色谱分析法概论ppt课件.ppt

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1、仪 器 分 析INSTRUMENTAL ANALYSIS,教 师： 谢 宝 平,电化学分析紫外可见分光光度法荧光分析法红外光谱法原子吸收分光光度法核磁共振波谱法质谱法,仪器分析方法,消除干扰,加入掩饰剂控制分析条件,分离出待测物质,复杂组分分析,分离在分析中的作用,(1) 将被测组分从复杂体系中分离后测定(2) 把对测定有干扰的组分分离除去(3) 将性质相近的组分相互分开(4) 把微量或痕量的待测组分分离富集,复杂组分分析,常用分离方法,蒸馏分离法重结晶分离法沉淀分离法溶剂萃取分离法,超临界萃取离子交换分离法膜分离技术色谱分离方法,分离前的体系：均相；两组分A、B的分离分离体系总是两相：液-液

2、；液-固；气-液,色彩,An Introduction to Chromatography,（chromatography）,色谱分析法概论,色谱分析法,高效能的物理分离,检测手段,检测,+,碳酸钙粉末（固定相）,色素混合液,石油醚 (流动相）,色谱柱,色谱,1906年，Tsweet发明的色谱法,装碳酸钙固体颗粒的玻璃管 色谱柱（column）碳酸钙固体粉末 固定相（stationary phase）洗涤用的石油醚 流动相（mobile phase） 或洗脱剂（eluent）,几个概念,色谱法的发展,色谱法的发展,1948年，Tiselins，电泳和吸附分析1952年，Martin和Synge

3、，分配色谱2002年，John B. Fenn，Koichi Tanaka：生物大分子的质谱分析法,诺贝尔奖：,色谱法的发展,现在：,固定相除了固体，还可以是液体 流动相液体或气体 色谱柱各种材质和尺寸 被分离组分不再仅局限于有色物质,色谱学是现代分离科学的基础；色谱法是目前分析复杂混合物不可缺少的技术；色谱法在各个学科和领域有着广泛的应用。,色谱法的发展,智能化、自动化、在线式高效、联用技术多维色谱微分离,发展方向：,参考书：,仪器分析，叶宪曾，北京大学出版社，第2版 色谱技术丛书气相色谱检测方法，吴烈钧气相色谱方法及应用， 刘虎威液相色谱检测方法，云自厚高效液相色谱方法及应用，何丽一离子色

4、谱方法及应用，牟世芬毛细管电泳技术及应用，陈义,第一节 概 述,色谱法(chromatography)： 以试样组分在固定相和流动相间的作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法。,一、定义,二、色谱法分类,1.按流动相和固定相分子聚集状态分类,流动相 固定相 类型,超临界流体,超临界流体色谱SFC,2.按操作形式分类,柱色谱（column chromatography) 填充柱色谱； 整体柱色谱；毛细管柱色谱,毛细管电色谱（capillary electrochromatography，CEC）,二、色谱法分类,paper chromatography,thin layer chromat

5、ography,thin film chromatography,plane chromatography,液-固色谱,气相色谱,3.按色谱过程的分离机制分类,分配色谱法 (patition chromatography)吸附色谱法 (adsorption chromatography)离子交换色谱法 (ion exchange chromatography)空间排阻色谱法 (steric exclusion chromatography)键合相色谱法 (bonded phase chromatography)毛细管电色谱（capillary electrochromatography）,二、

6、色谱法分类,4.按使用目的分类,分析用色谱仪制备用色谱仪,二、色谱法分类,优点：“三高”、“一快”、“一广”,高选择性可将性质相似的组分分开 高效能反复多次利用组分性质的差异 产生很好分离效果 高灵敏度10-1110-13g，适于痕量分析 分析速度快几几十分钟完成分离 一次 可以测多种样品 应用范围广气体，液体、固体物质 化学衍生化再色谱分离、分析,三、色谱法的特点,缺点：,对未知物分析的定性专属性差需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS),三、色谱法的特点,第二节 色谱法的基本原理,实现色谱分析的基本条件,相对运动的两相流动相、固定相,各组分与固定相的作用存在差异,两个组分被流动相携

