胚胎移植课件.ppt

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1、胚胎移植,第一节 概念、意义和发展简史,一概念 胚胎移植（embryo transfer）俗称“借腹怀胎”，是指于着床前自一母体（供体）收集胚胎，移植到另一母体（受体）内完成妊娠的过程。 在畜牧业上，供体一般为优秀母畜，而受体一般为品质较差些的母畜。,二. 胚胎移植的意义,1提高优秀种畜的繁殖率,这是胚胎移植之最显而易见的意义。 例如，像奶牛这样的单胎动物，一头优秀母牛一生中一般最多只能生10个牛犊。但若通过重复采卵进行胚胎移植，让生产性状较差的母牛代替优秀母牛怀孕9个月，就可以大大提高其繁殖率。而且，如果再用激素对供体进行超数排卵，使每次采集的胚胎数增加到5-10个，就又可以使优秀母畜的繁殖

2、率增加5-10倍。,2加速动物育种和品种改良进程,在发展中国家，通过利用当地母畜作为受体进行进口胚胎移植可迅速实现品种替代。在育种工作中，一头优秀种公畜所起的作用之所以远比一头优秀种母畜大，是因为一头公畜一生留下的后代数目要比一头母畜多得多。然而，由于胚胎移植可以使母畜的繁殖率提高许多倍，故也就提高了优秀母畜在育种工作中的作用。,3促进动物的进出口,通过运输冷冻胚胎可以代替种畜的进出口活动。这样做可以大大节约购买、运输和检疫种畜所需的费用。此外，由外地引进胚胎而繁殖的家畜，因为是从小就在当地生长发育，故较容易适应本地区的环境，也可自养母得到一定的免疫能力。,4某些感染性疾病的控制和不妊症的治疗

3、,已经证明，胚胎移植是向无特异性病原体（specific-pathogen-free, SPF）猪群引入新鲜血液的一种安全手段。然而，其条件是，必须事先知道有关的特异性病原体不能够经胚胎或冲卵液传播。同样，在其他动物也有可能从感染某种疾病的母畜获得“干净”胚胎进行移植，以便拯救一些理想的基因。 在优秀母畜容易发生习惯性流产或难产，以及由于其他原因（如年老体弱）不宜负担妊娠过程的情况下，也可采用胚胎移植使其繁殖正常后代。,5诱发肉牛（羊）怀双胎,可向已经配种的母畜排卵对侧的子宫角内移植一个胚胎，使配种后未受胎的母畜妊娠，而使本来已受胎的母畜怀双胎。这种方法既提高了供体母畜的繁殖力，也提高了受体母

4、畜的繁殖力。但要注意，奶牛和种用肉牛的繁殖不能采用这种方法，因为“双生兼雌”（free martinism）现象会造成母犊的生殖机能异常。,6作为研究手段,1）繁殖和胚胎学研究在绵羊，通过把一个品种的胚胎移植到另一个品种母体内的方法已经证明，出生重主要由羔羊的基因型决定，但也受受体品种和窝重的影响。被毛的特性是受妊娠期间母体环境的影响的。通过从不育母羊收集胚胎并经形态鉴定后再移植到正常受体的方法，已经帮助确定了在受到诸如热应激、年龄、营养不良、泌乳以及孕激素处理等不利因素影响后所出现不育的原因。,在猪，通过胚胎移植实验证明，维持妊娠的最少胚胎数目是2-4个；黄体数目并不限制窝重。在绵羊，一般产

5、1-2个羔的品种在接受移植胚胎后，可维持更多的妊娠；说明是排卵数而不是子宫容量致使某些品种更高产。进行绵羊品种间胚胎移植已经证明，妊娠期的长度是由胎儿控制的，而与母体无关。,2）胚胎移植是胚胎工程各项技术的基础 体外受精、显微受精、动物克隆、转基因动物的产生等最终要通过胚胎移植技术来实现,三.胚胎移植技术的发展简史,3.1早期阶段1890-1900 W.Heape将安哥拉兔和荷兰兔的受精卵分别移植到比利时兔的输卵管内，分别获得仔兔2只。3.2初级阶段1900-1950 主要由英美科学家在家兔、绵羊、山羊小家畜方面研究，成功率35%左右。,3.3发展阶段1950-1970 日本首次在牛胚胎移植上

