蛋白组学课件.ppt

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1、.,1,第三章 蛋白质组与蛋白质组学,.,2,第一节 蛋白质组与蛋白质组学的定义,蛋白质组 protein + genome proteome 一种基因组所表达的全部蛋白质 一个细胞或一个机体的基因所表达的全部蛋白质,.,3,蛋白质组学阐明生物体全部蛋白质的表达模式与功能模式从整体的角度分析、鉴定细胞内动态变化的蛋白质的组成、结构、性质、表达水平与修饰状态了解蛋白质之间、蛋白质与大分子之间的相互作用与联系,揭示蛋白质的功能与细胞生命活动的规律,一、蛋白质组与蛋白质组学的定义,.,4,蛋白质组学研究意义和背景,目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析等，都是从细胞中mRNA的角

2、度来考虑的，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，,.,5,DNA mRNA 蛋白质,转录水平调控,翻译水平调控,翻译后修饰,蛋白质的亚细胞定位,蛋白质之间的互相作用,蛋白质组学的研究意义和背景,.,6,DNA,mRNA,蛋白质,转录,翻译,基因,蛋白质,细胞特异性基因表达,生理状态,蛋白质相互作用,温度,应激状态,培养条件,药物作用,数量有限,结构相对稳定,复杂性,多变性,直接反应生命现象,复杂的调控,.,7,蛋白质组学一经出现，就有两种研究策略。一种可称为“竭泽法”，即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质。（全蛋白组的研究）

3、另一种策略可称为“功能法”，即研究不同时期细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。这种观点更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。（差异表达的蛋白质组）,蛋白质组学研究的策略,.,8,蛋白质组学研究的范围,蛋白质的表达模式 蛋白质翻译后修饰研究 蛋白质-蛋白质相互作用的研究,.,9,二、蛋白质组学的研究方法 差异蛋白组学,.,10,生物学问题的提出,实验模型的设计,实验组和对照组样品的制备,蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离,图像扫描和初步分析,感兴趣蛋白点的切取,胰酶对脱色后蛋白质的消化,质谱的多肽指纹图、微测序分析,质谱结果的生物

4、信息学分析和比对,新蛋白质的发现,其它实验的进一步验证,蛋白信息的初步获得,.,11,第一步 、蛋白质分离蛋白质组分析的首要要求,将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析 。,.,12,样品制备要求：重复性好 蛋白质损失少 无核酸 去除高丰度或无关蛋白 浓度,.,13,以肿瘤蛋白质组学研究为例说明肿瘤蛋白质的来源,（1） 以肿瘤细胞为研究材料不同的肿瘤细胞；正常细胞与癌变细胞,优点: 易获得缺点: 这些细胞系从组织中分离出来并经体 外培养后蛋白质会发生许多变化,.,14,（2） 外科手术切除的肿瘤组织,优点: 来源较为方便缺点: 整个组织包括基质，纤维原细

5、胞，免疫细胞等，组织匀浆困难，不易分离总蛋白而蛋白质组研究需要的通常是单一的细胞类型。,.,15,（3）以激光捕获显微切割（ LCM）肿瘤细胞LCM是直接从冰冻或石蜡包埋肿瘤组织切片中获取细胞。它是用乙烯醋酸盐聚合体膜覆盖在被选择的细胞上，然后用红外激光熔化膜，这时膜与组织在目标位置牢固结合，当膜被提起时，仅目的细胞留在膜上。优点：能准确切取肿瘤细胞缺点：需昂贵的仪器,.,16,第二步、蛋白质的分离,二维色谱毛细管电泳,双向电泳(2DE),Ettan DALTsix,Ettan IPGphor IEF unit,.,17,2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术 。

