动物人工授精ppt课件.ppt

《动物人工授精ppt课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《动物人工授精ppt课件.ppt（112页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、人工授精,一、学习目标 1.掌握 （1）人工授精的概念、人工授精主要技术环节 （2）采精（采精场地、采精准备、采精频率） （3）稀释液的主要成分及作用，稀释液的配置与保存，精液稀释的程序与方法 （4）精液的常温保存、低温保存以及冷冻保存的原理、程序与方法；冷冻精液解冻的程序与方法，冷冻精液的贮存与运输方法 （5）输精：输精前准备，输精要求与方法,2.理解 （1）人工授精的意义 （2）精液品质评价指标与方法 （3）影响输精成功率的因素二、学习重点与难点 1.重点 采精与精液品质评价、精液稀释和保存、输精 2.难点 精液冷冻保存原理,第一节 人工授精概述 一、自然交配(natural mating

2、) 种公畜与发情母畜直接交配的配种方式称为自然交配。 1.自由交配：公母畜混群饲养，公畜任意和发情母畜交配。原始交配方式，容易引起近亲繁殖。,2.分群交配：在配种季节，把一头或数头经选择的公畜放入一定数量的母畜群中进行交配，11020（一夫多妻）。,3.围栏交配：与分群交配相同，配种时，在围栏内放入一头母畜与特定的公畜交配。公畜与母畜的比例为11。 4.人工辅助交配：公母畜平时隔离，交配时，选择特定的公畜，人为控制交配，交配完成后公母畜即隔离开来。,二、人工授精 人工授精（artificial insemination, AI）是指用特定的器械采集公畜的精液，通过检查、稀释、保存等适当处理后，

3、再用器械把精液输入到发情母畜的生殖道内，以代替公母畜自然交配而繁殖后代的一种繁殖技术。 1780年，意大利生理学家Spallanzani将公犬的精子注入母犬生殖道，获得了3只小犬，这是人类第一次进行的人工授精尝试。1899年，前苏联科学家开始研究家畜的人工授精技术，Ivanoff起初的研究对象是马，但首次成功进行了牛和绵羊的人工授精。,我国家畜的人工授精技术研究始于1935年的句容种马场，到1951年以后，随着我国畜牧业的迅速发展，人工授精技术得到推广，主要在东北推广马的人工授精。奶牛的人工受精始于20世纪50年代中期，到70年代已经普及冷冻精液进行人工授精。,目前，我国各省、市、自治区都建有

4、冷冻精液站，城郊和大型乳牛场采用冻精配种的奶牛几乎为100%。其它家畜冻精人工授精工作也在一定的范围内得到应用。,三、人工授精的意义 1.有效改变家畜的配种过程，提高优良种公畜的配种效能和种用价值，充分发挥公畜繁殖潜力。,2.加速家畜品种改良，促进育种工作进程。 人工授精大大提高了公畜的配种效能，就能选择最优秀的公畜用于配种，从而成为迅速增殖良种家畜的有效方法和改良畜种进行育种工作的有力手段。 3.减少了种公畜的饲养头数，降低饲养管理费用。,4.配种时公母畜互不接触，可防止某些生殖疾病的传播。 由于人工授精必须严格遵守操作规程，只有健康的公母畜才能用作人工授精，因此可减少和防止因本交引起的传染

5、性疾病，如布氏杆菌病、毛滴虫病、胎儿弧菌病、传染性流产、马媾疫等。,5.克服公母畜体格悬殊不易交配的困难，有利于提高母畜受胎率。 人工授精所用精液都必须经过检查，以保证质量；通过发情鉴定可以掌握适宜的配种时机并及时发现某些生殖疾病；可以克服因公、母畜体格相差太大或因生殖道异常造成交配困难引起的不孕，从而有利于提高母畜的受胎率。 6.克服时间和地域的限制，并可开展国际间的交流与贸易。 优良公畜的精液可以长期冷冻保存，而且便于运输，因此可以在任何时间(即使在公畜死后)、任何地点选用某头公畜的精液输精。对一些有特殊遗传特性或即将绝迹的品种或个体的精液可以冷冻保存，建立精液基因库，对家畜的遗传、育种及

6、动物多样性的保存均具有重大的科学价值。,四、人工授精技术的基本环节 人工授精技术的基本技术环节包括采精、精液品质检查、精液的稀释、精液的分装、精液的保存（液态保存、冷冻保存）、精液的运输、冷冻精液的解冻与检查、输精等。,7.有利于精液的长期保存与利用8.为开展生殖生物技术科学研究提供了有效手段,小知识,第二节 采 精 采精(semen collection)就是精液的采集。采精是人工授精的第一个环节，必须严格按照操作规程，以保证公畜正常、充分的性行为表现，采集到量多、质优、无污染的精液。,一、采精前的准备 （一）场地 采精应有专用场地，以便公畜建立稳固的条件反射；要求宽敞、平坦、安静、清洁，避