7、带移动的速度不同 差速迁移，两组分被分离,一、色谱过程,色谱过程是物质分子在相对运动的两相分配“平衡”的过程。,吸附色谱：吸附 解吸再吸附 再解吸 多次洗脱 差速迁移 分离,二、色谱图有关概念,纵坐标：检测器的响应信号横坐标：时间、体积或距离。,1.色谱图（色谱流出曲线） 根据检测器输出的信号强度对流出时间或体积等所绘曲线,（一）色谱图和色谱峰,色谱柱仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线。,2. 基线,（一）色谱图和色谱峰,基线,（一）色谱图和色谱峰,噪音：各种未知的偶然因素引起的基线起伏漂移：基线向某个方向稳定移动（仪器未稳定造成）,噪音,漂移,3.色谱峰（峰高、峰面积、峰位、峰宽）,（一）色

8、谱图和色谱峰,流出曲线上的突起部分，检测器对组分的响应信号,色谱峰,色谱峰的个数：组分的最小个数,fs =0.951.05,拖尾因子(tailing factor, fs)又叫对称因子,正常峰（对称峰）,色谱峰,拖尾峰,保留时间、死时间、调整保留时间保留体积、死体积调整保留体积相对保留值,(二)定性参数保留值,保留时间: tR 进样到某组分色谱峰顶点的时间间隔，即组分 在色谱柱中的停留时间或组分流经色谱柱所需要的时间。,死时间：t0 分配系数为零的组分的保留时间，即组分在流 动相中的停留时间或流动相流经色谱柱所需要的时间.,调整保留时间：tR= tR -t0，是组份在固定相中的滞留时间,保留体

9、积：VR 通过色谱柱所需流动相体积 VR = tR FC FC为流动相流速死体积： V0 由进样器至监测器的流路中未被固定相占有的空间。 V0 = t0 FC,调整保留体积：V R = VR-V0，与FC无关。,相对保留值：r（也用表示, 又称选择因子 ） 组份的调整保留值之比，色谱系统的选择性指标。,（三）定量参数峰高和峰面积,峰高：h 色谱峰顶点与基线的距离。峰面积：A 色谱曲线与基线间包围的面积,标准差： 正态分布曲线上两拐点间距离的一半 0.607倍峰宽处的一半半峰宽： 峰高一半处的峰宽 W1/2=2.355峰 宽： (W) W=4 或 W=1.699W1/2 色谱峰两侧拐点上切线与基

10、线的交点间的距离,（四）柱效参数色谱峰区域宽度,（五）分离效能指标分离度,分离度 R ：相邻两组分色谱峰保留时间之差与两色谱峰宽度均值之比,R 越大，相邻组分分离越好。当R=1.5时，分离程度可达99.7%，R=1.5常用作是否分开的判据,色谱峰数样品中单组份的最少个数； 色谱保留值定性依据； 色谱峰高或面积定量依据； 区域宽度衡量色谱柱效； 分离度组分分离效能程度。,色谱流出曲线的意义,K 与组分，固定相、流动相性质及温度有关 与两相体积、柱管特性和所用仪器无关,（一）描述分配过程的参数,三、分配系数与色谱分离,1、分配系数 (K)：,2.保留因子(k)：分配比、质量分配系数、容量因子,其中

11、VmV0，为流动相的体积；Vs为固定相体积,3. K 与 k 的关系：,k与温度、压力、两相体积有关,（一）描述分配过程的参数,三、分配系数与色谱分离,（二） tR 与 K、k 的关系:,色谱过程方程 表示保留时间与分配系数的关系,三、分配系数与色谱分离,（三）色谱分离的前提,色谱分离的前提组分在两相间分配系数 K 不同或分配比 k 不同,一、吸附色谱法二、分配色谱法三、 离子交换色谱法 四、空间排阻色谱法,第三节 色谱分离机制,一、吸附色谱法,分离机制：利用吸附剂对不同组分吸附能力差异实现分离,吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分开,吸附平衡 Xm + nYaXa + nYm,吸附系数,吸附平衡

12、 Xm + nYaXa + nYm,Ka与组分性质、吸附剂活性、流动相性质及温度有关,保留时间与Ka和Sa的关系为,一、吸附色谱法,固定相和流动相： 固定相吸附剂（硅胶或Al2O3） 流动相气体或有机溶剂（洗脱能力由极性决定）,色谱柱一定时，Ka大的组分吸附强，后被洗脱,洗脱顺序：,烷烃非极性，不被吸附；不饱和化合物比饱和化合物的吸附能力强；基本母核相同，取代基极性越强，吸附能力越强,一、吸附色谱法,狭义分配系数,分离机制 利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离,连续萃取过程,K与组分性质、流动相性质、固定相性质及柱温有关,二、分配色谱法,固定相和流动相：固定相机械吸附在惰性载体上的液体

