荧光定量PCR的原理和临床应用ppt课件.ppt

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1、文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,如何做一个“,聪明,”的实习生,?,实习的目的就是对在校所学的理论知识和实验技,能，在临床的实际工作中进行实践、巩固和提高。,?,如何做到：,实习之前要复习理论知识和实验课内容,“,理论先行,”,实习过程中要“,聪明,”,做好实习笔记，用心思考，,实习之外下功夫,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,如何做一个“聪明”的实习生,聪,明,耳：认真听老师的说明和讲解,看：仔细看老师的操作,问：有疑问要多提问，多讨论,心：要用心去思考,日月：要每天每月坚持做到,文档仅供参考，不能

2、作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,内容概要,?,PCR,的定义和原理,?,荧光定量,PCR,的原理和分类,?,荧光定量,PCR,结果的分析,?,荧光定量,PCR,在临床的应用,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,PCR,的定义,?,PCR,是,Polymerase Chain Reaction,的缩写，中,文称为,聚合酶链式反应,，由,变性,、,退火,及,延,伸,几步反应组成一个周期,循环进行,可使目的,DNA,得以迅速扩增。,?,由美国,PE,公司遗传部的,Dr. Mullis,发明，由于,PCR,技术的跨时代意义，,M

3、ullis,获得了,1993,年,诺贝尔化学奖。,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,PCR,的原理,?,变性,：双链,DNA,在高温下解开成单链的过程,。温,度一般为,95,左右。,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,加热,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,PCR,的原理,?,退火,：温度下降后，两条配对的单链,DNA

4、,重新,结合为双链的过程。温度一般为,5060,。,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,CCACTGCCTCTC,GGACTCGACACT,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,CCACTGCCTCTC,GGACTCGACACT,降温,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,PCR,的原理,?,延伸,：,DNA,聚合酶催化以引物为起始点的,DNA,链延伸反应,。温度一般为,72,左右。,5CCACTGCCT

5、CTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,CCACTGCCTCTC,GGACTCGACACT,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA,GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT,恒温,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,普通,PCR,的原理,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,普通,PCR,的原理,?,PCR,反应成分：,1.,

6、模板,DNA,2.,引物,3.,四种脱氧核糖核苷酸,4.DNA,聚合酶,(,Taq,酶,),5.,反应缓冲液、,Mg,2+,等,6.,荧光探针（荧光定量,PCR,）,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,Taq,酶的发现,?,在,Taq,酶发现之前，实验室的,PCR,反应中运用的,是大肠杆菌,DNA,聚合酶,的,Klenow,片段。,?,Klenow,酶不耐高温，,90,加热后会,变性失活,，,每次循环结束都要加入新鲜的酶。,?,而且,DNA,的延伸是在,37,完成，模板和引物容,易错配，造成反应的,特异性很差,。,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿

7、模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,Taq,酶的发现,?,美国的嗜热菌研究室在黄石国家公园温泉中发,现了嗜热菌,(,T,hermus,aq,uaticus),株，,Cetus,公司,研究人员从中分离了,Taq DNA,聚合酶,?,特点：耐高温：,70,2h,活性,90%,，,93,2h,活性,60%,，,95,2h,活性,40%,；,延伸温度,较高,(,一般为,72,),：大大,提高了扩增特异性、,灵敏性和扩增效率,。,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,荧光定量,PCR,?,概念：在,PCR,反应中加入,荧光基团,，利用荧光,信号累积或变化

8、实时监测,整个反应过程，最后,通过特定数学模型对未知模板进行定量分析的,方法。,?,实时荧光定量,PCR,技术于,1996,年由美国,Applied,Biosystems,，,ABI,公司,推出，实现了,PCR,从定性,到定量的飞跃。,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,实时荧光定量,PCR,的原理,?,利用,荧光信号的变化,实时监测,PCR,反,应的每个循环的扩增产物量的变化。,?,通过,Ct,值,和,标准曲线分析,对起始标本,的模板量进行定量分析。,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,与普通,PCR,的

9、比较,?,普通,PCR,完成后，一般只对扩增的最终,产物量进行分析，分析结果多为,定性,或者半定量,结果。,?,荧光定量,PCR,通过监测荧光值的变化，,体现每一个循环的扩增产物量的变化，,分析结果为,定量,结果。,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,与普通,PCR,的比较,?,普通,PCR,完成后，才能进行扩增产物的分,析，而且分析的过程可能产生一定的,生,物危害和环境污染,。,?,荧光定量,PCR,的扩增和产物分析过程是,同,时完成,的，而且在,封闭,的反应体系中进,行，比较安全，易于处理。,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处