7、免阳光直射，并有采精架保定公畜；在配种站立最好建立采精室，并与精液处理室相连，以方便正常工作，同时也可以控制温度、湿度、光照等，便于消毒，保证精液质量。 室内采精场面积一般为1010m2。,（二）台畜 台畜(dummy)的选择必须满足种公畜的要求，可利用活台畜或者假台畜。采精时用发情良好的母畜做台畜效果最好，经过训练的公母畜皆可作为台畜。,对于活台畜，指使用与公畜同种的母畜、阉畜或另一头种公畜作台畜。活台畜应健康、体壮、大小适中、性情温顺、四肢有力。 采精前，将台畜保定在采精架内，台畜的尾根部、外阴部、肛门应清洗干净，采精时将尾巴缠在一侧。,活台畜,假台畜即采精台，模仿母畜体型大小，选用金属材

8、料或木料做成的具有一定支撑力的支架。假台畜要求大小适宜，坚实牢固，表面柔软干净，用畜皮、人造革等伪装。,牛采精架的构造,采精用假台畜,在假台畜的后躯涂抹发情母畜的阴道粘液或尿液。其目的是刺激公畜性欲并引诱其爬跨假台畜，经过几次采精后即可调教成功。 以发情母畜诱性，在公畜达到性高潮时诱导爬跨假台畜。在假台畜旁边牵一发情母畜，诱使其爬跨数次，但不使其交配，当公畜性欲达到高峰时迅速牵走母畜，令其爬跨假台畜。,公畜调教的基本方法,观看调教好的公畜爬跨假台畜。将需要调教的公畜拴系在假台畜附近，让其观看另一头已经调教好的公畜爬跨假台畜采精，然后再诱导其爬跨假台畜。,公畜调教的注意事项,1.调教过程中要反复

9、进行训练，耐心诱导，切勿强迫、恐吓、抽打等，以防止性抑制而造成调教困难。2.调教时应注意公畜外生殖器的清洁卫生。3.调教时间最好选择在早上，早上公畜精力充沛，性欲旺盛。4.调教时间、地点要固定，每次调教时间不宜过长。,（三）性准备 公畜在采精前，空爬跨几次台畜，可以提高精子数量及精子活率，这个空爬跨过程叫性准备。 常采用以下方法来做好性准备： 1.改换台畜 2.变换台畜位置 3.观摩其他家畜爬跨示范作用 4.自身空爬（注意：有的公畜有自淫现象，就不能性刺激）,（四）药液的准备 1.配制稀释液 后讲。 2.配制润滑剂（向凡士林加入1/3的液体石蜡，高压灭菌后凉冷，每周灭菌一次，并润滑内胎）。 3

10、.配制70%75%的酒精。 4.配制小苏打液。取小苏打粉2g加温开水100ml，消毒公畜包皮，母畜后躯及洗涤器械、桌面等。 5.煤酚皂液（来苏儿）。取2ml加温开水100ml，消毒母畜的外阴部。,（五）器械的消毒 1.将清洗好的集精杯、贮精瓶、纱布、毛巾、润滑剂等放入高压灭菌器内，以1201kg左右的压力持续1520分钟，也可用一般的钢筋锅蒸汽消毒30分钟。 2.温度计、玻璃棒、长柄钳子，用75%的酒精棉球消毒，晾干后，用灭菌稀释液冲洗2遍。 3.输精管等玻璃容器在清洗后，可放在鼓风干燥箱中加温（160180）之间，维持20分钟。,二、采精方法 一种理想的采精方法，应具备以下四个条件或者遵循以

11、下四个基本原则： 可全部收集公畜一次射出的精液 不影响精液品质 公畜生殖器官和性机能不会受到损伤或影响 器械用具简单，使用方便 目前在生产中常用的采精方法有：假阴道法、手握法、按摩法和电刺激法，其中以假阴道法最为理想。,(一)假阴道法 假阴道法是用模拟母畜阴道环境制成的人工阴道，诱导公畜在其中射精而获取精液的方法。 1.假阴道的结构和具备条件 假阴道(artificial vagina)是一筒状结构，主要由外壳、内胎、集精杯及其附件组成。外壳为筒状，可用硬质塑料或镀锌铁皮制成；内胎为弹性强、薄而柔软无毒的橡胶筒，装在外壳内，构成假阴道内壁；集精杯由暗色玻璃或胶质制成，装在假阴道的一端。固定内胎

12、的胶圈，保定集精杯(牛)有三角保定带，充气用的活塞和双连球，连接集精瓶(猪)或集精管(牛)的胶漏斗，以及为防止精液污染而敷设在假阴道入口处的泡沫塑料垫，用于固定龟头(猪)用的螺旋橡胶圈等，称为附件。,假阴道在使用时先安装内胎，然后消毒、冲洗、注水、涂滑润剂、调节温度和压力等步骤，使假阴道达到与母畜阴道环境相似的条件。 (1)适当温度 注入相当假阴道容积2/3的温水，采精时保持3840。集精杯应保持3435。 (2)适当压力 借助注入水和空气来调节假阴道的压力。以假阴道内胎入口处形成 Y 形为宜。,(3)适当润滑度 用消毒过的润滑剂对假阴道内表面润滑，涂抹部位是假阴道全长的1/21/3。 (4)

13、无菌 凡是接触精液的部分如内胎、集精杯及橡胶漏斗均须严格消毒。 (5)无破损漏洞 外壳、内胎、集精杯不得漏水或漏气。,采精前，将假阴道入口处用消毒过的纱布24层盖住，防止污染。一种最好方式是将装好的假阴道放在4042的恒温箱内，以免采精前温度下降。 在安装假阴道时，不同品种的动物对上述条件的要求不同。 牛：38，其次是压力和润滑度。 羊：38，其次是压力和润滑度。 猪：主要是压力，其次是润滑度。 马：主要是压力，其次是润滑度。标准压力，用指头粗的玻棒从假阴道中不掉下来。,2.采精操作 一种比较安全而简单的方法是将假阴道安放在能够调节假阴道角度的假台畜后躯内，任由公畜爬跨而在假阴道内射精。,A.

