微生物遗传变异和育种课件.ppt

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1、第七章 微生物遗传与变异 与育种,通过本章的学习，要求掌握：1、遗传变异的物质基础2、基因突变的发生3、基因重组的原理和方法。4、基因工程的基本原理5、菌种保藏重点：细菌的基因重组 难点： 低频转导，高频转导，准性生殖,微生物是理想的遗传学研究材料：物种及代谢类型的多样性；个体简单，营养体多为单倍体，基因组小；繁殖快，易于累积不同的最终代谢产物及中间代谢物；菌落形态特征的可见性与多样性；环境条件对微生物群体中各个体作用的直接和均匀；易变异、易得到营养缺陷型突变株；一般都有相应的噬菌体；存在着处于进化进程中的多种原始方式的有性生殖类型等。,基因组genome：一种生物的全套基因。表现型pheno

2、type：生物可见的或可测定的性状遗传型genotype：决定生物表现型的遗传因子同样遗传型的生物在不同外界条件下，会显现不同表现型，但遗传型并没有改变，这种变异为非遗传性变异，只能称适应或饰变(modification)；只有遗传型改变，从而引起表型变化才称为变异，它发生在基因水平上，可以遗传给子代。,Serretia marcescens在25下培养时，会产生一种深红色的灵杆菌素，把菌落染成鲜红色。可是，当培养在37下时，群体中所有细胞都不产色素。如果重新降温至25，产色素能力又得到恢复。这就是一种饰变。,第一节 遗传变异的物质基础,一、证明DNA是遗传物质的经典实验1928年，F. Gr

3、iffith；1944年O. T. Avery 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）转化试验。1952年，A. D. Hershy、M. Chase的噬菌体感染实验。1956年，H. Fraenkel-Conrat的TMV拆开和重建实验。,Griffith的转化实验,S,R,转化因子本质的阐明,Hershey-Chase的噬菌体实验用35S和32P去分别标记大肠杆菌，然后再用T2噬菌体感染，即可分别得到标有35S和T2和32P的T2噬菌体。把标记噬菌体与其宿主大肠杆菌混合，经短时间(如10 min)保温后，使T2完成吸附和侵入过程。在组织捣碎器中剧烈搅拌，使吸附在菌体

4、外表的T2蛋白外壳脱离细胞并均匀分布。进行离心沉淀，再分别测定沉淀物和上清液中的同位素标记。,实验结果发现，几乎全部的32P都和细菌一起出现在沉淀物中，而几乎全部35S都在上清液中。这意味着噬菌体的蛋白外壳经自然分离后仍留在细胞外部，只有核酸芯子才进入宿主体内；同时，由于最终能释放出一群具有与亲代同样蛋白外壳的完整的子代噬菌体，说明只有核酸才是其全部遗体信息的载体。后来通过电子显微镜的观察也证实了这个论点。,TMV重建实验,(TMV),(HRV),霍氏车前花叶病毒,DNA的双螺旋结构图,二、遗传物质在细胞中的存在1、真核生物染色体:DNA分子与组蛋白结合构成染色体，每条染色体有单一线性双链DN

5、A分子。一个真核生物细胞内有多条染色体（脉孢菌7条，人23条）。真核细胞核物质外有核膜包围，形成完整细胞核。线粒体:真菌线粒体基因组的大小介于动物和植物线粒体基因组之间。叶绿体：光合生物叶绿体中存在DNA。真菌的质粒：酵母菌的质粒存在细胞核中。 丝状真菌的质粒存在线粒体中。,2、原核生物染色体:染色体仅由一条DNA组成，DNA为共价闭合环状双链,DNA不与组蛋白结合，一个细胞内只有一条染色体（单倍体haploid）。无核膜膜包围，只在细胞中央形成核区。质粒(plasmid):原核生物中，除染色体以外，还有能够自主复制的共价闭合环状DNA分子。它们携带少量遗传基因，决定细胞的某些性状，并非细菌生

