荧光原位杂交技术ppt课件.ppt
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1、荧光原位杂交技术,荧光原位杂交技术,第一节 原位杂交技术简介第二节 荧光原位杂交技术的应用第三节 原位杂交操作步骤第四节 影响杂交的因素第五节 荧光原位杂交技术的新进展,原位杂交技术简介in situ hybridization,原位杂交技术的基本原理是根据核酸分子碱基互补配对的原则, 将有放射性或非放射性标记的外源核酸(探针)与经过变性后的单链DNA互补配对,结合成专一的核酸杂交分子,再经一定的检测手段将待测核酸在染色体、细胞或组织上的位置显示出来的一项技术。该技术最早是Pardue and Gall (1969)和John et al. (1969)分别独立建立起来的。当时使用的放射性标记
2、探针,利用放射自显影检测一些高度重复序列DNA在染色体上的定位,此后原位杂交技术日益成为生物医学领域的一种十分重要的技术手段。尽管放射性标记探针灵敏度很高,能够检测小至几百个碱基对的DNA序列,但是由于同位素的安全问题、半衰期、信号统计等限制了此项技术的广泛应用,后来逐渐发展出了非放射性标记探针原位杂交技术。,原位杂交操作步骤,一、准备载玻片和固定材料二、染色体标本制备和预处理三、探针制备及标记四、染色体标本变性五、杂交六、杂交后洗脱七、免疫细胞化学检测八、荧光显微镜观察及显微摄影,染色体标本制备,预处理,1、RNA酶处理 1) 每张玻片加100 l 100 g/ml RNase A (in
3、2x SSC) 37处理1小时 2)用2x SSC洗35min 3)70%,80%,100%乙醇系列脱水,每级5分钟2、胃蛋白酶处理 1) 0.005-0.02% pepsin(10 mM HCl) 37处理10 min 2) 1PBS洗25min 3) 1PBS,50 mM MgCl2处理5min 4) 1PBS,50 mM MgCl2,1%甲醛固定10min 5) PBS洗涤并脱水,气干,非放射性标记法,直接法荧光素(fluorescein)或其他荧光染料 间接法地高辛(digoxigenin)生物素(biotin),1. 随机引物法2. 缺口平移法3. PCR法4. 寡核苷酸末端标记法5
4、. 直接在探针3或5端合成,1. 0.5ml离心管中加入1ug探针DNA,加水置体系为16ul2. 沸水浴中变性10min, 马上置于冰水中3. 加入4ul DIG-High Prime(5x buffer; 50% glycerol;1 U/l Klenow enzyme; 5x random primer mix; 1 mM each of dATP, dCTP, and dGTP; 0.65 mM dTTP; and 0.35 mM DIG-11-dUTP) 4. 混匀离心,置于37温育1小时20小时5. 65 处理10min终止反应,染色体标本变性,共变性杂交液加到标本上封片,置80
5、烘箱中10分钟分别变性70%甲酰胺,2xSSC 70 处理2分钟70%,85%,100%冷乙醇系列脱水,空气干燥,1. 杂交液(50% 去离子甲酰胺, 2x SSC, 10% 硫酸葡聚糖, 50 mM 磷酸钠; pH 7)中加入标记的探针,每10ul杂交液含50ng探针2. 探针95 变性5分钟,置冰水中10分钟3. 10ul杂交液加到标本上,盖盖玻片并封片4. 湿盒中37杂交过夜,杂交,1. 2x SSC, 50%甲酰胺45 洗3x5min2. 2x SSC 37洗2x5min3. TNT buffer 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.05%
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