14、安装假阴道B.引导公畜至台畜后面，诱导公畜爬跨C.及时将阴茎导入假阴道D.向下倾斜假阴道的集精杯端，收集精液E.当阴茎慢慢回缩自动脱出时，将假阴道直立、放气、放水F.精液送化验室进行检查,公牛采精：采精员站在台畜的右后侧，右手握住假阴道，集精杯一端向上。当公畜爬跨时，使假阴道与公畜阴茎伸出方向成直线，迅速将阴茎导入假阴道内，公畜的后躯向前冲即射精，随后将假阴道集精杯一端向下倾斜，以便使精液完全流入集精杯内。,当公畜爬下时，采精人员应持假阴道随阴茎后移，打开开关，放出空气，待阴茎自行软缩脱出后，迅速取下假阴道，立即送往精液处理室检查，取下集精杯，盖上集精杯盖。,(二)手握法 手握法适宜于采集猪、

15、犬、狐狸等的精液，具有设备简单、操作方便、能采集富含精子部分的精液等优点，但其缺点是精液容易污染和受低温打击的影响。,手握法采精是模仿母猪子宫颈对公猪螺旋状阴茎龟头约束力而引起射精的生理刺激，以手握其阴茎龟头呈节奏性松紧给予压力进行刺激而采精。当公猪爬跨台畜阴茎伸出后，采精员握在空拳中，使其阴茎抽动片刻后，手指握紧螺旋状龟头，然后顺势牵出整个阴茎，就可采精。,采精员蹲在假台畜一侧，戴上灭菌手套，待公猪爬跨台畜后，用0.1%高锰酸钾溶液将公猪包皮附近洗净消毒，并用生理盐水冲洗，然后将手捏成空拳，于公猪阴茎伸出同时，导入空拳内，一松一紧有节奏性地施加压力，以不使阴茎滑脱为标准，待阴茎充分勃起时即可

16、引起公猪射精。,另一只手持保温的集精瓶(带有过滤纱布)收集浓精部分的精液。公猪射精停止，可按上述法再次施加压力，即可第2或第3次射精，待射精全部结束时再松开阴茎。,分段采精：弃掉含副性腺分泌物多、精子较少、精液清亮白色的第一段和精液较稀、清亮、精子少的第三段，只收集精液浓、精子多、呈乳白色的第二段。,(三)按摩法 按摩法适用于无爬跨能力的公牛和禽类。对于牛，先将直肠宿粪排除，再将手伸入直肠约25cm处，按摩精囊腺和输精管壶腹，使精液流出，同时由助手按摩阴茎S状弯曲部使阴茎伸出，便于收集精液。 鸡采精时由助手两手分握公鸡两腿，以自然宽度分开，尾部朝向术者，泄殖腔周围剪毛消毒后，采精员右手拇指与食

17、指在泄殖腔下部两侧抖动触摸腹部柔软处，然后迅速轻轻用力向上抵压泄殖腔，使交配器翻出；固定在泄殖腔两上侧的左手拇指和食指微微挤压，精液即可顺利排出。,三、采精频率 采精频率(frequency of semen collection)是指每周内对公畜的采精次数。 1g睾丸组织每周大约生产5000万精子。 牛：成年公牛一般每周采精2次，每次连续采精2遍。也可每周采精3次，隔日采精。牛每次射精约为100150亿。 羊：附睾贮存量大而射精量少，由于配种季节短，每天可采精多次而不影响精液品质。每次射精约为2030亿。 猪：射精量大，很快使附睾内贮存精子彻底排空，成年公猪采精最好隔日1次。每次射精约为30

18、0500亿。 马：射精量大，很快使附睾内贮存精子彻底排空，采精最好隔日1次。每次射精约为100150亿。,精液品质检查的目的在于确定精液品质的优劣，以此作为精液稀释、保存的依据。同时，也反映种公畜饲养管理水平和生殖器官的机能状态，以及精液在稀释、保存、冷冻和运输过程中的品质变化及处理效果。采得精液后，要迅速置于37条件下进行检查。 现行评定精液品质的方法主要有外观检查法、显微镜检查法、生物化学法等。无论哪一种检查法，都必须以受精力高低为依据。,第三节 精液品质检查,一、精液外观和精液量 1.云雾状 牛、羊、鹿、犬和狐的精液因精子密度大而混浊不透明。肉眼观察刚采得的新鲜精液时，可看到如翻腾滚滚的