13、流动相必须与固定相不为互溶,正相分配色谱：流动相极性弱于固定相反相分配色谱：流动相极性强于固定相,GLC：气体，常为氢气或氮气LLC：与固定相不为互溶的液体,二、分配色谱法,正相分配色谱：极性强的组分后出柱反相分配色谱：极性强的组分先出柱,洗脱顺序： 相似相溶原理,二、分配色谱法,选择性系数,分离机制：依据被测组分与离子交换剂交换能力不同而实现分离,三、离子交换色谱法,固定相与流动相：固定相离子交换树脂，硅胶键合离子交换剂被交换基团：SO3H,COOH, NR3+OH- 。性能指标：交联度、交换容量、粒度等。流动相一定pH和离子强度的缓冲溶液被分离组分离子型的有机物或无机物,三、离子交换色谱法

14、,KA/B越大，交换能力越大，越易保留，后出柱,洗脱顺序：,影响保留行为的因素离子电荷数越大，KA/B越大，保留时间越长交换树脂交联度越大，组分保留时间长流动相的离子强度提高，组分保留值降低,三、离子交换色谱法,四、空间排阻色谱法,分离机制,渗透系数,利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离,注：Kp仅取决于待测分子尺寸和凝胶孔径大小，与流动相性质无关,固定相与流动相： 固定相多孔性凝胶 流动相水凝胶过滤色谱 流动相有机溶剂凝胶渗透色谱,洗脱顺序：,保留值常用保留体积表示,分子线团尺寸（分子量）大的组分，渗透系数小，保留体积小，先被洗脱出柱。,四、空间排阻色谱法,四种色谱类型的比

15、较,四种色谱的分离机制各不相同，分别形成吸附平衡、分配平衡、离子交换平衡和渗透平衡K分别为吸附系数，狭义分配系数，选择性系数和渗透系数分配系数大的组分保留时间长（保留体积大），晚流出色谱柱。,物质对分离的两种情况,提高分离度R,理想的色谱峰为什么是正态分布的？为什么峰会变形、展宽？如何评价色柱的分离效能？,组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制； （与分配系数有关）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制； （两相中的运动阻力，扩散）,第四节 色谱理论基础,热力学理论： 塔板理论（Plate Theory）动力学理论： 速率理论（Velocity Theory）,一、塔板理论,塔板理论（plate

16、 theory）,第一次平衡称为一个理论塔板,H为理论塔板高度,始于马丁（Martin）和辛格（Synge）提出的塔板模型。把色谱柱比作一个蒸馏塔，把色谱分离过程比作蒸馏过程。,塔板理论假定：1）样品和新鲜载气都加在第0号塔板上，且样品的纵向扩散可以忽略。2）在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；3）每次分配的分配系数相同；4）流动相以不连续方式加入。,假设某柱理论塔板数 n=5，塔板编号 r0,1,2,3,4。 组分A的保留因子kA = 2，组分B的保留因子kB = 0.5单位量（如1mg）组分 A、B 进入色谱柱进行分配。,n0,n1,n2。n4,一、塔板理论,1.质量分配和转移,0,

17、1,2,3,4,载 气,固 定 相,分配色谱过程示意图（塔板理论示意）,kA=2 kB=0.5,0,1,2,3,4,载 气,固 定 相,kA=2 kB=0.5,分配色谱过程示意图（塔板理论示意）,0,1,2,3,4,载 气,固 定 相,kA=2 kB=0.5,分配色谱过程示意图（塔板理论示意）,0,1,2,3,4,载 气,固 定 相,kA=2 kB=0.5,分配色谱过程示意图（塔板理论示意）,0,1,2,3,4,载 气,固 定 相,kA=2 kB=0.5,分配色谱过程示意图（塔板理论示意）,k=1组分的流出曲线,浓度最大值出现在载气体积数 n=89处,仅经过5个塔板，两组分即开始分离，k小的先

18、洗脱,当塔板数很大时，组分有微小的分配系数差别便能获得良好的分离效果，流出曲线一般趋近正态分布。,正态分布曲线。,k=1组分的流出曲线,一、塔板理论,2.流出曲线方程,不论ttR或ttR，cCmaxc随t向峰两侧对称下降，t越大，色谱柱流出的色谱峰越扁平越小，峰越尖锐,理论塔板数,理论塔板高度,（柱长为L）,根据色谱流出曲线导出,一、塔板理论,3.塔板数和塔板高度柱效能指标,在死时间内不参与分配!扣除死时间的影响，引入neff和Heff作为柱效指标。,有效塔板数,有效塔板高度,柱长L一定时，n或neff越大，H或Heff越小组分的分配次数越大，色谱峰越窄，柱效能越大；同一色谱柱对不同组分的柱效

