分解纤维素的微生物的分离课件.ppt

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1、问题探讨：1、植物体内的多糖、二糖、单糖你知道有有哪些？2、纤维素的基本组成单位是什么？3、纤维素主要分布在植物细胞的什么结构中？有什么作用？4、你知道哪种植物纤维素的含量最高？在植物体内纤维素主要分布在哪些器官中？5、我们人能分解纤维素吗？为什么？平常膳食中为什么强调多吃富含纤维素的食物？牛羊等草食性动物为什么可以只以草为食物而生存？6、纤维素有什么作用？农业生产中有大量的家农作物桔杆，你认为应如何有效利用？,纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是自然界中含量最丰富的多糖类物质。,纤维素：棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物；,地球上植物每年产生的纤维素超过70亿吨；主要分布植

2、物的根、茎、叶中，其中40%-60%能被土壤中某些分解利用。,纤维素是地球上最古老、最丰富的天然高分子，是取之不尽用之不竭的，人类最宝贵的天然可再生资源主要作用：1、纺织造纸 2、生理作用 膳食纤维 人类膳食中的纤维素主要含于蔬菜和粗加工的谷类，是一种不被消化吸收的物质，过去认为是“废物”，现在认为它在保障人类健康，延长生命方面有着重要作用。纤维素的主要生理作用是吸附大量水分，增加粪便量，促进肠蠕动，加快粪便的排泄，使致癌物质在肠道内的停留时间缩短，对肠道的不良刺激减少，从而可以预防肠癌发生。另由于纤维素比重小，体积大，在胃肠中占据空间较大，使人有饱食感，有利于减肥所以称它为第七种营养素。 在

3、草食性动物等的消化道内，共生有分解纤维素的微生物，草食动物则依赖其消化道中的共生微生物将纤维素分解，从而得以吸收利用。而人没有分解纤维素的能力。,土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。,农作物秸秆：米秸、麦秸、稻草、草、木屑 等富含大量的纤维素，被利用的机会很少、效率低；,科学家正致力于研究，怎样将农业废弃物、木材及生长更为迅速的草本植物，转化为种类繁多的生物燃料。如人类可应用分解纤维素的微生物将秸秆等废弃物转变成酒精。纤维素生物燃料，最有希望替代石油能源,用纤维素酶处理服装面料等。纤维素酶在染整上得到了广泛的应用，特别在棉织物整理上，经过纤维素酶整理后，棉织物的手

4、感和外观获得很大的改善，因为织物表面的绒毛被除去，处理后织物更光洁，颜色更鲜艳。根据处理的目的不同，可进行生化抛光、柔软滑爽、改善光泽以及石磨水洗等加工。,课题3 分解纤维素的微生物的分离,纤维素与纤维素酶,1.纤维素,纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。,一、基础知识,植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。,纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。,2.纤维素酶 纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解

5、成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。,取二支20mL的试管,实验：纤维素酶分解纤维素的实验,各加入一张滤纸条,各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液11ml和10ml,甲 乙,在乙试管中加入1mL纤维素酶,两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min的摇床上振荡1h,结果：乙试管的滤纸条消失,讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？,在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；,思考1实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？,滤纸崩溃法,注意：在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的pH。,（二）纤

6、维素分解菌的筛选,1、筛选纤维素分解菌的方法_。该方法可以通过_反应直接筛选。,刚果红染色法,颜色,2、其原理是：刚果红可以与纤维素形成_，当纤维素被_分解后，红色复合物无法形成，出现以_为中心的_，可以通过_ 来筛选纤维素分解菌。,红色复合物,纤维素酶,纤维素分解菌,透明圈,是否产生透明圈,可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌,四种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈,透明圈越大，分解纤维素的能力越大。,练一练：,1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是,A. 纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B. 纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C. 纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D. 葡萄糖苷酶可把纤维

7、素分解成葡萄糖,2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是,A. 刚果红能与纤维素形成红色复合物 B. 刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C. 刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D. 若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌,二、实 验 设 计,请你根据实验流程图和提供的三个资料以及“操作提示”，在思考有关问题的基础上，设计出一个详细的实验方案。,实验设计,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布到鉴别培养基,挑选菌落,什么样的环境取样?依据是什么？, 培养的目的? 分析其选择培养基组成，为什么没有用琼脂？,挑选什么样的菌落?,为什么用鉴别培养基的特点进行分离?原理是什

8、么？此方法叫什么方法？,取样环境,1、土壤取样：,富含纤维素的环境中,操作步骤,生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。,原因,实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。,讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？,将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。,2、选择培养,增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。,目的：,制

9、备选择培养基：,操作：,参照课本29页旁栏中的比例配置，回答下列问题：旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？答：是液体培养基，原因是配方中无凝固剂。这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？答：有选择作用，本配方中的碳源主要是纤维素，所以能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用答：用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照。或将培养基中纤维素粉变为葡萄糖,制备选择培养基：,说明：分析“纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以