19、雾状，这是精子密度大而运动又非常活跃的表现。精液混浊度越大，云雾状越显著，精子密度和活率也就越高。云雾状显著者可用“+”表示；比较显著用“+表示；不显著用“+”表示；如果没有云雾状则用“-”表示。马、猪的精子少，混浊度也较低，云雾状不显著。,2.气味 公畜的精液略带腥味。如有异常气味，可能是混有尿液、脓液、尘土、粪渣或其他异物的表现，应废弃。色泽与气味检查可以结合进行，使鉴定结果更为准确。,新鲜收集的羊、牛、马、猪（从左到右）的射出精液,3.色泽 正常精液的颜色为乳白色和灰白色，且精子密度越高，乳白程度越浓，其透明度也就越低。正常牛、羊、鹿、犬和狐的精液均呈乳白色或灰白色，但有时呈乳黄色（多见

20、于牛)；猪、马、兔均为淡乳白色或浅灰白色。,4.射精量(semen volume) 公畜一次采精射出精液的容量。射精量因动物种类、品种及个体的不同而不同。同一个体也会因年龄、营养、性准备、采精方法、采精频率而有所变化。,二、精子活率 精子活率（sperm motility）就是指精液中呈直线前进运动的精子数占总精子数的百分比。直线运动的精子是指精子近似直线地从一点移动或前进到另一点，也称为有效精子。 精子的运动方式有摆动、旋转、曲线前进和直线前进运动几种。其中只有直线前进运动的精子才具有正常的生存和受精能力，与精子的受精力密切相关。,精子活率的测定是评定精液品质优劣的一个重要指标。一般在采精后

21、、精液处理前后、输精前都应进行检查。,精子活率一般采用十级评分法来表示。即按精子直线运动占视野中精子的估计百分比来表示。若精子100%呈直线前进运动，则评为1.0，90%即为0.9，依此类推。 一般新鲜精液活率为0.70.9左右。其中奶牛的精液比水牛高，驴的比马的高，猪的浓精和牛相似。为了保证有较高的受胎率，用于输精的精子活率应达到一定等级，液态保存的精液应在0.50.6以上，冷冻保存的精液在0.3以上。,精子活率的检查通常是在200400倍显微镜下进行。由于精子受温度的影响较大，检查时应在37左右进行，最好用带有电热装置的显微镜。,牛精子活力检查的程序,载玻片预温,精液稀释,取样检查,镜检,

22、活力估测,活力记录,将恒温加热板放在载物台上，打开电源并调整控制温度至37，然后放在载玻片,将生理盐水与精液等温后，按1:10稀释,取10ul放在预温后载玻片中间，盖上盖玻片,用100倍和400倍观察,判断视野中前进运动精子占的百分率,按10级制评分和记录,三、精子密度 精子密度(sperm concentration)也称精子浓度，指精液的单位容积(通常是1ml)内所含有的精子数目。目前测定精子密度的主要方法有目测法、血细胞计数法和光电比色法等。 1.目测法 在显微镜下根据精子分布的稠密和稀疏程度，将精子大致分为“密”、“中”、“稀”三个等级。 密：表示在整个视野里精子密度很大，彼此之间空隙

23、很小，很难看到单个精子运动情况，每毫升精液中含有精子数为10亿以上。 中：表示精子间空隙明显，彼此间距离约一个精子的长度，每毫升精液含精子数大约210亿。,稀：表示精子分散在视野中，精子之间空隙超过一个精子的长度，每毫升含2亿个以下。,2.血细胞计数法 用血色素吸管吸取被测精液作100或200倍稀释，稀释液一般采用3% NaCl溶液。然后取一滴滴于计数板上的盖玻片边缘，使精液渗入到计数室内。在400600倍显微镜下统计出计数室的四角及中央共5个中方格内的80个小方格内的精子数（X），代入下列公式即为每毫升被测原精液所含的精子数 X510稀释倍数1000精子数/mL 简化计算方法：5个大方格的精

24、子数5万稀释倍数 为减少误差，必须进行两次精子计算，其误差小于10%。,3.光电比色计测定法 目前较准确用来测定精子密度的一种简便方法，适用于牛、羊的精液和除去精液胶样物各种动物精液。其原理是精液中精子越多、其透光性越低。使用光电比色计通过反射光和透射光检验，能准确测定精液中精子的密度。检测前需先绘制成查数表，其方法是：将原精液稀释成不同比例，并以血细胞计数器测定各种稀释比例的精子密度，制成标准管，再用光电比色计测定已知精子密度的各种标准透光度求出相差1%透光率的级差精子数，根据其不同透光度与其对应的精子数，制成精子查数表，也可绘成曲线图。测定精液样品时，只要将原精液按一定比例稀释，根据其透光

25、度查对精子查数表，即可得出精液样品的精子密度。,四、精子形态 精子形态是否正常与母畜的受胎率密切相关。精子形态检查有畸形率和顶体异常率检查两个方面。 1.精子畸形率(abnormal spermrate) 畸形精子是形态和结构不正常的精子的统称。精子畸形率是精液中畸形精子数占总精子数的百分率。根据精子的畸形部位，可分为4类。 第1类：头部畸形，如头部巨大、瘦小、细长、圆形、轮廓不清、皱缩、缺损、双头等； 第2类：颈部畸形，如颈部膨大、纤细、屈折、不全、带有原生质滴、不鲜明、双颈等； 第3类：中段畸形，如中段膨大、纤细、不全、带有原生质滴、双体等；,第4类：主段畸形，如主段弯曲、屈折、回旋、短小