6、活必需。 致育质粒 能自我复制(主要依赖宿主细胞的 抗性质粒 复制酶体系) 细菌素质粒 具不亲和群性(不同质粒可在同一 ) 降解质粒 细胞内共存) 毒性质粒 稳定的遗传 共生质粒 代谢型质粒 具有转移性 隐蔽质粒(表型和功能未知的质粒),质粒的种类,质粒的特性,三、 遗传信息的传递和基因表达1、微生物的遗传信息储存在基因中基因gene DNA分子的一定区段，携带特定的遗传信息，是具有自主复制能力的遗传功能单位。遗传信息通过DNA连上的核苷酸排列顺序表现出来。 遗传学上每一基因都用3个小写斜体英文字母表示，如lac表示乳糖基因。基因的表型也用与基因相同的3个字母表示，但不用斜体，且第一个字母要大

7、写，表示具有乳糖代谢特征的符号为Lac+，没有乳糖代谢特征的符号为Lac-。基因的种类: 结构基因:决定多肽形成的碱基顺序称结构基因。一个结构基因表达后，产生一个多肽；即“一个基因一个酶”。 调节基因：对结构基因起调节控制作用的基因称调节基因。 跳跃基因：可在DNA上转移位置的基因称跳跃基因。 例如: 插入序列 （IS因子） 转座子 （Tn因子）,（1）、等位基因的存在与表达： a. 对抗性的：只有一个基因能够 表达,显性基因表达 真核生物 b. 非对抗性的：两个显性， 两个 隐性。 在原核细胞中: 在完全单倍体原核细胞中，等 位基因的概念是指决定某一性状 的基因在野生型菌株和突变型菌 株中是

8、否都存在。,基因表达,2、基因的表达：,基因表达机制: 遵守中心法则 以DNA为模板，通过RNA聚合酶转录出mRNA，然后将mRNA包含的碱基顺序在核糖体中翻译成相应氨基酸序列的多肽。 转录（transcription） 双链DNA单链，以其中一条为模板互补mRNA 翻译(translation) mRNA 多肽,(2) 、操纵子和操纵基因的表达： 一个操纵子是一段DNA碱基顺序，包括一个操纵基因和一个或几个结构基因。 操纵子的模型是雅各布和莫诺1961年提出的，根据这一模型基因有结构基因，调节基因，操纵基因和启动基因之分，基因的活动受调节系统控制，而这种控制又与环境因子有关，如乳糖操纵子，麦

9、芽糖操纵子。,乳糖操纵子,没有乳糖时，调节基因产物与操纵基因结合，阻止结构基因表达,有乳糖时，乳糖与调节基因产物结合，操纵基因启动结构基因表达,DNA链,麦芽糖操纵子,没有麦芽糖时，调节基因产物激活蛋白不与启动子结合，结构基因不表达,有麦芽糖时，麦芽糖与调节基因产物激活蛋白结合，促进RNA聚合酶与启动子结合，结构基因表达,DNA链,第二节 基因突变和诱变育种 1.突变：指DNA上的核苷酸顺序发生了稳定的，可遗传的变化。 基因突变：DNA链上一对或少数几对碱基发生 改变而引起。 染色体畸变：DNA链的大片段损失。 自发突变：在自然条件下发生的基因突变，细 菌的自发突变频率为10-5-10-7 。

10、 诱发突变：利用物理化学因子处理微生物使其产 生的突变。 回复突变：突变菌株发生突变，回复到出发菌株 的状态。,突变包括,突变分为,突变机制： 转换：DNA上一个嘌呤被另一个嘌呤或 者一个嘧啶被另一个嘧啶所替代 颠换：DNA上一个嘌呤被一个嘧啶替代 或者一个嘧啶 被另一个嘌呤替代 添加 DNA分子中多了一个或几个碱基，导致编 码 aa三联密码发生了改变，从而引起突变。 缺失 DNA分子中少了一个或几个碱基引起突变。 如：GGG AAA UUU AAA CCC 甘 赖 苯丙 赖 脯 加一个碱基后就变成了： AGG GAA AUU UAA ACC C 精 谷 异亮 终止 添加：abc X defg