6、成功，之后日、美采用非手术法移植成功。胚胎移植成功率达70-80%。,2022/11/30,14,3.4实用化初始阶段 1970-1980 加美开始成立牛胚胎移植公司，1973年牛冻胚移植成功（英）。3.5实用化研究阶段 1982- 目前 大规模胚胎移植、核移植、嵌合体、胚胎分割、性别鉴定、体外受精在英美日德广泛开展。克隆羊诞生。,第二节 胚胎移植的生理学基础与基本原则,一. 胚胎移植的生理学基础 二. 胚胎移植的基本原则,一.胚胎移植的生理学基础,成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在外源激素作用下，每个发情期的卵泡发育和排卵数可达十数个；每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育；早期胚胎处于游

7、离状态；胚胎发育不存在免疫问题；胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组联系；胚胎的遗传性不受受体的影响；,2. 胚胎移植的基本原则, 种的一致性：供体和受体属于相同的种 动物生理状态的一致性：黄体期 解剖部位的一致性：子宫角或者输卵管,胚胎移植原则图解,第三节 胚胎移植的基本技术程序,一、供受体的选择与饲养管理,供体遗传品质优秀繁殖性能良好营养状况好，体格健壮无疾病,受体土种动物或者本地品种体格接近，营养良好无疾病繁殖生理特点与供体相似，比如多周期发情移植前2个月进行编号和补饲,二.供体超数排卵,1. 超数排卵的定义超数排卵（superovulation）简称超排，是指通过给母畜注射适当的激素

8、，维持更多卵泡正常发育而排除更多卵子的过程。,2.超数排卵的作用,2.1 超排作用一，也是其主要目的，是增加动物的每次排卵数目。大家都知道，哺乳动物的卵巢在动物出生时就已经含有成千上万的卵母细胞，但在动物整个生命期间，经自然排卵所排除的卵母细胞数目则是相当少的。,排卵少有两个原因： 是哺乳动物，特别是家畜的妊娠期较长，排卵的机会很少；是主要家畜都不是多胎动物，每次排卵排除的卵母细胞数只不过1-2个。单纯的胚胎移植只能解决第一个问题，使动物重复地发生暂时妊娠，而人为缩短动物的妊娠周期。而第二个问题的解决途径就是超数排卵。,2.2超排作用二，是它可被用来控制动物的排卵时间。为避免因卵子老化而降低繁

9、殖率，必须准确掌握动物的排卵时间，适时配种。在自然状态下，动物的排卵时间是受促性腺激素（主要是LH）高峰控制的。由于此高峰是由成熟卵泡所分泌的动情素正反馈作用诱发的，故其出现的时间往往与动物的发情行为紧密相伴。这样，若能准确地检查出发情开始的时间，也就能正确地估计出排卵的时间。然而，由于实践中人们不可能那样频繁地对动物试情，故难以准确地估计排卵时间。因此，为了准确地把握排卵时间，人们往往用激素来控制或调整动物的排卵过程。,3.超排方法,主要方法是给动物注射LH或hCG，模仿体内的LH高峰。但应注意，注射激素的时间要适当，必须在发情开始前不久、有成熟卵泡存在（发情前期）时进行注射。,由于一般难以

10、准确确定发情前期，故多采用注射PMSG来调整发情周期（卵泡发育），而后再注射LH，使动物按时排卵。在大多数动物（如牛、羊和猪），都是于黄体退化末期和发情前期之间注射PMSG，而后间隔一定时间注射LH或hCG。而在实验动物（小鼠、大鼠、仓鼠和兔），则可打乱情期注射PMSG，使其按照预定时间排卵。,1）常用的激素,最初用于超排的垂体促性腺激素都是脑垂体组织的丙酮浸出物，但目前主要用孕马血清促性腺激素（pregnant mare gonadotropin, PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（human chorion gonadotropin, hCG）等胎盘来源的激素，因为这些激素比脑垂体激素更容易

11、获得，可从尿或血中大量提取。PMSG主要表现为FSH活性，而hCG则主要起LH样的作用。,PMSG由滋养层细胞侵入子宫内膜基质中形成的子宫内膜杯细胞分泌产生，大约在孕马妊娠60-90天时效价最高，一般认为其作用是诱发形成附属黄体或使卵泡黄体化而维持妊娠。PMSG在血液中的半衰期要比脑垂体促性腺激素长得多，在40-125小时。,HCG由人早期胚胎的滋养层产生，排卵后8-9天就可自母尿中检出，其作用与延长黄体寿命和维持妊娠有关。目前多用于实验动物的另一种激素是人绝经促性腺激素（human menopausal gonadotropin, hMG），是从绝经妇女尿中提取的，主要表现为FSH活性。该激