26、、长大、缺陷、带有原生质滴、双尾等，以中段和主段畸形为多。 在正常精液中，一般以精子尾部畸形比较多见，头部和颈部畸形较少。动物精液中畸形精子率一般不会超过20%。牛不超过18%，水牛不超过15%，羊不超过14%，猪不超过18%，马不超过12%，狗和狐不超过20%。如果超过20%，则影响受精力，表示精子品质不良，不宜用作输精。,1.将1滴精液滴在玻璃片上2.用另一玻片拉向液滴，使玻璃片边缘附着精液3.将玻片推向另一端,精子生成过程受阻 副性腺及尿道分泌物的病理变化 精液处理不当，精子遭受外界不良影响的刺激。 畸形精子的检查，可在计数死活精子数的同时进行，也可将精液制成抹片直接在显微镜下观察，或用

27、普通染色液（美蓝）或红蓝墨水染色，水洗干燥后镜检。检查的精子数不得少于200个，计算畸形百分比，即畸形率。,畸形精子出现的主要原因,为什么？,2.精子顶体异常率(abnormal spermacrosome) 精子顶体异常率是指精液中顶体异常的精子数占精子总数的百分率。顶体中含有多种酶类，在受精过程中具有重要作用，因此只有呈直线前进运动并具有完整顶体的精子才具有正常的受精能力。 在正常情况下，牛精子顶体异常率为5.9%，猪为2.3%。如顶体异常率显著增加，例如牛超过14%以上，猪超过4.3%以上，就会直接影响受精力。 顶体异常主要有膨胀、缺损、部分脱落、全部脱落等数种。顶体异常出现的原因可能与

28、精子生成过程和副性腺分泌物异常有关，但更重要的可能是由于射出体外后精子受低温打击，特别是冷冻方法不当而造成。,顶体异常率的常规检查方法是：先同畸形精子检查一样制成抹片，待自然干燥后再在固定液中固定片刻，水洗后用姬姆萨缓冲液染色1.52.0h，再水洗干燥后，用树脂封装，置于1000倍以上显微镜或相差显微镜下观察200个以上的精子，计算异常率。凡是含有卵黄、甘油成分稀释液的精液抹片，必须先要在含有甲醛的柠檬酸盐液中固定，然后在37下干燥后，才能染色和镜检。,五、精子存活时间和存活指数精子存活时间是指精子在体外一定保存条件下的总生存时间。存活指数是指精子存活时间及精子活率变化的一项综合指标，反映精子

29、活率下降速度。检查时，将稀释后的精液置于一定的温度下(05或者37)，间隔一定时间检查活率，直至无活动精子或只有个别精子呈摆动活动为止。精子存活时间越长，指数越大，说明精子生活力越强，品质越好。 精子存活时间（h）：检查间隔时间的总和最末两次检查间隔时间的一般 精子存活指数每前后相邻两次检查精子活率的平均数与间隔时间乘积的总和。,六、精子代谢能力 精子能量代谢的强弱在一定程度上反应了精子的生理特征及其受精潜能。在正常情况下，精子代谢主要利用生活环境中的外源性物质，其中以糖类为主，精子可通过糖酵解或呼吸作用而获得能量。可见，精子代谢能力越强，消耗的糖和氧气越多，表现活动力越强。 1.精子耗氧量测

30、定 指以1亿个精子在37 的条件下每小时内所消耗的氧气的微升数。将已知精子密度的一定数量的精液置于37 的温箱中孵育1h，用瓦氏呼吸器测定其耗氧量，则可计算出精子耗氧率。 2.精液果糖分解测定 精液中果糖分解能力与精子活率有密切的关系。果糖测定是以1亿精子在37和嫌氧条件下每小时消耗果糖的毫克数。,3.美蓝褪色试验 美蓝是一种氧化还原剂，氧化后呈蓝色，而还原后呈无色。精子在美蓝溶液中，呼吸时氧化脱氢，美蓝获得氢离子后便由蓝色还原为无色。因此，根据美蓝溶液褪色时间的快慢，便可估测精子的活率和密度的高低。,七、精液的细菌学检查 精液中病原微生物及菌落数量已列入评定精液品质检查的重要指标，并作为海关

31、进出口精液的重要检验项目。精液中如果含有大量细菌微生物的存在，不仅会影响精子寿命和降低受精能力，而且还将导致有关疾病的传播。 精液中如果含有病原微生物，每毫升精液中的细菌菌落数超过1000个，则视为不合格。,计算机辅助精子分析（computer assistant semen assay, CASA),一、精液稀释的目的 精液稀释(semen dilution)是在精液中加入一定量按特定配方配制的、适宜于精子存活并保持受精能力的稀释液。 1.延长精子的存活时间。通过降低精液能量消耗，补充适量营养和保护物质，抑制精液中有害微生物活动，可延长精子的寿命。 2.扩大精液容量，提高配种率。即提高一次射