11、 缺失：abc D efg 畸变（染色体大损伤） 重复：abc abc de （由X射线等的辐射烷 移位：abc par de 化剂，亚硝酸等引起） 倒位：abc fed g,碱基置换,移码突变,点突变,诱发突变,基因突变类型： 1、营养缺陷型 2、抗性突变型 3、条件致死突变型 4、形态突变型 5、抗原突变型 6、产量突变型,基因突变的特点： 不对应性 自发性 稀有性 独立性 诱变性 稳定性 可逆性 正向突变(forward mutation) 回复突变 (back matation或reverse mutation）,基因突变自发性和不对应性的证明,1、变量试验：（Fluctuation

12、Test）： 又称波动试验或彷徨试验。1943年美国学者鲁里亚（S、Luria）和德尔波留克（M、Delbrack）设计了此试验。,2.涂布实验：（Newcombe Expetiment）,1949年Newcombe设计了这一实验：先在12只培养皿中涂以数目相等的大肠杆菌细胞，经大约5小时培养，于是在平板上长出大量的微菌落，取其中6支直接喷上噬菌体，另6支先用灭菌玻璃棒均匀涂布一遍，然后再喷噬菌体，经过夜培养计算两组培养皿中抗性菌落数。（涂布可将抗性株涂开）。,3.平板影印培养试验（Replica Plating）,1952年莱德伯格夫妇（V，Lederberg）设计的实验： 印章的做法是取一

13、块比培养皿略小的木块，一端用绒布包起来，绒布上许多小纤维起到接种针的作用。在进行试验时，先用培养液培养大肠杆菌，再将菌液涂布在固体培养基上，待长出菌落后，用影印法先在新鲜的固体培养基上打一个印，再在含链霉素的另一个培养皿上打一个印。在含链霉素的培养皿上长出来的是抗链霉素突变体菌落然后再在不含链霉素的培养基上找出相应位置上的菌落，用含链霉素的培养基上找出相应位置上的菌落，用含链霉素的培养基鉴别，发现也是抗链霉素突变体，由于两者来源相同，说明是非链霉素诱变，而是自发的。,微生物育种：1、自发突变育种 生产育种 定向培育：在某一特定条件下，长期培养某一微生物菌群，通过不断转接传代以积累自发突变，并最

14、终获得优良菌株的过程。如预防结核病的制剂卡介苗，经历了13年，牛型结核分支杆菌转接230代。,2、诱变育种 用物理（X-ray、UV等）化学（吖啶、亚硝酸、碱基类似物）因素诱变育种，获得突变机率提高。,艾姆氏试验（Ames test）,利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境或食品中的潜在三致物质。,诱变育种的基本原则,挑选优良的出发菌株 自发突变株、具有有利形状、对诱变剂敏感敏感时期和合适对象的选择 选择简便有效地诱变剂选用最适剂量高效的初筛和复筛 透明圈法、抑菌圈法、变色圈法、生长圈法等,突变体的筛选： A 、营养突变体的筛选: 完全培养基：基本培养基中加入了天然物质（蛋白胨，酵母膏等），能

15、满足各种营养缺陷型M.生长的培养基。 基本培养基：只含有野生型菌生长繁殖所必须养料的合成培养基叫基本培养基。 a、青霉素浓缩法： 用基本培养基培养细菌，并在其中加入青霉素，由于青霉素只能抑制生长着的细菌，故只杀死在基本培养基中生长的野生型细菌，而营养缺陷型突变体因不能在基本培养基中生长，青霉素对它们不起作用而被保留下来。 b、菌丝过滤法：把霉菌和放线菌的孢子放在基本培养基里生长，这时只有野生型菌会萌发长出菌丝，而缺陷型孢子不会长成菌丝，通过过滤可除去野生型菌丝，而保留突变体孢子。,营养缺陷型的检出,点种法夹层培养法限量补充培养法(含00.1以下蛋白胨的基本培养基)影印接种法,B、抗性突变体的筛