6、,大鼠肝线粒体蛋白质组图谱,.,18,1、双向凝胶电泳(2DE)第一向: 等电聚焦（IEF）第二向:SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,.,19,等电聚焦是利用蛋白质分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线形pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。,.,20,SDS-PAGE电泳是根据SDS和还原试剂将蛋白质分子解聚后亚基的大小，在恒定的pH缓冲系统中的分离。,.,21,.,22,2、2D DIGE,.,23,2D-DIGE,差异凝胶电泳技术(difference gel electrophoresis, DIGE), 其可以将三个样品用Cy2、Cy3、Cy5染料染色后，等量混合，在同一

7、块胶上进行双向电泳分离，这样可以降低胶条和操作带来的误差。,.,24,DIGE 流程图凝胶内差异显示电泳,.,25,Cy2-labeled internal standard,Cy3-labeled control,Cy5-labeled disease,第三步、凝胶内蛋白质差异分析,.,26,DeCyder software,Designed to detect and match fluorescent 2D images Load up to 18 image pairs.DeCyder software automatically:Co-detects image pairsRemov

8、es backgroundRemoves dust particlesNormalises imagesMatches up to 18 image pairst-test and ANOVA calculated for each spot setData displayed as Trend analysis graph,.,27,.,28,control,disease,Volume ratio=2.87,.,29,第四步、质谱鉴定,质谱技术是蛋白质组学研究中最为广泛使用的蛋白质鉴定技术。其基本原理是样品分子 离子化后，根据不同离子间质荷比（M/Z）的差异来分离并确定分子质量。,.,30

9、,质谱分析,MALDI-TOF-MSLC-MS-MS,.,31,通过数据库的比对获取感兴趣的蛋白质的相关研究，来进一步地进行研究！,.,32,蛋白质亲和层析 亲和印迹 免疫沉淀 交联 酵母双杂交 噬菌体展示 生物传感芯片质谱 蛋白质工程中的定点诱变技术,一、蛋白质蛋白质,研究方法,传统技术,新技术,第五步 蛋白质相互作用的研究方法,.,33,一、蛋白质蛋白质,蛋白质相互作用的研究方法,1.酵母双杂交系统,2.噬菌体展示,3.生物传感芯片质谱,4.定点诱变技术,.,34,1.酵母双杂交系统,DNA-BD具有与报告基因转录调控区特异结合的功能，DNA-AD则具有活化转录的功能。,报告基因,一、蛋白

10、质蛋白质,.,35,DNA-BD和DNA-AD分开时不能激活转录，只有当两者在空间上接近时，才能呈现转录因子的活性。只有当蛋白质X与蛋白质Y间发生相互作用时，才能激活报告基因的转录，而当两者单独作用时均无此功能 。,一、蛋白质蛋白质,.,36,2、噬菌体展示技术,1、以改造的噬菌体为载体。2、cDNA基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白基因区。,.,37,2、噬菌体展示技术,3、使外源蛋白表达并展示于噬菌体表面。4、通过亲和富集法筛选表达有特异蛋白质的噬菌体。,.,38,抗原表位的筛选 蛋白相互作用筛选 酶的底物和拮抗剂的筛选 受体的激活剂和拮抗剂的筛选,2、噬菌体展示技术,.,39,蛋白质组研究的

11、技术路线流程图,样品细胞、组织、体液,双向电泳,电转印到膜上,图像分析、数据处理,胶上原位酶切,肽混合物,MALDI/TOF/MS,肽质量指纹谱,数据库检索,蛋白质鉴定,Edman降解,氨基酸分析,ESI/MS/MS,PSD/MALDI/TOF/MS,肽序列标签,氨基酸组成,N端序列,.,40,四、蛋白质组研究在医学中的应用,.,41,（一）用于疾病诊断的研究,结核病：结核杆菌的诊断恶性肿瘤的诊断：确定新的肿瘤标志物,.,42,（二）用于发病机制的研究,阐明肿瘤发病机制神经科学，包括学习、记忆的机制，以及神经病变机制研究,.,43,（三）用于药物开发,开发抗肿瘤新药抗感染疫苗研究药物毒理研究致