32、精量可配母畜头数。 3.便于精液长期保存和运输。,第四节 精液的稀释,二、稀释液的主要成份及作用 稀释液：为了扩大精液容量，延长精子的存活时间及受精能力，而加入精液中的等渗溶液。精液稀释就是在精液中加入适宜于精子存活并保持受精能力的稀释液。 （一）主要成份 1.奶类：牛奶、羊奶、奶粉，最好是各种鲜奶，其目的是为精子提供能量。鲜奶用前在9295的条件下，经10min的热处理，除去其中的乳烃素，然后过滤，除去泡沫。 2.卵黄：含有卵磷酯，用1周以内的新鲜鸡蛋，凉开水洗净外壳，用75%的酒精消毒一次，晾干，打开后用注射器吸取卵黄。,3.甘油（丙三醇）：三个“OH”亲水性强，具有抗冻作用。 4.Tri

33、s（三羟基甲基氨基甲烷，三基）：非电解胺化物。作用：调节pH值；保护精子具有受精能力和不被冻伤等。5.糖类（果糖、葡萄糖等）：抗冻；提供能量；降低电解质浓度。,6.其它：丙二醇、生理盐水、酶类、非电解质、激素、维生素等。,（二）稀释液中各成份的作用 1.稀释剂：扩大精液容量，要求必须是等渗溶液，例如奶类、糖类、生理盐水等。 2.营养剂：为精子提供营养和能量等，补充精子在代谢过程中的能量消耗。精子代谢只是单纯的分解作用，不能通过同化作用将外界物质转变为自身成分。糖类（葡萄糖、果糖、乳糖等）、奶类、卵黄等。 3.保护剂：保护精子的作用，以免受到各种不良外界环境的危害。,降低精液中（精清）的电解质浓

34、度（糖类、磷酸盐、酒石酸盐等） 精清中电解质浓度很高，生理上具有激发精子活动，有利于精子和卵子结合受精。但同时也能促进精子早衰，破坏精子脂蛋白膜，使精子失去电荷聚集能力，不利于精液保存。 一般常用的非电解质、弱电解质有各种糖类、氨基乙酸、甘氨酸等。,缓冲物质的作用：缓冲剂（柠檬酸钠、酒石酸钾钠等） 缓冲物质是用以保持精液适当的pH值。常用的缓冲剂有柠檬酸钠、酒石酸钾钠、磷酸二氢钾以及三羟甲基氨基甲烷(Tris)等。,防止冷休克（低温打击）的作用 当精子从体温降到20时对其活力影响不大，当精液从2010，则有较大影响，会使精子遭受冷打击而丧失活率。卵黄和奶类等含有卵磷脂，防止冷休克的发生。,当从

35、10降到0（急剧降温1020分钟），就会造成精子的不可逆性死亡，即冷休克。这是因为精子含有的缩醛磷脂融点高，在低温下容易凝结，而不能被精子利用，造成精子不可逆的冷休克。,抗冻作用：具有抗冷冻危害的作用。 精液在冷冻过程中，精子内外环境的水分，必须经历液态和固态的过程，这种物态的转化对精子具有极大的危害。而抗冻物质有助于减轻或消除这种危害。一般常用于抗冻的保护物多采用甘油、糖类、二甲基亚砜（DMSO），TRIS等。,抗菌作用。在采精过程中即便在严格的操作下，也难免要受到某些细菌等有害微生物的污染，而精液和稀释液又都是病原微物良好的培养基。常用的抗生素有青霉素、链霉素、氨苯磺胺素、林肯霉素、多粘菌

36、素等。,4.其它类物质 酶类：乳酸脱氢酶，细胞色素氧化酶，琥珀酸脱氢酶，-葡萄糖苷酸酶，谷草转氨酶，过氧化氢酶，粘蛋白酶等。 激素：催产素，PGE2，PGF2,T等。 维生素：VC,VB2,B12,VE等。 酶类、激素类、维生素类等，有助于调节和改善精子外在环境的理化特性，以及母畜生殖道的生理机能，以利于提高受精机会，促进合子发育。 常温保存时通入CO2可延长保存时间。 在颗粒精液中加入染料用作标志等。,三、稀释液配制的注意事项 1.消毒：配制好的稀释液，瓶口用硫酸纸包好，外用布盖上，扎紧，置高压锅中，0.8kg、105的压力维持30min；糖类稀释液只能用0.5kg的压力，或用水煮沸30mi

37、n即可。 2.用于配制稀释液以及封装保存精液的一切用品，都必须消毒，使用前再用稀释液冲洗23次。 3.稀释液应新鲜、无菌，现用现配。 4.在稀释液中加入卵黄、奶类及抗菌素等药物应在稀释液降温到35以下时再加入。 5.稀释液加入卵黄和抗菌素前应过滤。0.020.2 m滤膜。 6.成本低，配制方便，精子存活率高，受胎率高。,四、精液的稀释 （一）稀释液的种类 根据性质和用途可分为4类。 1.现用稀释液：适用于采精后立即授精，以单纯扩大精液容量，增加输精母畜头数为目的。此类型稀释液以简单的等渗的糖类和奶类为主体。 2.常温保存稀释液：适用于精液在常温下作短期保存，具有以糖类和弱酸盐为主体的pH偏低的

