第五章种子扩大培养课件.ppt

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1、种子扩大培养,15L种子发酵罐,300L啤酒发酵罐,第一节 种子制备工艺,放罐，后处理,产品,种子扩大培养概念：,种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。,种子扩大培养的原因 工业生产规模的增大 需要种子就增多 种子的扩大培养 种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的培养物，还要获得活力旺盛的、性能稳定、接种数量足够的、纯的培养物。 菌种的活化与种子的扩大培养的区别？,菌种扩大培养小结,（1）为发酵罐的投料提供足够数量的代谢旺盛的种子。 （2）发酵时间的长短

2、与接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。 （3）将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机会。 （4）对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢及生产的规模决定种子扩大培养的级数。,种子质量的优劣对发酵生产起关键作用。其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。,种子液(几或几十立方米),按10%接种量,发酵罐(几十或几百立方米),由实验室制备到车间生产的过程,作为种子的要求：1)、菌种活力强，移种后能迅速生长，迟缓期短2)、生理性状稳定3)、菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求4)、无杂菌污染5)、保持稳定的生

3、产能力,菌种的培养方法：,固体培养法液体培养法(两类）,种子制备的过程大致可分为：实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段,一、 实验室种子制备,保藏在沙土管、冷冻干燥管或斜面上的菌种经无菌操作接入适合于孢子发芽或者营养体生长的斜面培养基上，经培养成熟后挑选正常的孢子或营养菌体再一次接入试管斜面反复培养几代。 这一阶段也称为活化，目的是使保藏的菌种达到正常稳定的生长代谢速度。,斜面活化的菌种进一步扩大培养，根据菌种特性的不同可采用不同的培养方法。,接入斜面/平板，培养成熟后，挑选孢子，再一次接入斜面/平板，进行活化。(两次转接),A、砂土管或冷冻干燥管菌种活化,可采用固体培养基培养孢子，直接作

4、为种子罐的种子。 举例:产黄青霉菌，采用大米或小米为固体培养基，装入摇瓶、灭菌，要注意控制米粒含水量，使米粒不粘不散。接入孢子，25-28培养14d。培养结束，将孢子瓶于真空下抽去水分，使含水量10以下，冰箱保存备用。,B、产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种,可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡培养，获得菌丝体，作为种子。 例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。,C、产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种,生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。 斜面菌种于32，培养18-24h，即可移入250mL摇瓶液体培养基，32培养12h，即可作种子罐种子。 例如：谷氨酸棒状杆菌。,D、不产孢子的细菌,一

5、般保存在麦芽汁琼脂培养基或MYPG培养基的斜面上，4冰箱保存.每年移种3-4次。 斜面菌种接入含10mL麦芽汁试管25-27培养2-3d扩大至三角瓶25培养2d移至含5-10L麦芽汁的罐15-20培养3-5d含100L麦芽汁的发酵罐。,E、生产啤酒的酵母菌,MYPG培养基：3g麦芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨, 10g葡萄糖,20g琼脂,1L水。,二、生产车间种子制备,采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。,种子罐培养原则：,以实验室制备的孢子或摇瓶营养细胞做种子，经种子罐扩大培养后，满足发

6、酵罐对种子的要求。,摇瓶菌丝体种子：种子罐之间或发酵罐间的移种：,接种方法：,可在火焰保护下接入种子罐或采用压差法接入。,主要采用压差法，由种子接种管道进行移种，移种过程中要防止接受罐表压降至零.,?,A 种子罐级数的确定,种子罐级数指制备种子需扩大培养的次数.,种子罐的作用？,种子制备的工艺过程中，因菌种不同，一般可以分为一级种子、二级种子和三级种子。,菌种是如何分级的呢？,种子罐的级数主要取决于菌种的性质、菌体生长速度、产物品种、生产规模及发酵设备的合理利用率。,一级种子接入发酵罐发酵称为二级发酵二级种子接入发酵罐发酵称为三级发酵。依次类推可知发酵的级数=种子级数+1,种子罐级数的意义：

7、种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少移种带来染菌机会。 但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率。因此，种子罐级数不宜过少。,种子罐级数随菌种及规模而定，也与工艺条件有关。 优化种子罐培养条件，加速孢子发芽及菌体繁殖，也可减少种子罐的级数。,1、生长快的细菌，种子用量少，种子罐相应也少。 例如：谷氨酸生产中，菌接入种子罐32培养7-10h，即可接入发酵罐作为种子，这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。,2、生长较慢的菌种，种子用量大，种子罐相应也多。 例如：青霉素孢子悬液接入一级种子罐（发芽罐）于27培养40h，孢子