10、，请联系网站或本人删除。,常用的名词概念,?,本底信号（,Baseline,）,?,荧光阈值（,Threshold,）,?,Ct,值（,Ct value,）,?,扩增曲线,前,15,个循环荧光信号的均值，可,手动调节选择,默认是第,3,15,个循环的荧光信号的标,准偏差的,10,倍，也可手动调节,扩增过程中，产物的荧光信号达到设定的阈值,时所经过的扩增循环数,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,常用的名词概念,Threshold,Baseline,Ct value,荧光强度,Rn,扩增循环数,对数增长期,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有

11、不当之处，请联系网站或本人删除。,实际中的运用,左图为,5,个数量级的标准品扩增后得到的荧光曲线，,右图以,Ct,值为纵坐标，,lgX,s,为横坐标，可计算得出标准曲线,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,实时荧光定量,PCR,的分类,?,目前的实时荧光定量,PCR,均是基于,荧光共振能,量转移,（,Fluorescence resonance energy,transfer,，,FRET,）的原理。,F,Q,10nm,F,Fluorophore,荧光基团,Q,Quencher,，,淬灭基团,F,Q,10nm,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿

12、；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,荧光共振能量转移（,FRET,）发生的条件,?,荧光基团和淬灭基团都能发射荧光,?,荧光基团的,发射光谱,和淬灭基团的,激发光谱,需,有效重叠,?,荧光基团和淬灭基团应足够的近（,10nm,）,波长,信,号,强,度,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,常见的实时荧光定量,PCR,?,TaqMan,探针法实时荧光定量,PCR,?,分子信标探针法实时荧光定量,PCR,?,双链,DNA,交联荧光染料法实时荧光定量,PCR,?,双杂交探针法实时荧光定量,PCR,?,蝎形探针法实时荧光定量,PCR,文档仅供参考，不能作为

13、科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,探针的荧光标记,?,探针在其,5,端标记一个,荧光基团,，如,6-,羧,基荧光素,(FAM),、四氯,-6-,羧基荧光素,(TET),、,六氯,-6-,羧基荧光素,(HEX),等,?,探针在其,3,端标记一个,淬灭基团,，如,6-,羧,基,-,四甲基罗丹明,(TAMRA),文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,TaqMan,探针法实时荧光定量,PCR,引物延伸所用到的,DNA,聚合酶,Taq,酶同,时具有,53,方向核酸,聚合酶活性,，还具有,对聚合延伸中遇到与,靶序列结合的核苷酸,序列的,53

14、,核酸,外切,酶活性,。,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,分子信标探针法实时荧光定量,PCR,茎环结构的分子信标探针,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,荧光染料法实时荧光定量,PCR,最常用的染料就是,SYBR Green,，游离,时只发出微弱荧光，,当它非特异性与双链,DNA,小沟结合后，荧,光强度可,增大,1000,倍,。,所以，反应中发出的,荧光信号与扩增产生,的,DNA,双链的量成正,比。,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,几种方法的比较,方法,优

15、点,缺点,TaqMan,法,特异性高,重复性好,价格高,只适合特定目标,分子信标法,特异性更高,荧光背景低,价格高,只适合特定目标,设计较困难,荧光染料法,适用性广,方便、便宜,引物要求高,易出现非特异结果,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,荧光定量,PCR,在临床的应用,?,在实际的临床应用中，,TaqMan,法的荧光,定量,PCR,比较多见。,?,TaqMan,法,特异性高,，,重复性好,，,价格适,中,，可以满足临床上检测特定项目的要求。,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,荧光定量,PCR,在临床

16、的应用,?,常见的异常结果：,假阳性,、,假阴性,和“,灰区,”,?,如何发现异常结果：,设定,阳性对照,、,阳性质控,（低值、中值、,高值）和,阴性对照,加入,内标试剂,与标本一起扩增，帮助判,断假阴性结果出现,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,荧光定量,PCR,在临床的应用,?,如何判断：,?,标本结果为阴性，而内标荧光不随着扩增而增加，则,可判断为假阴性结果,阳性对照,阴性对照,阳性低值,阳性中值,阳性高值,判断结果,+,-,在控,在控,在控,结果可靠,+,+/-,可能出现假,阳性,+,+,阳性结果不,可靠,+/-,-,偏低,/-,偏低,偏低