16、选:采用梯度培养法: C、产量突变体的筛选:采用琼脂块培养法:,用梯度平板法筛选抗性突变体,用琼脂块法筛选产量突变体,DNA的损伤及其修复： A、光复活修复：在光复活酶的作用下，将嘧啶二聚体内的环丁酰环打开，使DNA恢复正常。 B、错配修复：在DNA复制后清除错误配对的碱基。 C、无碱基修复：无碱基修复能够恢复无碱基位置上的核苷酸，参与修复的酶是AP核酸内切酶，该酶作用于DNA链上无碱基位置的糖基，留下的单链缺口被DNA聚合酶和连接酶修复。 D、核苷酸和碱基切除修复：首先由具有DNA识别活性的DNA内切核酸酶识别突变的碱基，然后在突变碱基两侧固定数目的碱基处，将包含有突变碱基的核苷酸片段切除，

17、再在DNA聚合酶的作用下，修补合成一段新的DNA。 E、复制后修复：在含有嘧啶二聚体或其他损伤的位置上， DNA仍然可以进行复制，但是在复制得到的子代中，其DNA链在损伤的对应部位上会留下缺口。在细胞内重组蛋白的作用下，可进行DNA分子间的重组，从原来完整的母链上，将相应的碱基序列转移到子链的空缺处。而母链中失去的部分再在DNA聚合酶的作用下，以其对应子链为模板，合成单链DNA来填补。最后在连接酶的作用下，以磷酸二酯键连接新旧链，完成重组修复过程，即复制后修复。 F、SOS修复: SOS修复由SOS调控完成，涉及复杂的基因表达网络。,化学诱变,亚硝酸引起DNA的碱基转换,5-BU尿嘧啶引起碱基

18、的转换,第三节 基因重组和杂交育种克隆clone 不经过有性细胞的结合，由体细胞发育成新个体，即无性繁殖。基因重组gene recombination 两个不同来源的遗传物质进行交换，经过基因的重新组合，形成新的基因型的过程。重组获得的后代具有新的基因组合，表现出不同于亲本的新性状。 转化 原核微生物的基因重组 转导 接合 原生质体融合,1、转化Transformation : 遗传转化是指同源或异源的DNA分子（质粒DNA和染色体DNA）被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的基因转移过程。转化后的受体菌称为转化子。被转移的DNA称为转化因子。 转化的条件是：受体菌必须处于感受态才能接受转化

19、因子，感受态既可以是自然的，也可以是人工的。转化因子通常是双链DNA。 感受态：受体菌最容易接受外源DNA片段并实现转化的生理状态称为感受态。 转化过程：受体细胞处于感受态。外源DNA与感受态细胞结合并被吸收。外源DNA整合到受体菌中，成为受体菌染色体的一部分。转染 transfection:指用提纯的病毒核酸去感染其宿主细胞可增殖出一群正常病毒后代的现象。,转化示意图,自然转化原理,2、转导transduction 通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介，把一个供体细胞的 DNA 片段转移到另一个受体细胞中，并使后者发生遗传变异的过程。 通过转导获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞，称为转导子

20、（transductant）。携带供体部分遗传物质（DNA 片段）的噬菌体称为转导噬菌体或转导颗粒。 缺陷噬菌体：带有外源(如细菌)DNA片段而失去了部分自身DNA的噬菌体称为缺陷噬菌体。,1952 年Zinder 和 Lederberg 在验证鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是否也存在接合现象时发现了转导现象。鼠伤寒沙门氏菌有两种缺陷型 LT22A(trp-) :色氨酸缺陷型 LT2(his-):组氨酸缺陷型LT22A溶原性噬菌体P22 感染LT2（非溶原性）可能释放带trp+的P22LT22A (trp-)呈原养型。,普遍转导(generalized tran

21、sduction)噬菌体可误包供体菌中的任何基因(包括质粒)，使受体菌实现各种性状的转导.完全普遍 性转导 能形成遗 传性稳定 的转导子,裂解循环,流产转导(abortive transduction):在许多获得供体菌DNA片段的受体菌内，如果转导DNA不能进行重组和复制，其上的基因仅经过转录而得到表达。 能在选择性 培养基平板 上形成微小 菌落是流产 转导的特点。,局限转导(也称专性转导):某些温和噬菌体只能将细菌的少数特定基因转移到受体菌中的现象。 当溶原菌经诱导后，其中极少数前噬菌体从宿主染色体脱落时产主错误切割，从而把宿主的某些基因（ 前噬菌体位点两端是细菌染色体的gal和bio ）

