HIV抗体检测与质量控制课件.ppt

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1、HIV抗体检测与质量控制,滋病毒（人类免疫缺陷病毒）,艾滋病毒（即人类免疫缺陷病毒）是一种逆转录病毒，它具有极强的迅速变异能力，这一特征不仅使人体的免疫系统难以抵御其侵害，而且给特效治疗药物和预防用疫苗的研制带来困难。艾滋病毒直接侵犯人体的免疫系统，破坏人体的细胞免疫和体液免疫。它主要存在于感染者和病人的体液（如血液、精液、阴道分泌物、乳汁等）及多种器官中，它可通过含HIV的体液交换或器官移植而传播。,病毒现状,在世界范围内导致了近1200万人的死亡，超过3000万人受到感染。在感染后会整合入宿主细胞的基因组中，而抗病毒治疗并不能把病毒根除。在2004年底，全球有约四千万被感染并与人类免疫缺陷

2、病毒共同生存的人，流行状况最为严重的仍是撒哈拉以南非洲。1986年7月25日，世界卫生组织（WHO）发布公报，国际病毒分类委员会会议决定，把艾滋病病毒改称为人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus）简称HIV。,病毒特点,HIV病毒主要攻击人体的辅助T淋巴细胞系统；一旦侵入机体细胞，病毒会和细胞整合在一起终生难以消除；病毒基因变化多样；广泛存在于感染者的血液、精液、阴道分泌物、唾液、尿液、乳汁、脑脊液、有神经症状的脑组织液，其中以血液、精液、阴道分泌物中浓度最高；对外界环境的抵抗力较弱，对乙肝病毒有效的消毒方法对艾滋病病毒消毒也有效；感染者潜伏期长、死亡率高；

3、艾滋病病毒的基因组比已知任何一种病毒基因都复杂。,体外生存,人类免疫缺陷病毒在人体外生存能力极差，不耐高温，抵抗力较低，离开人体不易生存，常温下只可生存数小时至数天。HIV对热敏感。在56条件下30分钟即失去活性，但在室温保存7天，仍保持活性。,灭活方法,国际卫生组织推荐对艾滋病病毒灭活加热100持续20分钟，效果较理想。,病毒形态,人类免疫缺陷病毒直径约120纳米，大致呈球形。,致病机制,HIV选择性的侵犯带有CD4分子，主要有T淋巴细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等。,传播途径,HIV感染者是传染源，曾从血液、精液、唾液、尿液、阴道分泌液、眼泪、乳汁等分离得HIV。性接触传播 血液传播 母婴

4、传播,疾病诊断,HIV抗体筛查试验ELISA试验化学发光法快速检测补充试验抗体确证试验：免疫印迹试剂（WB）和条带免疫试验（RIBA）核酸试验：核酸定性和核酸定量试验,HIV抗体检测目的,HIV抗体检测可用于诊断、血液筛查、监测等。以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况，包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要进行的体检等。以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV，包括献血员筛查和原料血浆筛查。以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。,HIV抗体筛查样品,血清/血浆/全血滤纸干血斑口腔黏膜渗出液尿液,筛查试剂,国家食品药品

5、监督管理局注册批准有效期内酶联免疫试剂应批批检合格选择敏感性和特异性高的试剂,筛查方法,酶联免疫吸附试验（ELISA）化学发光或免疫荧光试验（CIA/IFA） ：采用发光或荧光底物，用发光或荧光仪测定结果快速检测（RT）及其它检测试验,酶联免疫吸附试验（ELISA）,HIV抗体检测试剂（第三代）：检测HIV-1/2抗体HIV抗原抗体联合检测试剂（第四代）：可同时检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体用酶标仪测定结果有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定,ELISA试验中可能出现的问题和原因分析,ELISA试验中可能出现的问题和原因分析,ELISA测定中的干扰因素,内源性干扰因素

6、外源性干扰因素,内源性干扰因素,人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。常见的有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、医源性诱导的抗体、自身抗体、溶菌酶、磷脂、药物小分子等,外源性干扰因素,常常是由于血标本的采集、贮存等不当所致。如标本溶血、细菌污染、标本贮存时间过长、凝集不全、反复冻融等,分析ELISA测定中出现的假阳性或假阴性结果时，需综合考虑试剂因素、操作因素和标本因素等。,ELISA法结果判断,临界值概念: 将检测的阳性和（或）阴性对照的OD值代入计算公式计算出来的判断阳性和阴性结果的界值判断标准:标本OD值与临界值的比值大于等于1(S/CO1)为阳性注意:不同厂家、不同