19、能不同，用neff或Heff衡量柱效能时，应指明测定物质。柱长L一定时，H增大，N减小，导致W增大，色谱峰扩展,当 k 很小时，n与neff，H与Heff相差很大,当k 很大时，n与neff，H与Heff趋于一致,用n或H比较柱效时，应说明溶质的k 值,75,（1）导出的流出曲线方程较好地解释了色谱峰形的正态分布规律（2）提出了评价柱效能指标：N和H，Neff和Heff,一、塔板理论,4、塔板理论的贡献：,76,5、塔板理论的不足：,（1）没有考虑动力学因素对色谱过程的影响，不能解释载气流速u对理论塔板数n的影响（2）不能回答色谱峰为什么发生变形（3）不能说明塔板高度受什么因素影响,一、塔板理

20、论,二、 速率理论影响柱效的因素,速率理论（Rate theory） 1956年，荷兰化学工程师van Deemter提出了色谱过程动力学速率理论：吸收了塔板理论中的板高H概念，考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而给出了van Deemter方程：,涡流扩散项,分子扩散项,塔板高,传质阻力项,A，B，C为常数u为载气的平均线速度,速率方程（van Deemter方程式）,当u一定时，减小A、B、C三项可提高柱效 在A、B、C较小时，H较小，柱效较高； 反之则柱效较低，色谱峰将展宽。,填充物颗粒大小及填充的不均匀性同一组分运行路线长短不同流出时间不同，峰形展宽,1）涡流扩散项 (A),1）涡

21、流扩散项 (A),使用细粒固定相并填充均匀可减小A，提高柱效对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0。,展宽程度以A表示： A=2dp其中dp填充物平均直径； 填充不规则因子。,2）分子扩散项 (B/u), 称为弯曲因子，固定相对分子扩散阻碍情况D组分在流动相中的扩散系数,由于浓度梯度引起的,B = 2D,球状颗粒； 大分子量流动相； 适当增加流速；,讨论：,分子量大的组分，Dg小，即B小 Dg 随柱温升高而增加，随柱压降低而减小； 流动相分子量大，Dg 小，即 B 小； u 增加，组份停留时间短，纵向扩散小； 对于液相色谱，因Dm 较小，B 项可勿略。,B=2D,短柱； 低温。,2）分子扩散项

22、 (B/u),3）传质阻力项 (Cu),传质阻力的存在，使分配不能“瞬间”达至平衡，因此产生峰形展宽。,a）气液色谱：气体为流动相，C 包括气相传质阻力系数 Cs 和液相传质阻力系数 Cl 。,3）传质阻力项 (Cu),降低传质阻力方法：减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气。,k为分配比； Dg 、DL为扩散系数；dp为填充物大小； df液膜厚度,a）气液色谱：,3）传质阻力项 (Cu),b）液液色谱：液体为流动相，传质阻力项 C 包括流动相传质阻力系数 Cm 和固定相传质阻力系数 Cs 。,3）传质阻力项 (Cu),降低C的方法：细颗粒固定相、增加组分在固定相和流动相中的扩散系数D等,K：

23、分配比 Dm 、Ds：扩散系数Dp：填充物大小 df：液膜厚度,3）传质阻力项 (Cu),4）流速u,H = A + B/u + Cu,涡流扩散项A与流速u无关；,低流速区，分子扩散项 (B/u) 大 分子量大气体如N2和Ar为载气提高柱效,高流速区，传质阻力项 (Cu)大 分子量小气体如H2和He为载气提高柱效,曲线最低点对应最佳线速uopt下最小板高Hmin采用较uopt略高的线速度缩短分析时间,H-u曲线,（1）阐述了色谱因素（柱温、色谱柱填充的均匀程度、填料颗粒的大小、流动相的种类、流动相的流速、固定相的液膜厚度等）对柱效能的影响情况,Van Deemter 方程的贡献,（3）为色谱分析工作选择最佳分离条件提供理论依据,（2）较好地解释了色谱峰扩展的原因,二、 速率理论影响柱效的因素,