12、病菌耐药性研究,.,44,五、蛋白质组学研究中的困难,1. 2-D电泳胶上的点只是细胞蛋白质中的一小部分，大部分不能被显示。 2. 难溶于水或分子量大于18万的蛋白质难于在 2-D胶上显示。 3. 质谱技术虽有较高的灵敏度，但对来自2-D胶上的许多低丰度的蛋白质仍不能鉴定。,.,45,4.蛋白质的修饰对于蛋白质组蛋白质种类的确定将是一种“无限”的工作。5.蛋白质组研究任务是我们面临的“无尽挑战”。,.,46,第三节蛋白质的生物合成及其干扰,.,47,蛋白质的生物合成参与物质,1. mRNA与密码子,.,48,.,49,.,50,2. 氨基酸的运载工具：tRNA,.,51,3. 核糖体肽链合成的

13、“装配机器”,.,52,.,53,多核糖体,.,54,二、蛋白质的生物合成过程（一）、氨基酸的活化,氨基酸活化的总反应式是： 氨基酰-tRNA 合成酶氨基酸 + ATP + tRNA + 氨基酰-tRNA + AMP + PPi,.,55,氨基酸的活化 苯丙氨酸,.,56,原核生物（细菌）为例：所需成分：30S小亚基、 50S大亚基、模板mRNA、 fMet-tRNAfMet、GTP、Mg2+翻译起始因子：IF-1、IF-2、IF-3、,（二)、合成的起始,.,57,IF-3,IF-1,翻译起始(翻译起始复合物形成)又可被分成3步：核蛋白体大小亚基分离IF3- 促使 30S亚基结合于 mRNA

14、 起始部位，阻止30S亚基与50S亚基的结合，或者说促进70S核糖体的解离,.,58,2、30S小亚基通过与mRNA的SD序列模板相结合。,IF-3,IF-1,.,59,S-D序列: 在蛋白质合成起始时，mRNA上有一个很短的保守序列位于编码区前面，称为核糖体结合位点，称为S-D序列,.,60,IF-3,IF-1,3.在IF-2和GTP的帮助下， fMet-tRNA进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。,.,61,4. 70s起始复合物的形成,50s亚基与上述的30s前起始复合物结合，同时IF-2脱落，形成70s起始复合物。,IF-3,IF-1,.,62,a、 核

15、糖体较大,b、 mRNA 是单顺反子,c、 其mRNA 具有m7GpppNp帽子结构，从而导致起始时识别信号的差异,d、 Met-tRNAMet不甲酰化,e、 有较多的起始因子,真核蛋白质合成起始的特点,.,63,起始机制,对AUG的识别涉及：,Euk 蛋白质合成起始中的重要参与者：, 密码子与反密码子的配对, 起始AUG上下文结构特点的作用,MettRNAi 核糖体 AUG上下文特点 eIF 2作用 eIF-4F,.,64,真核生物翻译起始复合物形成过程,.,65,.,66,真核生物翻译起始复合物形成(区别原核生物),原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNAfM

16、et结合，最后与50S大亚基结合。而在真核生物中，40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合，再与模板mRNA结合，最后与60S大亚基结合生成80SmRNAMet-tRNAMet起始复合物。,.,67,三、 肽链的延伸,EFTu-GTP,+ 氨酰基-tRNA,三元复合物,原核生物肽链的延伸以氨酰tRNA 进入70S 起始复合物的A位为标志（第一个进位过程）,1、 进位,（1） 三元复合物生成,EFTu + GTP,.,68,（2） 三元复合物进入A位, 要求P位点被起始 氨酰tRNA 或肽酰tRNA占据, 同时，EF-Tu催化GTP水解，释放 EF-Tu-GDP,（3） Ts循环 （TuT