7、方法临界值计算公式不同,酶联免疫吸附试验（ELISA）,优点：准确性高、价格低廉、判断结果标准客观、结果便于记录和保存用途：流行病学监测及临床大量标本的检测,化学发光或免疫荧光试验,采用发光或荧光底物既可检测抗体，也可联合检测抗原抗体酶或荧光标记的HIV抗原或抗体，加发光或荧光底物用发光仪或荧光仪测定结果,（1）免疫渗滤试验：斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验以硝酸纤维膜为载体HIV抗原点状固定在膜上加待检样品阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点有效试验的质控点必须显色,快速检测（RT）及其它检测试验,斑点免疫胶体金快速诊断试验,（2）免疫层析试验：,以硝酸纤维膜为载体HIV抗原线状固定在膜上

8、待检样品（血液、唾液或尿液）沿着固相载体迁移阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带有效试验的质控带必须显色第四代快速试剂（SD）：可区分抗原抗体的检测,全血样品加50ul样品于样品垫中,手指血方法,静脉血方法,加一滴缓冲液,15分钟内读取结果,快速检测（RT）及其它检测试验,病人条,质控条,快速检测（RT）及其它检测试验,优点:快速 单份标本检测 不需额外试剂或设备 操作简便缺点:肉眼判断较主观价格较贵结果不易保存（建议拍照保存）,HIV筛查试剂的选择,检测目的实验设施条件价格其他：检测数量、标本用量、复检问题、习惯等等,临床诊断相关的检测策略使用抗体检测试剂的筛查检测流程,HIV抗体筛查结果的

9、意义及处理,阴性：真阴性 未感染HIV病毒 假阴性 注意窗口期阳性：真阳性 感染HIV病毒 假阳性 非特异性反应 操作失误处理：筛查试验无反应报告为“HIV抗体阴性”；有反应必须进行复检，复检两次检测均无反应报告为“HIV抗体阴性”，复检检测均有反应或一个有反应一个无反应需进行“补充试验”；报告为“HIV感染待确定”，不能出具阳性报告。,补充试验,是通过检测样本中是否存在艾滋病病毒抗体或者核酸确定艾滋病病毒感染的检测方法。 补充试验包括抗体确证试验免疫印迹试验、条带/线性免疫试验，特定条件下的替代检测（三种酶联免疫、三种快速试验或酶联加快速试验），免疫层析和核酸检测试验（核酸定性检测和核酸定量

10、检测试验）,HIV抗体确证试验,确证试验的试剂： 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。确证样品： 可采用血清、血浆、滤纸干血斑确证试验方法： 免疫印迹试验、条带/线性免疫试验，特定条件下的替代检测（三种酶联免疫、三种快速试验或酶联加快速试验），免疫层析或免疫渗滤试验,条带免疫试验（RIBA）/重组免疫印迹法（万泰）,图5 免疫印迹试剂（WB/RIBA）试验流程,抗体确证试验检测流程,HIV抗体WB及 RIBA/LIA试验结果报告：（1）符合HIV-1抗体阳性判断标准，报告“HIV-1抗体阳性”，并按规定做好检测后咨询和疫情报告。符合HIV-2抗体阳性判断标准，报告“HIV

11、-2抗体阳性”，并按规定做好检测后咨询和疫情报告。（2）符合HIV抗体阴性判断标准，报告“HIV抗体阴性”。如疑似“窗口期”感染，建议2-4周后随访或进一步做HIV核酸检测，尽早明确诊断。（3）符合HIV抗体不确定判断标准，报告“HIV抗体不确定”，在备注中应注明“2-4周后复检”或尽快做核酸检测。,抗体确证试验检测报告,WB不确定结果,原因：HIV感染早期 HIV感染晚期 非特异性反应 污染处理：核酸检测 2-4周后随访 重采血,图核酸试验流程,临床诊断相关的检测策略,核酸补充试验报告,定性检测结果有反应，报告“HIV-1核酸阳性”；无反应，报告“HIV核酸阴性”。定量检测结果低于检测限，报

12、告低于检测限；检测结果大于5000CPs/ml，报告检测值；检测结果低于等于5000CPs/ml，尽快再次严格按核酸检测的要求采样检测，报告检测值。临床医生可结合临床及流行病史、CD4+T淋巴细胞检测值或者HIV-1抗体随访检测结果等进行诊断或排除诊断。,HIV抗体母亲 HIV 抗体经胎盘进入胎儿，出生时新生儿和婴儿早期抗体阳性，不一定是感染出生时母亲的抗体，8090% 在生后 912 个月消失，出生后 18 个月基本上全部消失18 个月后儿童 HIV抗体仍然阳性，视为自身感染产生的抗体,18个月以下婴幼儿的HIV诊断,婴幼儿HIV感染的抗体检测,适用于：HIV感染产妇所生婴幼儿；母亲HIV感