17、,可能出现假,阴性,-,-,-,偏低,/-,偏低,所有结果不,可靠,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,荧光定量,PCR,在临床的应用,?,出现异常结果的原因：,试剂和实验器材的原因：试剂过期失效，耗,材中存在,DNase,、,RNase,、抑制物等,实验操作不当,标本间污染,：相临的测试孔结果相近,气溶胶污染,：大范围的阳性结果,仪器故障,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,荧光定量,PCR,在临床的应用,?,有效防止和消除,气溶胶,污染的方法：,保持实验室的通风，最好有机械通风设备,10%,次氯酸钠溶液

18、的喷洒和擦拭,1M HCl,溶液的浸泡,紫外线的照射：,500bp,片段敏感,75%,或无水乙醇溶液喷雾,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,荧光定量,PCR,在临床的应用,?,在反应体系中使用,dUTP,和,UNG,酶消除以,往实验的污染影响,UNG,酶（尿嘧啶,-N-,糖基化酶）：选择性,水解断裂含有,dU,的双链和单链中的尿嘧,啶糖苷键，在碱性介质和高温下会进一步,水解断裂，酶的最佳活性温度是,50,，在,95,失活。,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,荧光定量,PCR,在临床的应用,气溶,胶污,染

19、物,50,2min,，,95,灭活,加入,UNG,酶,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,荧光定量,PCR,在临床的应用,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,5CCAC,U,GCC,U,C,U,C CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,扩增,加入,dUTP,5CCAC,U,GCC,U,C,U,C CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,5CCAC,U,GCC,U,C,U,C CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,5CCAC,U,GCC,U,C,U,C CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,CCAC,U,GCC,U,C,U,C

20、 CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,5CCAC,U,GCC,U,C,U,C CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,5CCAC,U,GCC,U,C,U,C CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,5CCAC,U,GCC,U,C,U,C CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,5CCAC,U,GCC,U,C,U,C CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,5CCAC,U,GCC,U,C,U,C CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,潜在气溶胶污染物,50,2min,加入,UNG,酶,5,断裂的核苷酸片段,3,5,断裂的核苷酸片段,3,5,断裂的核苷酸片段,3,5,断裂的核苷酸片段,3,5

21、,断裂的核苷酸片段,3,5,断裂的核苷酸片段,3,5,断裂的核苷酸片段,3,5,断裂的核苷酸片段,3,5,断裂的核苷酸片段,3,5,断裂的核苷酸片段,3,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,荧光定量,PCR,在临床的应用,?,乙型肝炎病毒,DNA(,HBV-DNA,),?,EB,病毒,DNA(,EBV-DNA,),?,人巨细胞病毒,DNA(,HCMV-DNA,),?,肺炎支原体,DNA(,MP-DNA,),?,肺炎衣原体,DNA(,CP-DNA,),文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,临床标本的采集,检,测

22、,项,目,标,本,类,型,及,要,求,HBV-DNA,血清或者血浆,100l(,不可用肝素抗凝,),EBV-DNA,血清,100l,或抗凝全血,1ml(,不可用肝素抗凝,),HCMV-DNA,血清,100l,或抗凝全血,1ml (,不可用肝素抗凝,),MP-DNA,CP-DNA,咽拭子、痰液或肺支气管灌洗液,1ml,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,?,用于器官移植、骨髓移植及,HIV,阳性,/AIDS,患者人巨细胞病毒感染的,辅助诊断,和疗效监控,。,?,临床上可以采用的标本类型：,尿液,、,乳,汁,、血清、血浆

23、或,淋巴细胞,样本中人巨,细胞病毒,DNA,。,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,?,巨细胞病毒,DNA,的提取（血清或血浆）,100l,血清,或血浆,100l,DNA,浓,缩液,去除上清,液，保留,沉淀,12000rpm,，,10min,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,巨细胞病毒,DNA,的提取（血清或血浆）,加入,50l,DNA,提,取液,剧烈振荡,混匀,5-10s,100,加热,10min,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模

24、仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,?,巨细胞病毒,DNA,的提取（血清或血浆）,4,放,置或用,于,PCR,振荡混匀,510s,12000rpm,，,5min,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,?,巨细胞病毒,DNA,的提取（尿液和乳汁）,1ml,尿液,或乳汁,去除上清,液，保留,沉淀,12000rpm,，,5min,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,?,巨细胞病毒,DNA,的提取（尿液和乳汁）