22、 ，故形成的转导噬菌体通常带有ga1或bio基因 ，当这样的噬菌体侵染另一宿主细菌时，噬菌体 DNA 与受体菌的 DNA 同源区段配对，通过双交换而整合到受体菌的染色体上，使受体菌获得了供体菌的这部分遗传特性，而形成了专性转导子。,噬菌体DNA的不正常切割,缺陷噬菌体（defective phage）:丢失了自身部分基因，并被同等长度的宿主基因所取代的噬菌体称为缺陷噬菌体。如dgal或dbio。低频转导（low frequancy transduction, LFT）:形成转导子频率很低的转导，通常只有10-4 10-6 。 高频转导（high frequancy transduction,

23、HFT ）:形成转导子的频率很高, 理论上可达 50%。,高频转导可通过双重溶源实现： E.coli k12 E.coli K12(/dgal )F dgal UV 转导噬菌体（gal） 转导子菌落 辅助噬菌体（） 噬菌斑,溶源转变(lysonenic conversion) 当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的基因组上，而使后者获得了除免疫性以外的新性状的现象。 当宿主丧失这一噬菌体时，通过溶源转变而获得的性状也同时消失。溶源转变与转导有本质上的不同，首先是它的温和噬菌体不携带任何供体菌的基因；其次，这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的。 溶源转变的典型例子是不产

24、毒素的白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae) 菌株在被噬菌体感染而发生溶源化时，会变成产白喉毒素的致病菌株。,接合conjugation 通过供体菌与受体菌间细胞直接接触而传递大段DNA的过程。 1946年，Lederberg和Tatum的E.coli k12营养缺陷型株混合培养实验中发现。E.coli k12两个突变株Bio- Met- The+ Leu+Bio+ Met+ The- Leu- (生)（蛋）（苏）（亮） 两种菌混合培养后，出现原养菌（Bio+ Met+ The+ Leu+）可在基本培养基上生长。,细菌接合现象研究得最清楚的是大肠杆菌。大肠杆菌是有

25、性别分化的。决定它们性别的因子称为F因子(即致育因子或称性质粒)，呈超螺旋状态，具有自主的与染色体进行同步复制和转移到其他细胞中去的能力。也可插入(即整合)到染色体组上； 它既可经过接合作用而获得，也可通过一些理化因素(如吖啶橙、Ni2+、Co2+、丝裂霉素C、硫酸十二酯钠、亚硝基胍、利福平、溴化乙锭、环己亚胺和加热等)的处理，而从细胞中消失。 F因子的分子量为5107。在大肠杆菌中，F因子的DNA含量约占总染色体含量的2%。,F+菌株:含F质粒，细胞表面产生性毛(sex pili)，与F-细胞接合形成2个F+细胞。 F-菌株： 无F质粒， 不产生性 菌毛，可 接受外来 F质粒。,F 因子的存

26、在方式及其相互关系,细菌染色体,质粒,质粒转移,质粒整合,F质粒的接合转移,F+xF-=2F+,Hfr x F-= Hfr+F-,Hfr菌株 高频重组菌株（high frequency recombination） 与F-接合后，重组频率比F+高几百倍。在Hfr细胞中，存在与染色体特定位点相整合的F因子(产生频率约10-5)。当它与F-菌株发生接合时，Hfr染色体在F因子处发生断裂，由环状变成线状。整段线状染色体转移至F-细胞的全过程约需100 min。在转移时，由于断裂发生在F因子中，所以必然要等Hfr的整条染色体组全部转移完成后，F因子才能完全进入F-细胞。但转移过程由于环境因素如震动等影