13、染状态不详，儿童出现HIV相关临床表现，临床怀疑HIV感染的儿童。婴儿12个月时进行HIV抗体检测 阴性排除感染，纳入正常儿童保健； 阳性者继续追踪随访，至18个月再次进行HIV抗体检测，结果阴性排除感染。,HIV抗体检测的要点,根据目的选择检测方法及检测策略。严格遵守实验室标准操作程序（SOP）。结果判定以试剂盒说明书为标准。筛查试验有反应，须作补充试验,质量控制,质量控制是指为确保实验工作正常进行而在每一次实验过程中必须采取的各种措施。以保证检验结果达到允许的准确度。,实验前质量控制 正确的标本采集和处理 正确及时的运送样品 实验前正确地处理和保存样品实验中质量控制 仪器校准 选择合格试剂

14、，采用正确的检测方法 标准程序 质控品的准备 开展质控图质控实验后质量控制 结果记录 记录核对 结果解释 记录保存,质量控制,实验前质量控制,样品的采集：实验室应根据待测项目选用适当的方法采集样品。抗体检测可采集血清、血浆和全血；CD4+T淋巴细胞检测可采集K3EDTA或肝素或枸橼酸钠抗凝全血，并在24小时内室温送检；HIV-1病毒载量测定可采集EDTA或枸橼酸钠(ACD)抗凝全血，最好在6小时内离心分离血浆和血细胞。将分离的血浆分装到2-3支，冰冻保存，在冻存管上编号。做好样品处理记录并注明分装时间。,实验前质量控制,样品的保存：用于HIV抗体检测的血清和血浆样品,应存放于-20以下，短期（

15、1周）内进行检测的样品可存放于2-8；用于CD4+T淋巴细胞检测的样品应在室温下（1823）保存，避免极端温度（冷冻或过热）,样品采集时间超过72h则不可检测；用于病毒载量检测的样品的保存条件应根据血浆检测时间而定，4天内可在4暂时保存，3个月以内冻存于-20以下，3个月以上应置于-70以下保存。血浆样品冻融次数不可超过3次。每次冻融在样品上标明。,实验前质量控制,样品的运输：1、样品送检时需与相应送样单同时送检。2、血清和血浆样品在2-8条件下由专人低温运输。3、CD4+T淋巴细胞检测样品需在在室温下（1823）运送，避免极端温度（冷冻或过热）。超过37的温度会破坏细胞，对血液学和流式细胞仪

16、的检测有影响。4、病毒载量测定样品的运送：冻存的血浆样品在运输过程中要保持样品在冷冻状态，防止样品冻融。在4暂时保存的样品，在2-8条件下低温运输。抗凝全血样品在24小时内2-8条件下低温运输。,实验前质量控制,运输采用WHO提出的三级包装系统 第一层容器：装样品，要求防渗漏 第二层容器：要求耐受性好、防渗漏、容纳并保护第一层容器，可以装若干个第一层容器。 第三层容器：放在一个运输用外层包装内，应易于消毒,实验前质量控制,样品编号:实验室应建立和规范对待检样品的唯一识别标记的编码规则，不同检测项目（抗体检测、CD4+T淋巴细胞检测和病毒载量检测）要采用不同的编号系统。一般应包括检测项目、年份代

17、码、样品顺序号等。可在收样时用不干胶纸打出编号条，也可用记号笔在样品或其包装容器上标注。,实验中质量控制,1.仪器校准 2.选择合格试剂，采用正确的检测方法 3.不同检测方法对样品有不同要求 4.检测方法提高准确性 5.标准程序 6.做好实验室原始记录 7.质控品的准备 8.商用(定值和非定值）和自制（小量分装保存，便于每日使用） 开展质控图。,实验中质量控制,开展质控图针对每次检测所得到的质控数据进行描点作图，判断该次检测的可接受性进行长期监控，对重复检测的精密度进行评价定期对数据表进行复查,质控规则及使用,实验室在报告实验结果之前必须评价质控数据。可通过图形记录的检查或由计算机审核结果来决定许多质控规则已被采用，常用的有12s和13s等规则。,实验后质量控制,实验后准确填写检验结果；及时发出报告；正确地解释检验结果的临床意义。,谢 谢！,谢 谢！,