25、,加入,50l,DNA,提,取液,剧烈振荡,混匀,5-10s,100,加热,10min,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,?,巨细胞病毒,DNA,的提取（尿液和乳汁）,4,放,置或用,于,PCR,振荡混匀,510s,12000rpm,，,5min,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,?,人巨细胞病毒,DNA,的提取（淋巴细胞的提取）,1ml,抗,凝全血,1ml,生,理盐水,0.3ml,淋巴,细胞分离液,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿

26、模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,?,人巨细胞病毒,DNA,的提取（淋巴细胞的提取）,水平离心机,2500rpm,，,15min,淋巴细胞层,吸取淋巴,细胞悬液,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,?,人巨细胞病毒,DNA,的提取（淋巴细胞的提取）,淋巴细胞,悬液,去除上清,液，保留,沉淀,12000rpm,，,5min,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,人巨细胞病毒,DNA,定量检测试剂盒,?,人巨细胞病毒,DNA,的提取（淋

27、巴细胞的提取）,加入,50l,DNA,提,取液,剧烈振荡,混匀,5-10s,100,加热,10min,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,?,人巨细胞病毒,DNA,的提取（淋巴细胞的提取）,4,放,置或用,于,PCR,振荡混匀,510s,12000rpm,，,5min,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,荧光定量,PCR,扩增过程,50,94,2min,5min,93,15s,57,30s,Stage1,Stage2,Stage3,45,1,1,25,1min,Stage4

28、,1,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,DNA,浓缩液的作用,?,DNA,浓缩液的成分：,PEG6000,、,NaCl,?,PEG,（聚乙二醇）的作用：,PEG,与自由水分子,结合，同时蛋白质表面的水化膜被夺走，与水,分子结合的极性集团转而与多聚物的氧原子或,者氢氧根结合，形成蛋白质与多聚物的复合体，,从溶液中沉淀析出。,提高低浓度标本的检出率,。,?,PEG,的浓度与沉淀出的,DNA,片段大小成反比。,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,DNA,浓缩液的作用,?,NaCl,的作用：在细胞内,DNA,与蛋

29、白质结合成,脱,氧核糖核蛋白,DNP,，而,RNA,与蛋白质结合成为,核糖核蛋白,RNP,在不同盐浓度中二者溶解度不,一样。,?,DNP,在纯水或者,12M,的,Nacl,溶解度较大，在,0.14M,溶解度较低，而,0.14M,中,RNP,溶解度较大，,因此,利用,0.14M,可分离,RNP,和,DNP,。,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,DNA,提取液的作用,?,DNA,提取液的主要成分：,NP-40,TritonX-100,Chelex-100,EDTA(pH8.0),Tris-HCl (pH 8.0),NaOH,（乙基苯基聚乙二醇）很温和的

30、去垢剂，,1%,浓度的基本可以破,坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱,（聚乙二醇辛基苯基醚,）一种非离子性去垢剂，,被用来做细胞破膜剂,/,细胞通透剂,（聚苯乙烯二乙烯基苯）提取,DNA,过程中，,Chelex100,能有效除去非核酸有机物,螯合,Mg,、,Ca,等二价金属离子，抑制依赖金属离,子的脱氧核糖核酸酶对,DNA,的降解作用,（三羟甲基氨基甲烷）与,盐酸按比例混合后形成的,一种缓冲液体系，,DNA,在,这一体系中呈稳定态,核酸在,pH 59,是稳定的，,pH12 /3,会引起双链之间,氢键解离而变性,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,淋巴细胞

31、分离液的作用,?,人外周血中各种细胞的密度不同，红细胞为,1.093,，粒细胞为,1.092,，淋巴细胞为,1.074,0.001,。,?,淋巴细胞分离液密度为,1.0771.080g/ml,，密度,梯度离心法原理是根据各类血细胞比重的差异，,利用,比重介于某两类细胞之间的细胞分离液,对,血液进行离心，使血细胞按照相应的密度梯度,分布于不同的位置，从而达到分离的效果。,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,？问？题？,?,PCR,的中文名称，一般包括哪几个反应过程？,?,在,PCR,中我们常用到的酶是什么？有什么优点？,?,荧光共振能量转移的原理？,?,有效防止和消除气溶胶污染的方法？,?,在临床血液标本采集中哪种抗凝剂不能使用？,?,淋巴细胞分离液的作用原理？,