17、s 循环）,EFTs 能够使 EFTuGDP转变为 EFTuGTP,因为- EFTuGDP 不能有效地结合氨酰基tRNA,循环过程： EF-Tu-GDP,EF-Ts,EF-Tu-EF-Ts,GTP 取代,EF-Tu-GTP,.,69,.,70,2、 肽键生成（转肽反应）,（1） 肽酰转移酶 （peptidyl transferase）, 位于核糖体大亚基，催化肽键生成, 若干蛋白质、 23S rRNA 、5S rRNA,（2） 形成过程： 把两个氨酰tRNA 定位于调准的位置,将处于P位的甲酰甲硫氨酰基或肽酰基转移到A位的氨酰基tRNA 的氨基上形成肽键,肽链延伸一个AA,.,71,.,72,

18、（1） 需要GTP 和 延伸因子 EFG a、 过程： EFG 和 GTP 结合,- 核糖体中具有GTP酶活性的蛋白GTP水解,- A位生成的肽基转移到P位，P 位空载的 tRNA进入E位 （此过程 mRNA 移动了一个密码子）,3、 移位（translocation） 肽键生成后，核糖体沿mRNA 向前移动一个密码子的距离,.,73,b、 EFG和 GDP 必须释放,c、 核糖体固有的移位性质可被 EFG 所催化,.,74,fMet,fMet,.,75,4、 真核肽链的延伸,与 原核 相似, eEF1 取代 EFTu 和 EFTs, eEF2 取代 EFG, 真菌- eEF3 参与(维持翻译

19、的准确性),.,76,四、 多肽链合成的终止,.,77,1、 所需条件,（1） 终止信号：终止密码子,原核 和 真核都是：UAA、UAG、UGA,（2） 释放因子：,a、RF,原核中，RF1 - 识别 UAA 和 UAG,RF2 - 识别 UAA 和 UGA,RF3 - 刺激RF1 和 RF2 的活性,真核中 只有 eRF - 识别三种终止密码子,.,78,2、 终止机制,（1）原核生物,a、 RF 作用于A 位点体外实验证实，RF 与终止密码子之间特异的相互作用，类似于反密码子和密码子之间的碱基配对的相互 作用,b、,d、 RF 的某种作用改变肽基转移酶的肽基转移特性,将P位上的肽基转移到水

20、分子上而并不形成新的肽键，导 致肽基 tRNA的水解,c、 RF3 与 GTP 结合为肽基转移及随后的核糖体释放提供能量,.,79,.,80,三、蛋白质合成抑制剂,.,81,.,82,白喉毒素（diphtheria toxin),对真核生物剧毒，实质是一种修饰酶，对真核生物的eEF2 起共价修饰作用，使其失活。由于肿瘤细胞对白喉毒素比正常细胞更敏感，故用它与抗肿瘤细胞的特异抗原结合以消灭肿瘤细胞。,.,83,四、 蛋白质合成后的加工,N端fMet或Met的切除二硫键的形成特定氨基酸的修饰切除新生肽链中非功能片段(信号肽等)蛋白质的剪接：内含肽和外显肽,.,84,初级产物多肽链,天然蛋白质,残基

21、的去除、AA侧链的修饰、多肽链折叠成二级、三级甚至四级结构,前胰岛素原的加工,.,85,第五节 翻译后转运机制,.,86,.,87,一、蛋白质转运的意义(translocation)：蛋白质的合成场所为胞浆中游离的核糖体或内质网上相对固定的核糖体。细胞是分隔、分区的结构，所有的蛋白质在合成、加工完成后需要各就各位。蛋白质的转运途径与其合成场所有关。,.,88,二、翻译后转运机制：细胞质中游离核糖体上合成的蛋白质，需要进入内质网等细胞器时，由2080个（主要带正电荷）氨基酸组成的信号肽，牵引穿过双层膜，在跨越内膜时被内膜蛋白切除，释放蛋白。信号假说,.,89,.,90,三、蛋白质降解是一个有序的

