全能性的预言；1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细

18、胞分裂素CTK可促成在顶芽存在的情况下打破腋芽的休眠后来，Murashige利用这一方法发展了快繁技术，广泛的应用于植物的快速繁殖。,02.12.2022,40,第二节 植物组织培养发展简史,综上所述，在这一发展阶段中，通过对培养条件和培养基成分的广泛研究，特别是对B族维生素、生长素和细胞分裂素在组织培养中作用的研究，已经实现了对离体细胞生长和分化的控制，从而初步确立了组织培养的技术体系，为以后的发展奠定了基础。,02.12.2022,41,第二节 植物组织培养发展简史,三、迅速发展阶段1960年，科金（Cocking）开创植物原生质体培养和体细胞杂交研究工作。（用真菌纤维素酶从番茄幼根分离得

19、到活性原生质体）；同年，Kanta植物试管受精首次成功。1960年，Morel提出了一个茎尖离体无性繁殖兰花的方法迅速建立起兰花工业；,名贵兰花春日飘香,02.12.2022,42,第二节 植物组织培养发展简史,1962年，Murashige和Skoog发表了促进烟草组织快速生长的培养基组成MS培养基；1964年印度固哈（Guha）和马海舒瓦瑞（Maheshwari）成功地在毛叶曼陀罗花药培养中，由花粉诱导得到单倍体植株，从而促进了花药和花粉培养的研究；以后相继在烟草、水稻、小麦、玉米、番茄、辣椒、草莓、苹果等多种植物培养中获得成功，其数目达到160多种，其中烟草、水稻和小麦等的花药育种培养在

20、中国取得了引入注目的成就。,02.12.2022,43,第二节 植物组织培养发展简史,1971年，Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株，这不仅在理论上证明了无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上为外源基因的导入提供了理想的受体材料。80年代中期以来，对禾谷类作物的原生质体培养也相继告捷，在这方面中国学者做出了重要贡献。,1973年Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体融合，获得了第一个体细胞杂种，Cocking等倡导的原生质体培养和体细胞杂交，研究得到了迅速发展，已经能使矮牵牛和烟草属的杂种细胞增殖分化生成杂种植株。,02.12.2022,44,第二节 植物组织培养发展

21、简史,（1）微繁技术广泛应用,（2）花药培养取得显著成绩,（3）原生质体培养取得重大突破,概括起来，这一阶段的成就体现在：,（4）基础研究,02.12.2022,45,第二节 植物组织培养发展简史,在整个植物组织培养发展的历史中，我国学者做出多方面的贡献，除了前述的崔徵的研究成效以外，还有1993年李继侗和沈同研究银杏的胚培养，将银杏胚乳的提取物加入培养基，获得成功；1993年李继侗等关于玉米等植物离体根尖培养的研究工作，以及罗士韦关于幼胚和茎尖培养，李正理关于离体胚的研究培养、王伏雄等关于幼胚的研究培养工作。,02.12.2022,46,绪 论,第三节 植物组织培养的应用,植物组织培养成为生

22、物科学的一个广阔领域，除了在基础理论的研究上占有重要地位以外，还在农业生产中也得到越来越广泛的应用。,02.12.2022,47,第三节 植物组织培养的应用,一、农业上的应用1. 快速繁殖种苗(rapid propagation) 用组织培养的方法进行快速繁殖是生产上最有潜力的应用，包括花卉观赏植物、蔬菜、果树、大田作物及其他经济作物。快繁技术不受季节等条件的限制，生长周期短，而且能使不能或很难繁殖的植物进行增殖。,02.12.2022,48,母株（完整）外植体（母株的一小部分，种子亦可）接种到培养基上长芽（继代增殖）长根（试管外生根亦可）练苗，驯化完整植株,微（快）繁步骤（microprop

23、agation）,02.12.2022,49,第三节 植物组织培养的应用,快速繁殖可用下列手段进行：1.通过茎尖、茎段、鳞茎盘等产生大量腋芽；2.通过根、叶等器官直接诱导产生不定芽；3.通过愈伤组织培养诱导产生不定芽。,02.12.2022,50,试管快速繁殖应用在下列生产或研究中：(1)繁殖杂交育种中得到的少量杂交种，以及保存自交系、不育系等。(2)繁殖脱毒培养得到的少量无病毒苗。(3)繁殖生产上急需的或种源较少的种苗。 由于组织培养周期短，增殖率高及能全年生产等特点，加上培养材料和试管苗的小型化，这就可使有限的空间培养出大量的植物，在短期内培养出大量的幼苗。,第三节 植物组织培养的应用,0

24、2.12.2022,51,2.无病毒苗(virus free)的培养 植物在生长过程中几乎都要遭受到病毒病不同程度的危害，有的种类甚至同时受到数种病毒病的危害，尤其是很多园艺植物靠无性方法来增殖，若蒙受病毒病，代代相传，越染越重，甚至会造成极严重的后果。,第三节 植物组织培养的应用,02.12.2022,52,第三节 植物组织培养的应用,自从Morel l952年发现采用微茎尖培养方法可得到无病毒苗后，微茎尖培养就成为解决病毒病危害的重要途径之一。若再与热处理相结合，则可提高脱毒培养的效果。对于木本植物，茎尖培养得到的植株难以发根生长，则可采用茎尖微体嫁接的方法来培育无病毒苗。,02.12.2

25、022,53,第三节 植物组织培养的应用,组织培养无病毒苗的方法已在很多作物的常规生产上得到应用。如马铃薯，甘薯，草莓，苹果，香石竹，菊花等。而且已有不少地区建立了无病毒苗的生产中心，这对于无病毒苗的培养、鉴定、繁殖、保存、利用和研究，形成了一个规范的系统程序，从而达到了保持园艺植物的优良种性和经济性状的目的。,02.12.2022,54,3. 在育种上的应用(breeding) 植物组织培养技术为育种提供了许多手段和方法，使育种工 作在新的条件下更有效的进行。,第三节 植物组织培养的应用,1.倍性育种，缩短育种年限，杂种优势明显。,2.克服远缘杂交的不亲合性和不孕性（胚培养）,3.保存种质,