12、素分泌的机理是因闭经妇女卵巢内没有成熟卵泡，动情素反馈作用不明显而由脑垂体释放出来的。,2）常见动物的常用超排方案,（1）小鼠 于发情周期的任意时间开始腹腔注射PMSG 5-10IU，48小时后注射hCG5-10IU。大约在注射hCG后12-13小时排卵。（2）仓鼠 腹腔注射PMSG 25IU，72小时后注射hCG 40IU，一般于注射hCG后者17小时排卵。,（3）家兔 每天皮下注射FSH 1mg，连续注射3天。于最后一次注射FSH之后24小时注射LH 2.5mg。或者，先注射PMSG 50IU，72小时后再注射hCG 50IU。一般于注射LH（hCG）后13小时排卵。（4）牛 于发情第10

13、-13天开始一次肌肉或皮下注射PMSG 2000-3000IU，或者每天两次肌肉或皮下注射FSH-P（猪脑垂体FSH），连续注射3-4天，总剂量28-50mg。于开始注射促性腺激素后48小时，注射前列腺素F2或类似物来溶解黄体。母牛一般于注射PG后36-48小时发情。,（5）绵羊和山羊 于发情开始后第13（绵羊）或16（山羊）天一次肌肉或皮下注射PMSG 1000-2000 IU，或者每天肌肉注射FSH-P，连续注射4天，总剂量为18-24mg。于开始注射促性腺激素后36-48小时，一次肌肉注射PGF2或类似物。母羊一般于注射PG后24-36小时发情。发情开始时一次静脉注射hCG 1000单位

14、。（6）猪 于发情第13、14或15天肌肉注射氯前列烯醇100g，8小时后再注射同样剂量的氯前列烯醇。在第一次注射氯前列烯醇后24小时，肌肉注射PMSG 750-1000IU。72小时后，肌肉注射500-1000IU hCG。一般于注射hCG后38-50小时排卵。,几种动物注射LH（hCG）后的排卵时间,3）影响超排效果的因素,超数排卵的效果受动物的遗传特性、年龄、营养状况、发情周期的阶段、季节及激素的批号等多种因素的影响。所以，不同品种和不同个体的超排反应差异很大，至今仍是胚胎移植中有待研究改进的一个重要问题。,三供体母畜的配种,超排母畜表现发情后，选用优秀种公畜的精液进行人工授精或实施本交

15、配种。由于超排母畜往往排卵很多，故应选择活力高、密度大的精液进行多次（2-3次）输精或配种，每次间隔8-10小时。,四胚胎的回收,胚胎的回收就是利用冲卵液将胚胎由雌性生殖道冲洗出来的过程。胚胎的回收用手术法，也可采用非手术法。前者适用于各种家畜，后者仅用于牛、马等大家畜，而且只能在胚胎进入子宫角以后进行。,（一）回收率,要取得较高的获胚率，很重要的一点就是要准确掌握动物的排卵时间、胚胎发育阶段和在生殖道内运行的速度等情况，以便采用适当的收集方法。,收集胚胎的时间最早也应在发生第一次卵裂之后，这样有利于判断卵子是否受精。通常是在配种后3-8天，发育到4-或8-细胞期以上为宜。,（二）回收时间,有

16、关动物的排卵时间和胚胎发育速度,1手术法收集胚胎,（三）回收方法,一般在腹中线开口，暴露出输卵管和子宫。根据要取胚胎的发育时期和在生殖道内的位置，决定冲洗子宫还是输卵管。1）如果胚胎处于输卵管内，就要冲洗输卵管；2）如果胚胎早以进入子宫，则必须冲洗子宫。,冲洗输卵管的方法逆冲法，即用注射器的钝针头插入子宫角尖端，注入冲卵液，同时在输卵管伞端插入一导管，接取冲卵液。这种方法适用于牛、羊和兔等动物，因为它们的宫-管结合部没有阻止液体倒流的瓣状结构。,是正冲法，即由伞部注入冲卵液，并在子宫角上端插管收集冲卵液。猪和马的宫-管结合部有瓣，倒冲时冲卵液不易通过，只能采用正冲法。,冲洗子宫的方法用肠钳子夹