27、响会使转移中断，所以越在前端的基因，进入的机会就越多，而在末端的F因子很难进入F-细胞中,故在Hfr x F-中出现2个Hfr的机会很少。,Hfr用于基因定位,F菌株 当Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离其染色体时，可形成游离的携带一小段染色体基因的F因子，特称F因子。携带有F因子的菌株，其性状介于F+与Hfr之间，这就是初生F菌株。初生F菌株与F-菌株接合，可使后者转变成F菌株，这就是次生F菌株，它既获得了F因子，又获得了来自初生F菌株的若干遗传性状。以这种接合来传递供体菌基因的方式，称为F因子转导(F-duction)、性导(sexduction) 。 在次生的F群体中，大约有10%的

28、F因子重新整合到染色体组上，而恢复成Hfr菌。,原生质体融合 通过人工的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合并产生重组体的过程称为原生质体融合（protoplast fusion）。 微生物细胞融合的研究开始于1976年。其一般原理和主要过程是：先准备两个有选择性遗传标记的突变株，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶去除细胞壁，再将形成的原生质体离心聚集，并加入促融合剂PEG(聚乙二醇)促进融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使其再生细胞壁或进行分裂的培养基上，待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，最后鉴定它们是否是重组子。,原生质体融合操作过程,转座遗传因子:是一段位于

29、染色体或质粒上的特殊的DNA序列，广泛存在真核生物和原核生物中。 特点：可以从染色体的一个位置转移到另一个位置，或者在质粒与染色体之间相互转移。 插入序列（IS因子） 转座子（又称易位子，以Tn表示）： 型：两端为IS，抗性基因居中。如Tn5、Tn9、 Tn10、Tn4001、Tn4003。 型：两端为IR(3050bp)，中间为转座基因 和抗性基因。如Tn1、Tn3、Tn21、 Tn1721 、Tn551 转座噬菌体 转座结果：引起受体菌DNA发生易位、倒位、重复和缺失导致基因重组。,转座因子,真菌的基因重组 有性生殖,粗糙脉孢菌的子囊孢子在子囊中的排列有六种方式,AAAAaaaa aaaa

30、AAAA AAaaAAaa aaAAaaAA AAaaaaAA aaAAAAaa,接合型基因座(A或a)与着丝粒之间未发生染色体交换,接合型基因座(A或a)与着丝粒之间发生了染色体交换,粗糙脉孢菌的有性杂交,准性生殖 准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更为原始的一种生殖方式，它可使同种生物不同菌株的体细胞发生融合，不经过减数分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子。生殖：准性生殖包括下面四个过程:菌丝联结异核体形成核配体细胞交换和 单倍体化四个 阶段。,在准性生殖中,有丝分裂产生非整倍体核,非整倍体核在继续分裂中丢失染色体,导致重组单倍体的发生,在准性生殖中,有丝分裂时杂合二倍体染色体的

31、偶然交换会导致基因重组的发生,准性生殖和有性生殖的比较,比 较项目 准性生殖 有性生殖参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分 化 的性细胞独立生活的异核体阶段 有 无接合后双倍体的细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同双倍体变为单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂接合发生的几率 偶然发现，几率低 正常出现，几率高,第四节 基因工程,1、基因工程（gene engineering） 是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质-DNA 大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体(vector)的 DNA 分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易

32、生长、繁殖的受体细胞中，以让外源遗传物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。,基因工程的过程:基因分离：体外重组：外源DNA与载体连接载体传递：导入受体，使外源DNA在受体中表 达复制、表达筛选、繁殖：对重组后的大量重组子性状进行筛选，从中选出所需性状重组子，并使之稳定繁殖。,微生物在基因工程中的作用： 1、微生物作为克隆载体 A、质粒载体 B、双链噬菌体DNA载体 C、M13单链噬菌体DNA载体 D、噬菌粒载体（噬菌体DNA与质粒DNA重组而成） F、黏粒载体（又称柯斯质粒，由DNA的cos区 与质粒DNA 重组而成） G、酵母质粒载体 2、微生物生