10、纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。,酵母膏：是采用新鲜酵母为原料，经酵母酶解自溶、分离过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有酵母自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色至浅棕色，较澄清。酵母浸膏富含蛋白质、氨基酸类、肽类、核苷酸、B族维生素、微量元素。主要作用是补充氮源和提供微生物生长的各种维生素及氨基酸及生长因子。一般的用量为0.2%2.0%。,水解酪素（分为酸水解酪素和酶水解酪素）：是以天然牛奶蛋白为原料，经盐酸水解、脱色、脱盐、喷雾干燥而成的产品，氨基酸种类齐全，含氮和蛋白量均大于80%。氨基酸是合成蛋白质的基础，是人、动植物、微生物最基本的营养成分之一。人和微生物可通过蛋白质间接获

11、取氨基酸，但需要胃酸和酶的水解，当蛋白质被盐酸水解成氨基酸组分时药用级可作为能量合剂直接供给人们补充能量，试剂级可用作微生物的培养基。性状白色或浅黄粉末、易溶于水、极易潮解、具有酱香味。,培养基成分分析,2、选择培养,增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。,目的：,制备选择培养基：,操作：,将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养12天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。,旁栏思考题为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？提示：在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件

12、的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。,思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？,本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样制成的菌悬液素梯度稀释后直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题先通过选择培养基培养（液体），使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液梯度稀释后涂布在鉴别培养基上进行分离。其他步骤基本一致。,将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择培养基上,将细菌涂布在只有纤维素粉做碳源的选择培养基上,固体培养基,液体培养基,筛选菌株,选择培养,按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101107倍。,3.梯度稀释,4.将样品

13、涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,（1）制备鉴别培养基:参照课本旁栏中的比例配制,（2）倒平板操作,（3）涂布平板：,鉴别纤维素分解菌的培养基,(水溶性羧甲基纤维素钠),羧甲基纤维素钠又称羧甲基纤维素，简称CMC或CMC-Na。羧甲基纤维素钠的来源为棉花或纸浆等纤维用水媒法或溶媒法制成。为白色或微黄色纤维状或颗粒状粉末或粗粉，无臭、无味，溶于水，有吸湿性。在面条、速食面条、速食米粉中添加量0.1% 0.5%，可使制品膨胀而组织润滑，口感良好，不易变形；在面包、饼干、糕点中添加0.1%0.2%，可防止水分蒸发和老化，防止油脂渗出，使产品表面光滑，口感细腻；在肉类制品、禽蛋、水 果、蔬菜中则以2%

14、3%的水溶液喷洒在食物表面形成一种极薄的膜，可长期贮存食物，保持风味，防止发酵，食用时用水冲洗即可；CMC无营养价值，会吸水胀润，使人有饱腹感，可以用作减肥食品。,纤维素分解菌的鉴定培养基为何要加入土豆汁？1、微生物对于碳源的利用是有一定顺序的，先利用好用的（如土豆汁里的淀粉）再利用难用的（如纤维素），即便是纤维素分解菌也是如此2、之前因为目的是培养，不用担心不能形成菌落的问题，所以用纤维素作为唯一碳源，把纤维素分解菌初步筛选出来。后来鉴别的时候因为进行了涂布，菌体密度大大下降，为了让单个菌体更好的存活下来，形成菌落，就必须先让这个单细胞菌体发展到一定数量，于是在鉴别培养基中要加入一定量的土豆

15、汁以提供淀粉这种好利用的碳源，当然此时淀粉分解菌也发展起来了，但是加入的淀粉量毕竟是少数，,在淀粉分解菌还未能发展到一个菌落的时候淀粉就用完了，只剩下纤维素了，此时发展到一定数量的纤维素分解菌就能继续利用纤维素发展成一个菌落，而淀粉分解菌因为不能继续利用纤维素于是增殖受阻（这也是为什么当我们观察到淀粉分解菌形成假阳性反应的时候只是一个淡淡的圈，没有纤维素分解菌形成的圈那么明显）。所以，本试验中加入土豆汁的原因就是为了先让单个的纤维素分解菌繁殖到一定数量，以便形成菌落,4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,（1）制备鉴别培养基:参照课本旁栏中的比例配制,（2）倒平板操作,（3）涂布平板：

16、将稀释度为104106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30倒置培养。,挑选产生透明圈的菌落(参照课本刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落,即为分解纤维素的菌落.),方法一：先 ，再加入刚果红进行颜色反应。方法二：在 时就加入刚果红。,培养微生物,倒平板,5.刚果红染色法,挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。,这两种方法各有哪些优点与不足？,颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用,操作繁琐刚果红会使菌落之间发生混杂,操作简便不存在菌落混杂问题,1.产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈2.有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成

17、了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚红指示剂，如果pH升高指示剂会变红,刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈,观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌,观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌,脲酶检测法,刚果红染色法,方法一中NaCl溶液的作用？,思考：,漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上

18、去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！,在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C 370C培养，可获得纯化培养。,6、纯化培养,四、结果分析与评价,1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。 如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。 2.分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。,为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_实验，纤维素酶的发酵方法有_ 发酵和_ 发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的_ 含量进行定量测定。,发酵产纤维素酶,液体,固体,葡萄糖,五、课题延伸,分解纤维素的微生物的分离,纤维素酶,种类、作用、催化活力,刚果红染色,筛选原理,实验设计,土壤取样,选择培养,涂布培养,纯化培养,前置染色法后置染色法,富含纤维素土壤,增大分解菌含量,染色鉴别,分离出分解菌,课堂总结,