17、住子宫角基部后，自子宫角尖端注入冲卵液并在子宫角基部插入导管，收集冲卵液。这种方法适用于各种家畜，冲卵液的用量依动物子宫角大小不同而异。,注意事项：手术冲卵操作应尽量轻微、迅速，防止伤口、生殖器官及冲卵液的污染。缺点：1）费时。2）动物需要麻醉或者安定处理。3）易发生生殖道粘连。,2非手术法收集胚胎,优点,在牛和马等大动物，更简便易行。对动物（特别是生殖道）伤害较小。可以重复进行。,牛的非手术冲卵多采用二路式导管冲卵器（two-way catheter）。它由内外两个橡胶管嵌套起来组成。内管为冲卵液的通路，外端为“Y”分叉的，一枝为液体输入管，另一枝为液体收集管；外管为气体通路，前端连接一个气

18、囊。供体牛一般经硬膜外注射lidocaine麻醉后进行冲卵。,牛、羊的冲胚器械,滤胚器,羊采胚用具,山羊采胚准备,3冲卵液,最常用的冲卵液是一种加强的磷酸缓冲液（enriched phosphate-buffered Saline,也叫Whittinghams PB1）。 收集胚胎用的冲卵液可不含牛血清白蛋白，但在检查和保存胚胎时必须加入，或者以灭活的胎牛血清代之。 培养液中的血清含量一般为5-20%。,五胚胎的检出和鉴定,把收集到的冲卵液在集卵杯内静止10分钟，待胚胎沉淀后移去上层液并把含有胚胎的液体倒入平皿内，放实体显微镜下检查。用移卵管把找到的胚胎转移到新鲜的PBS液滴内暂存。,（一）胚

19、胎和冲卵液的分离,胚胎移植(13),胚胎移植(14),在完成胚胎检出工作后，在镜下观察，判定胚胎质量。正常发育胚胎的标志是：（1）胚胎整体外观在中等以上，即卵裂球（细胞）大小一致，胞质内颗粒均匀，排列紧密、对称且没有脱落的，透明带没有变形现象；,（二）胚胎的质量判定,（2）发育速度与胚胎日龄相一致一般把这样正常发育的胚胎判定为A级胚胎。把那些整体外观在中等以下，即卵裂球大小不一，许多细胞脱落，有明显的质膜破裂和发育速度明显滞后于胚龄的胚胎，判定为C级。介于A级与C级之间的胚胎，判定为B级。,绵羊桑椹胚,一般来说，在进行胚胎检查等操作时，室温一般不应低于25，最好能保持在37。经质量检查后的胚胎

20、可装入移植管内立即进行鲜胚移植，也可进行冷冻长期保存。,六.受体的同期发情,对母畜进行同期发情一般采取两种手段：一种是延长黄体期：最常用的方法是进行孕激素处理。常用的有孕酮、甲孕酮、甲地孕酮、炔诺酮、氯地孕酮等。处理方法是皮下埋植、阴道栓、口服和肌肉注射等。另一种方法是缩短黄体期的方法有注射促性腺激素注射促性腺激素释放激素注射前列腺素等。,同期发情的方法,1.孕激素阴道栓法 孕激素可通过口服、注射、皮下埋植和阴道放置孕激素缓慢释放装置等方法。皮下埋植或阴道放置缓慢释放装置使用方便易行、效果可靠、成本低廉，尤其是阴道栓法。2.前列腺素及其类似物处理法 对有功能性黄体的母畜于注射后4896h内发情

21、：一次PG法、二次PG法,七胚胎移植方法,1手术法适合小动物。2非手术法适合大家畜。,移植方法分类,动物的全身麻醉：1小白鼠 戊巴比妥钠法，以PBS把戊巴比妥钠以2mg/ml。按体重0.1ml/10mg腹腔注射。2兔 体重在3Kg以上的成年家兔，用戊巴比妥钠以50mg/kg耳静脉注射。3羊 用40mg水合氯醛溶于100ml蒸馏水灭菌后，作颈静脉注射（体重40kg以上）。4猪 耳静脉注射1g苏里塔尔钠（surital sodium）或戊硫代巴比妥酸钠（thiopental sodium）。母猪背朝下放在手术台上，自鼻孔插入麻醉导管，以便吸入O2与麻醉剂（氟烷（halothane）或二氟二氯乙基甲