33、产基因工程工具酶 （1）、限制性核酸内切酶 （2）、DNA连接酶 3、微生物作为克隆载体的宿主 （1）、原核生物宿主：大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 （2）、真核生物宿主：酿酒酵母 4、微生物作为表达载体。,E.coli的pBR322质粒是环状双链DNA分子，由4361bp组成，可插入5kb左右的外源DNA。,噬菌质粒载体是由丝状噬菌体和质粒载体DNA融合而成，本身分子量小，仅3000bp,可克隆10kb的外源DNA,黏粒载体又称柯斯质粒，由DNA的cos区（粘性末端）与质粒DNA重组而成，柯斯质粒本身只有5-7kb,但它可克隆45kb的外源DNA,酵母质粒载体：酵母质粒载体是利用酵母的2微米质粒和其

34、染色体组分与细菌质粒pBR322构建而成，能分别在细菌和酵母中复制，所以又称穿梭载体。主要有以下三种,2、DNA的体外扩增 穆利斯发明了聚和酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR），这是一种在体外快速扩增特定DNA序列的新技术。PCR扩增的条件： a、要有DNA摸板 b、要有引物 c、要有脱氧核苷三（dNTP）磷酸 d、要有DNA聚合酶 e、要有扩增缓冲液 f、要有钙离子,变性：双链DNA解链 成为单链DNA退火：部分引物与模 板的单链DNA的特 定互补部位相配 对和结合延伸：以目的基因为 模板，合成互补的 新DNA链,PCR技术,每一轮聚合酶 链式反应可使

35、目的基因片段 增加一倍。 30轮循环可获得 230（1.07109) 个基因片段。,四.3段DNA芯片本身是一种专门刻制和加工的仅2cm2左右大小的玻璃片，它被嵌在一小块胶片上。芯片被分隔成许许多多的小格，每一小格大约只有一根头发丝的一半那么细，小格上特别的交联分子与一个由20个左右核苷酸的DNA探针相连。一般的芯片保持有400000个小格，更多的可达到1600000小格。每一格上的DNA探针都各不相同。 在对DNA样品分子检测时，从细胞中提取的DNA样品用一种或若干种限制性酶进行酶切，这些酶切片段被荧光染料标记并熔解成为单链，然后它们被滴加到芯片上去与DNA探针杂交。凡是与芯片上的探针互补的

36、酶切片段便牢固地结合在特定的小格中，而那些与芯片上各探针都不能互补的酶切片段就会被洗脱掉。 接下来，用一种特制的激光共聚焦扫描器 对芯片上小格和荧光进行扫描与解读。解读的信息被输入计算机中，由专门的程序软件进行分析，最终获得被检测样品的序列信息。,3、基因芯片,A,B,第五节 微生物的菌种保藏,微生物个体微小，容易受环境条件的影响而产生变异，当菌体发生负突变时，就是衰退的表现。为此在生产上需要对菌种经常复壮，淘汰那些负突变体，保留生产能力强的原始个体。1如何防止菌种衰退： （1）控制传代:将传代控制在最低限度，因为传代越多， 出现负突变的机会就越多。 （2）选择良好的培养基: 良好的培养基也可

37、防止菌种衰退, 如5406如培养在老苜蓿根培养基上就可以防止它的退 化。 （3）利用孢子或者芽胞传代:芽胞抗逆性强，出现变异机 会比营养细胞少。 （4）采用有效的菌种保藏方法: 一般来讲冷冻干燥法保藏 持菌种出现退化的现象较其它保藏法少一些。,采用纯种分离法 A、稀释法挑单菌落, 然后进行生产性能测定。 B、挑单孢子培养。 3菌种保藏 （1）斜面传代保藏，定期传代，防止死亡 （2）干燥法 A、沙土管法，保藏细菌芽胞可用此法 B、麸夫管法， 保藏霉菌、放线菌孢子可用此方法 （3）冷冻法 A、 冷冻干燥法 ，适于多种微生物，特别是细菌 B、 液N保鲜法（-196）， 适于不生孢子的丝状真菌 C、 -70低温保藏，需超低温冰箱。 （4）悬液法 将微生物细胞悬浮在水、甘油、蔗糖液、葡萄糖液、盐水、磷酸缓冲液中，某些细菌、酵母用此法可保藏几年至近十年。,2、菌种纯化,