38、特点。 3.低温保存稀释液：适用于精液低温保存，具有含卵黄或奶液为主体的抗冷休克特点。,4.冷冻保存稀释液：适用于精液超低温冷冻保存，具有甘油、二甲亚砜等抗冻物质为主体特点，此类稀释液比较复杂，有仅一种稀释液组成，也有由多种稀释液组成。,（二）精液稀释的方法 1.先将稀释精液所用的器具加温到3035，并用等温稀释液冲洗23次（防止温度和渗透压的损害）。 2.新采集的精液及时稀释，室温低于20时，要用精液无菌保温箱。精液放置时间过长则会降低精子活率，一般在0.5h内进行稀释。 3.稀释液与精液的温度必须一致，可用消毒温度计测量。采精时集精杯加保温措施，稀释液预先加温到30左右，置于精液保温箱中。

39、 4.在稀释精液时，将稀释液沿杯壁缓缓加入精液中，一般将稀释液与精液置于预定温度的保温瓶中作等倍稀释处理。然后轻轻转动精液瓶或用灭菌棒搅动，使之混匀。,5.如果进行低倍稀释（35倍）可一次完成，若高倍稀释时则须分两步进行，即先低倍稀释，防止精子所处的环境突然改变，对精子造成打击。间隔1.52h后，精液降至保存（平衡）温度时，进行二次稀释。 6.精液稀释后，先静置片刻，再做活率检查，如果活率没有变化，则分装保存。如果活率下降，则说明稀释或操作不当，不宜使用，并检查原因。,（二）稀释倍数 精液的稀释应保证每输精剂量所含直线前进运动的精子数不低于输精标准要求。精液适宜的稀释液应根据以下依据决定： 1

40、.稀释液种类：糖类稀释液低倍稀释，奶类稀释液高倍稀释。 2.保存时间：时间长高倍稀释，时间短低倍稀释。 3.精液保存方法：冷冻保存稀释倍数应低一些，而液态保存稀释倍数可高些。 4.畜种：羊、牛、鹿精子密度大，稀释的倍数应大一点，而猪、马密度小，则不宜作高倍稀释。,（三）每次输精保持受精力所需的最低有效精子数,牛：射精量8ml，活率0.7，密度12亿个/ml，每毫升精液中有效精子数120.7=8.4亿个，若每毫升稀释后的精液中含有3000万个有效精子，则每毫升可稀释倍数8.4亿0.3亿=28倍。可稀释：8ml28=224ml，可供224头母牛输精。,一、保存目的 1.延长精子存活时间，保持其受精

41、能力；2.扩大种公畜（优良）精液利用率；3.方便运输，扩大精液的利用范围。二、保存方法 （一）常温保存法 常温保存是指在1525之间的温度范围内保存精液的方法。 1.原理：利用稀释液的弱酸性（pH 6.26.4）环境抑制精子活动，以减少其能量消耗，使精子保持在可逆性的静止状态而不失去受精能力。即当精液pH值降低到一定的酸度时，精子运动及代谢受到可逆性抑制，但当pH值恢复到精液正常的pH值时，精子可以复苏，从而对精液进行保存的方法。,第五节 精液的保存,2.调整pH的方法：为了使稀释液的pH达到所需范围，可以选用下面三种方法中的一种：（1）向稀释液中输入CO2，如伊里尼变温稀释液(IVT)。（2

42、）利用精子在保存过程中自己产生的CO2，自行调节pH，如康奈大尔学稀释液(CUE)。（3）在稀释液中配有酸类物质和充以氮气，如已酸稀释液及一些植物汁液（椰汁稀释液，CME）。,牛冷冻精液稀释液配方 海带多糖0.025 0.2、葡萄糖 2 2.5、柠檬酸钠0.9 1.5、蒸馏水65 75、白蛋白17 18、甘油7 10、青霉素8.5 10万IU 果糖0.51.5、柠檬酸钠12、TRIS 1.53、青霉素G钠515万IU、甘油58、低密度脂蛋白510%、去离子水9295,3.稀释液配制：牛的柠檬酸钾钠稀释液（100ml）。配方： 柠檬酸钾 0.11g 磺胺粉 0.3g 柠檬酸钠 0.6g 卵黄 1

43、0ml 磷酸氢二钠 0.15g 青链霉素各 10万单位 葡萄糖 0.97g 蒸馏水加到 100ml 配制方法：将柠檬酸钾、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、葡萄糖和磺胺粉溶于蒸馏水，加热煮开，并冷却后加入卵黄和抗菌素，通入CO2 2030min，控制pH在6.26.4。,稀释液配方：葡萄糖25、柠檬酸钠0.53.5、卵黄1050、青霉素G钠515万IU、双氢链霉素210、甘油15、红景天多糖11.5、去离子水5090,（二）低温保存法 低温保存就是将稀释过的精液置于05的低温条件下保存。通常放在冰箱内或装有冰块的广口保温瓶中冷藏。 1.原理：在低温（05）保存过程中，精子处于休眠状态，代谢降到最低水平，并

44、且在采精以及精液稀释等操作过程中混入的细菌微生物的繁殖与危害也受到抑制，故精子能够保存的时间相对较长。在输精的时候，将温度回升至37左右，精子又能逐渐恢复正常的代谢，并保持其正常的受精能力。然而，精子对冷刺激，特别是温度急剧下降至10以下时，会使精子发生不可逆的冷休克现象。因此，在稀释液中须添加卵黄、奶类等抗休克物质，以提高精子的抗冷能力。,2.稀释液 （1）牛精液低温保存稀释液 在05条件下，有效保存期可达7d之久。 牛的柠檬酸钠卵黄稀释液。 基础液：取二水柠檬酸钠2.9g，加水定溶于100ml。 稀释液：基础液75ml，卵黄25ml，青链霉素各1000IU/ml。 （2）猪精液低温保存稀释