26、02.12.2022,55,第三节 植物组织培养的应用,例如： 用花药培养单倍体植株； 用原生质体进行个体细胞杂交和基因转移； 用子房、胚和胚珠完成胚的试管发育和试管受精，以及种质资源的保存等等。,02.12.2022,56,4. 工厂化育苗(industrializing propagation) 近年来，组织培养育苗工厂化生产已作为一种新兴技术和生产手段，在园艺植物的生产领域蓬勃发展。,第三节 植物组织培养的应用,02.12.2022,57,第三节 植物组织培养的应用,（ 1 ）工厂化育苗含义：是指以植物组织培养为基础，将外植体接种在人工配制的培养基上，通过控制环境条件，使细胞脱分化、再分

27、化成新的组织、器官，进而培育出与母株一样的批量幼苗的方法。例如：非洲紫罗兰组织培养育苗的工厂化生产。,（ 2 ）特点：繁殖快，整齐、一致，无病虫害，周期短，周年生产，性状稳定。,02.12.2022,58,02.12.2022,59,第三节 植物组织培养的应用,（ 3 ）作用： 有利于繁殖系数低、杂合材料的快速繁殖 有利于有性繁殖优良性状易分离材料的繁殖 有利于保持从杂合的遗传群体中筛选出的表现型优异植株的优良遗传性。 组织培养育苗的无毒化生产，还可减少病害传播。 可以减少气候条件对幼苗繁殖的影响，缓和淡、旺季的供需矛盾。,02.12.2022,60,第三节 植物组织培养的应用,（ 4 ）现状

28、： 世界上一些先进国家园艺植物组织培养技术的迅速发展从60年代就已经开始，并随着生长、分化规律性探索的逐步深化，到了70年代仅花卉业就已在兰花、百合、非洲菊、大岩桐、菊花、香石竹、矮牵牛等二十几种花卉幼苗生产上建立起大规模试管苗商品化生产。,到1984年世界花卉幼苗产业的生产总值已达20亿美元，其中美国花卉幼苗市场总值为6亿多美元，日本三友种苗公司有60的幼苗靠组织培养技术繁殖。1985年仅兰花一项，在美国注册的公司就有100余家，年销售额在1亿美元以上。,02.12.2022,61,第三节 植物组织培养的应用,我国采用快速繁殖技术，也使优良品种达到迅速的推广和应用。 如广东切花菊黄秀风的应用

29、，使菊花变大，长势加强，花色鲜艳，抗病力增强，打开了进入香港市场的渠道，使30多种观叶植物的推广很快遍及全国，丰富了人们的生活，并将自然界的几百个野生金钱莲品种繁种驯化，培养了一批园林垂直绿化的材料，促进了园林业的发展。,02.12.2022,62,第三节 植物组织培养的应用,（ 5 ）制约：植物组织培养也存在一定的困难。首先是繁殖效率与商品需要量的矛盾，有些作物由于繁殖方法尚未解决，因而无法满足生产的需要。其次是在培养过程中如何减少变异株的发生。更重要的是应降低组培苗工厂化生产的成本，只有降低成本，才能更好的投产应用。 总之，随着组织培养这一技术的发展及各种培养方法的广泛应用，使这一技术在遗

30、传育种、品种繁育等方面表现出了巨大的潜力，特别是生物工程和工厂化育苗实施以后，它将以新兴产业的面目在技术革命中发挥重大作用。,02.12.2022,63,要揭开生命活动的秘密，需要多科学、多技术的相互配合，其中植物组织培养技术是不可缺少的，它为遗传学、分子生物学、细胞生物学、生物工程等提供了一种有效、快速的方法。,二、在遗传学、分子生物学、细胞生物学、组织学、 胚胎学、基因工程、生物工程等方面的应用,第三节 植物组织培养的应用,02.12.2022,64,第三节 植物组织培养的应用,因为要揭示生命的奥秘，首先要研究单个基因的作用，研究它在细胞内是如何组装的，如何与其它基因发生联系，如何表达和调

31、控等。分离单个基因，对它DNA进行测序，再对其中的某些碱基实行突变，然后还需要将基因送到受体细胞当中，看表达情况，以确定其功能。接受基因的受体细胞要产生再生植株，就需要通过组织培养的方法才能实现。,02.12.2022,65,中国的中草药是一份人类宝贵的财富，但很多种中草药资源匮乏，产量不足，甚至濒于灭绝。如果能利用组织和细胞培养的方法在实验室内生产，不再依附于自然环境，不仅可以解决现有困难，而且可以通过筛选高产有效成分的细胞系，来提高其药用价值。 比如用培养的人参悬浮细胞，来生产人参皂苷，已在日本等国家形成规模。利用培养的植物细胞和组织细胞作为生物反应器，也可以生产某些蛋白质、氨基酸、抗生素、疫苗等，如用生食蔬菜生产乙肝疫苗正在实验中。,三、 利用组织培养的材料作为植物生物反应器,02.12.2022,66,本章小结,植物组织培养是指在离体（in vitro）条件下利用人工培养基（medium）对植物器官、组织、细胞、原生质体等进行培养，使其长成完整的植株。 按照外植体的不同，组织培养可分为植株培养、组织培养、器官培养、细胞培养和原生质体培养5种类型。组织培养技术在农业生产上的应用主要体现于以下几个方面：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；育种上应用；工厂化育苗。,