22、过程 在大肠杆菌中，许多蛋白质的降解是通过一个依赖于ATP的蛋白酶（称为Lon）来实现的。当细胞中存在有错误或半衰期很短的蛋白质时，该蛋白酶就被激活。每切除一个肽键要消耗两分子ATP。 在真核生物中，蛋白质的降解需要泛素Ubiquitin，一个有76个氨基酸残基组成极为保守的蛋白参与。与Ubiquitin相连的蛋白将被送到一个依赖于ATP的蛋白质降解系统（Proteasome，Mr. 1106）。,.,91,朊病毒,.,92,英国自1985年发现疯牛病到1996年，已确诊有16142头牛患病，数以万计的牛被扑杀、焚烧、处理，使英国蒙受巨大的经济损失,特别是英国连续出现12个青年患新型克雅氏病（

23、new variant creutzfeldt-Jakob Disease nvCJD），人们怀疑该病是食用患疯牛病的牛肉引起的，在欧洲引起了极大的恐慌，疯牛病已成为欧洲严重的经济和政治问题。,.,93,一、朊病毒（prion）的发现 人和哺乳动物的研究,发现疯牛病（BSE）、羊瘙痒病（SC）及人的纹状体脊髓变性病（CJD），脑软化病（GSS），库鲁病（kuru），致死性家族失眠症（FFI）等特别是导致神经元进行性退化变性均由于蛋白粒子造成的。,.,94,研究人员检测了羊搔痒病，发现感染因子可以通过滤器，有点像病毒，但与病毒不同，用福尔马林处理不能使之完全失活。进一步的研究发现这种物质对254

24、nm的紫外线照射不敏感，而对237nm的紫外线敏感。 Prusiner与其同事在1982年从仓鼠脑中得到羊搔痒病病原成分。其浓缩成分可被蛋白酶K，二乙酰焦碳酸、尿素、酚和SDS等失活，但不能被核酸酶或紫外线照射破坏。,.,95,所以Prusiner称之为Prion,意为蛋白性感染颗粒（Proteinaceous infectious particle）。这个成份中只含一种蛋白质，称为朊病毒蛋白（ prion protein, PrP），并命名为朊病毒（Virino）。,.,96,回目录页,下一页,本质：传染性蛋白因子，主要成分是一种 蛋白水解酶抗性蛋白（PrPsc）生物学特性：不具有病毒结构，

25、未检出核酸；对福尔马林、加热、电离辐射、紫外线抵抗力强；,.,97,回目录页,下一页,PrPc：称之为朊蛋白，在人和动物细胞中普遍存在的朊病毒蛋白前体。为正常无害的蛋白，由宿主细胞一条染色体上的一个基因产生，多数存在于神经元中。PrPsc：感染形式的朊病毒前体经蛋白酶的酶切作用转化为PrP2730，最后通过纤维聚合自我成核作用，形成朊病毒蛋白。,朊病毒的蛋白结构,PrPcPrPsc,.,98,回目录页,下一页,朊病毒生物学特性,一级结构,二级结构,三级结构,四级结构,蛋白质的四级结构,.,99,朊病毒的生物学特性,二级结构出现转换， PrPc 螺旋含量达到42%，片层仅占3%； PrPsc 螺

26、旋含量降到30%， 片层达到45%；,PrPcPrPsc,.,100,回目录页,下一页,朊病毒基因结构,人类定位于20号染色体，小鼠定位于2号染色体神经元,仓鼠的PrP基因,.,101,回目录页,下一页,二、朊病毒的致病机制,朊病毒本身不能繁殖，它是通过胁迫PrPc畸变进行自我复制的。一个PrPsc 分子击中一个PrPc ， PrPc分子在PrPsc的胁迫下结构发生改变，形成PrPsc二聚体，接着2个PrPc在2个PrPsc的攻击下，产生4个PrPsc，如此循环，当PrPsc达到一定浓度后就会破坏神经元。,.,102,回目录页,下一页,朊病毒的生物学特性,PrPcPrPsc,PrPsc : 朊病毒具有极强的生命力和感染力。含有朊病毒的10g鼠脑可使上亿只老鼠致病。朊病毒能抗甲醛、耐热，在120130度加热4小时，仍具有一定的感染力。,.,103,Thanks for your attention！,个人观点供参考，欢迎讨论！,