45、液 猪的浓份精液或离心后的精液，可在510条件下保存3d，且具有受精能力。在05下也可保存。 猪：取新鲜牛、羊奶100ml，煮沸10min，去掉浮沫，冷却过滤加入青链霉素1000单位/ml。,（3）马和绵羊精液低温保存稀释液 由于精液本身的特性以及季节配种的影响，马和绵羊精液的低温保存效果不如其它家畜的效果好。因此，在生产中的应用并不普遍。,3.方法 （1）冰箱保存法：冷源是冰箱。 将稀释好的精液装入贮精瓶封装后，用12层纱布或34层毛巾包裹，外用塑料薄膜用皮筋扎紧，先在室温下降温1h，再用815凉水冷却1h，然后放入25的冰箱中逐渐冷却（2h以上），严格控制温度，并保持恒定。 （2）冰块保存

46、法。 （3）农村可用水井或窖进行保存。,4.注意事项 (1)稀释液必须含有卵黄或奶类；卵黄用量一般在1030%，牛奶适量。 (2)缓慢降温 牛、羊、驴：2005，约12h，0.2/min 猪：301512h；15106h；100 23d 猪精液不宜冷冻保存或低温保存。,（三）超低温（冷冻）保存 精液冷冻(semen freezing)保存，是利用干冰(79)、液氮(196 )或其它制冷设备作为冷源，将精液经过特殊处理后，保存在低温下，以达到长期保存精液的目的。 1.原理 精子具有受温度变化直接影响其本身活动力和代谢能力的生物学特性。精子保存在超低温状态下，其代谢活动完全受到抑制，生命以相对静止

47、状态保持下来，一旦升温又能复苏而不失去受精能力。精子之所以能够复苏的关键在于精液在冷冻过程中，在冷冻剂的保护下，防止了精子水分冰晶化对精子的破坏，而尽可能形成玻璃化。,冰晶化是水在降温过程中的一定温度条件下，水分子重新按照几何图形排列形成冰晶的过程。冰晶改变了精子膜的溶质浓度和渗透压，造成精子脱水，发生不可逆的化学毒害而死亡。冰晶化只有当温度在060温度范围内缓慢降温时形成，降温越慢冰晶越大，1525形成冰晶最多。在冷冻精液过程中，只有避开060有害温区，才有利于精子长期保存。 玻璃化的冰冻状态是水在超低温下，水分子仍然保持原来自然的一种无次序的排列状态，形成玻璃样的坚硬而均匀的冰结。在此状态

48、下，精子不会发生细胞脱水，结构维持正常，解冻后可以复苏。,2.冷源 干冰：（-79），液N：（-196），液O：（-183），液H：（-253），液He：（-269）。 3.剂型 目前广泛应用的剂型为细管型，在冷冻精液早期也曾使用过颗粒型和安瓿型。 （1）细管型 以长125133mm、容量为0.25或0.5ml的各种颜色的聚氯乙烯复合塑料细管，通过吸引装置将平衡后的精液进行分装、封口，置液氮蒸气上冷却，再浸入到液氮中保存。 细管型精液具有许多优点，适于快速冷冻，精液细管内径小，每次冻制细管多，精液受温均匀，冷冻效果好，精液不必暴露就可直接输入母畜子宫内因而不受污染，剂量标准化，标记明显，精液不

49、易混淆，容积小，便于大量保存，精液消耗少，输精母畜受胎率高。适用于机械化生产。,（2）颗粒型 将0.1ml精液滴冻在经液氮冷却的聚乙烯氟板或金属板上，制成颗粒。其优点是方法简便、易于制作，成本低，体积小，便于大量贮存。但缺点也较多，如剂量不标准，精液暴露在外容易受到污染，不易标记，易混淆，大多需解冻液解冻等，故许多国家已不用这种方法。 （3）安瓿b型 采用硅酸盐硬质玻璃制成的安瓿，盛装精液剂量多为0.51ml。优点是剂量标准，不受污染，标记明显。缺点是生产工艺复杂，成本比较高；易破碎，体积和占用的空间比较大；解冻后需要转移到输精器内方可使用。,4.精液冷冻保存的稀释液 根据配制要求和稀释的需要

50、，可将冷冻保存稀释液分别制成三种溶液。 A 基础液：将糖类、盐类，成批量的制成溶液，并密封保存。奶类经热处理。 B I液：根据每次采精所需的冷冻稀释液的量，在基础液中加入一定量的卵黄和抗生素等配制成，用作第一次稀释。基础液+卵黄+抗生素。 C II液：取需要量的I液，按照比例加入经灭菌的甘油，配制成含有甘油的II液，用作精液的第二次稀释。液+甘油。 牛精液冷冻保存稀释液，主要有卵黄柠檬酸钠甘油液、卵黄糖类甘油、奶类甘油液3种稀释液。,例：牛细管用冷冻稀释液基础液：2.9%的柠檬酸钠液。液：取基础液80mL，卵黄20mL，青霉素10万单位。液：含7%甘油的液。牛颗粒用冷冻稀释液基础液：蔗糖（乳）