22、醚。,小鼠胚胎移植法,1、假孕受体的准备进行小鼠胚胎移植之前应该先准备好假孕受体。假孕受体是由结扎公鼠与雌鼠交配，见到阴道栓雌鼠。1） 公鼠输精管的结扎 合适的公鼠龄在6周以上。,操作程序, 麻醉 称重、麻醉 腹部消毒 用70的酒精消毒手术部位 剪毛 如鼠毛过多，可沿腹中线剪毛。 切开皮肤 用钝镊子夹起皮肤，使之离开腹壁，沿腹中线适当位置开口。注意要保持剪刀向上抬起。 切开体壁 用小镊子夹住体壁使之离开肠管，再用眼科剪刀再腹中线剪开1厘米长的切口。不能伤及肠管。 找到睾丸的白色脂肪垫（体） 把一侧的睾丸从阴囊推入腹腔，用小镊子夹住腹壁切开一缘，找到附于睾丸的白色脂肪垫 取出睾丸 用钝镊子夹住脂

23、肪体，将其轻轻拉出，随之睾丸和输精管也被拉出。因睾丸表面光滑，只能通过操作脂肪体来移动和定位。, 结扎输精管 辨认附睾，将附睾下方的输精管夹起。用缝合线穿过结扎。结扎两端后从中间剪断。也可以用灼热的镊子将输精管完全断开。或者剪断一段输精管。 复位 结扎后，拉动脂肪体，使之睾丸和输精管回到腹腔。结扎另外一侧输精管。 缝合和术后处理 手术法缝合刀口。撒适量抗生素。提高环境温度术后12周后才能使用。,2假孕母鼠准备,手术后的公鼠与母鼠合笼。验证其不育后，在根据其所移植的胚胎时期，准备适当的受体母鼠。,小鼠胚胎的子宫移植,用于移植桑椹胚和囊胚。1）暴露子宫 麻醉、消毒 根据体重，注射适当的麻醉药。待动

24、物进入麻醉状态后，用70酒精在其背部消毒，如毛太长就先剪毛。 切开皮肤 在鼠背部近中线处，在最后肋骨水平，切开长约一厘米的纵向口。再用70%酒精擦拭开口，除去带入的毛。 打开体壁 拉动皮肤开口，可见其下的白色脂肪体。用小剪子在脂肪体上方开口。开口时，注意不要伤及较大的静脉。 拉出子宫 用钝镊子夹住脂肪体，从切口拉出。卵巢、输卵管、子宫被相继拉出，使卵巢和输卵管留在外面。并小心移入实体镜下。,2） 准备胚胎移植 准备好移植的胚胎、制作移卵管、吸入胚胎、移卵管的固定。3） 胚胎移植 在子宫适当位置扎1小孔。用钝镊子夹住子宫上端，用缝合针或者针头在子宫下部扎1小孔。保证针孔进入子宫腔，可以轻轻抽出。

25、 移入胚胎。将移卵针沿小孔轻轻插入5mm深，轻轻吹细管，将胚胎吹入子宫。 子宫复位、缝合 用镊子夹住脂肪体将子宫、卵巢、输卵管推回腹腔、缝合。,（三）家畜的胚胎移植1非手术法大家畜牛、马。1）将鉴定后的胚胎装入细管,2） 将细管装入移植枪,山羊的胚胎移植,移植方法（手术法）将母羊仰卧保定，在乳房一侧切开腹壁，将子宫角和输卵管拉出于切口外，如果是从供体输卵管得到的胚胎，将装有胚胎的细吸管插入受体羊输卵管伞口内，缓缓注入到输卵管内。,如果是从供体羊子宫角尖端取得的胚胎，需用个钝针头在距子宫角尖端12厘米处刺一小洞，然后用注射器连接装有胚胎的细导管或弯形针头插入子宫腔中，轻缓地将含有胚胎的培养液注入之后，迅速地使子宫、输卵管复位，再行缝合腹壁。,山羊胚胎移植手术操作,移植移卵操作绵羊胚胎,（四）操作后供体和受体的观察和管理,第三节 胚胎移植的历史和目前研究概况,目前，在奶牛和肉牛，胚胎移植已经商业化，每年都出生大量胚胎移植犊牛。我们在泰康县农户家里进行冻胚移植，产犊率可达到40 %；在松花江奶牛场，鲜胚移植妊娠率在75%，冻胚移植成功率达到50%。,国内外胚胎移植及主要相关生物技术的研究成果时间表,牛胚胎移植主要专项技术国内外水平比较,*饲养管理水平对技术指标影响较大,