8、发芽，长出短菌丝。再移至第二级种子罐（繁殖罐），27培养10-24h，菌丝迅速繁殖，获粗壮菌体，即可移至发酵罐，这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。一般50m3发酵罐都采用三级发酵。,3.生长更慢的菌种 链霉素生产菌种灰色链霉菌，一般采用三级种子罐扩大培养。在小型发酵罐(530L)进行试验时，也有采用直接孢子或菌丝体接入罐中发酵，称一级发酵。,影响种子质量的因素种子质量的判断种子质量的控制,第二节 影响种子质量的因素,一、种子质量标准,作为种子的质量准则：1)、菌种活力强，移种后能迅速生长，迟缓期短2)、生理性状稳定3)、菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求4)、无杂菌污染5)、保持稳定

9、的生产能力,判断种子的优劣可以从以下几方面进行：,细胞或菌体菌体形态：可通过显微镜下观察，要求是菌体健壮、菌形一致均匀整齐，有的还有一定的排列。菌体浓度：离心沉淀法、光密度法、细胞计数法培养液的外观：颜色、粘度等,判断种子的优劣可以从以下几方面进行：,生化指标 （1）种子液的糖、氮、磷含量的变化和PH变化 菌体生长繁殖、物质代谢的反映 （2）种子液产物的生成量 种子生产能力和成熟程度的表现 （3）测种子液中某种酶的活力 如土霉素生产种子液中的淀粉酶活力与土 霉素发酵单位有一定的关系,种子的质量主要受孢子质量、培养基、培养条件、种龄和接种量等因素的影响。以下分别从影响孢子质量和影响种子质量两个方

10、面说明种子质量的主要因素及控制措施。,二、影响种子质量的因素,（一）影响孢子质量的因素,培养基培养温度和湿度培养时间和冷藏时间接种量,1、培养基,生产过程中经常出现孢子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响也不同。原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机离子含量不同，如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。,水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响孢子质

11、量。菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。,2、培养条件,（1）温度 温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。如土霉素生产菌种在高于37C培养时，孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，菌丝过早自溶，效价降低等现象。一般各生产单位都严格控制孢子子斜面的培养温度。,（2）湿度 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的影响。例如土霉素生产菌种龟裂链霉菌，孢子制备时发现：在北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干疤状，孢子稀少。在气温高含湿度大的地区，斜面孢子长得

12、慢，主要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。从表中看出相对湿度在40%-45%时孢子数量最多，且孢子颜色均匀，质量较好。,3、培养时间和冷藏时间,（1）培养时间一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。,（2）冷藏时间斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4C冰箱保存，发现冷藏7-8天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如在链霉

13、素生产中，斜面孢子在6C冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。,4、接种量制备孢子时的接种量要适中，接种量大小都会影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。凡接种后菌落均匀分布整个斜面，隐约可分菌落者为正常。另外接入种子罐的孢子接种量对发酵也有影响。比如青霉素产生菌之一球状菌的孢子接种数量对青霉素发酵产量影响极大，因为孢子数量过少，则进罐后长成的球状体过大，影响通气效果，若孢子数量过多，则尽管后不能维持好的球状体。,影响种子质量的因素：,（1）培养基有利于菌体和孢子生长成分要适当的丰富和完全成分应尽可能的与发酵培养基接近种子培养基要稀薄一些，发酵培养基要

14、浓一点,（2）培养条件合适的温度通气搅拌培养基的灭菌质量培养基成分逐级的接近发酵培养的条件,影响种子质量的因素：,3、种龄种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好。,种子的培养时间,4、接种量接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁

15、殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。,通常接种量，细菌1-5%，酵母菌5-10%，霉菌7-15%，有时20-25%。,A 菌种稳定性的检查 生产菌种，必须保持稳定的生产能力，虽然菌种保藏在休眠状态的环境中，但微生物或多或少会出现变异的危险，因此定期考察及挑选稳定菌种十分重要。 方法：取少许菌种，逐级稀释，划线培养。挑出形态整齐、孢子丰满的菌落，摇瓶试验，测定生产能力。,种子质量的控制,B 无(杂)菌检查 种子制备过程中，每移种一步，均需进行杂菌检查。 方法：镜检、肉汤或平板培养、种子液生化分析。 生化分析项目：营养消耗的速度、pH变化、溶氧利用情况、色泽、气味有否异常等。,思考题1.影响种子质量的因素有哪些，种子质量如何控制？2.易生孢子菌种和不易生孢子菌种种子的扩大培养工艺有何不同？,