细胞融合单克隆抗体ppt课件.ppt

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1、动物组织块,细胞悬液,原代培养（细胞贴壁；接触抑制）,传代培养,胰蛋白酶处理分散成单个细胞,幼龄动物的器官组织；动物胚胎,加入培养液,用胰蛋白酶等处理贴壁细胞；分瓶继续培养。,适宜条件,10代细胞,传代培养,无限传代,遗传物质未改变,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,配置细胞悬液,胰蛋白酶处理,转入培养瓶,单个细胞,加培养液稀释,分 瓶,原代培养,原代培养特点：细胞贴壁、接触抑制,动物细胞培养的原理：细胞增殖,体细胞核移植的过程,供体细胞（供核）,细胞培养,体细胞,卵巢卵母细胞（M中期：供质）,去核,去核卵母细胞,注入,细胞融合,重组细胞,构建重组胚胎,胚胎移植,代孕母体,生出与供体奶牛遗传物质

2、基本相同的犊牛,体细胞核移植的过程,共分成两大阶段：核移植和胚胎移植,体细胞核移植的原理：动物细胞核具有全能性,学 习 目 标,动物细胞融合,单克隆抗体制备和应用,动物细胞融合与单克隆抗体,白菜,紫甘蓝,白菜-甘蓝,植物体细胞杂交过程示意图,动物细胞可以融合吗？,A细胞,B细胞,人工诱导,1.概念：,杂交细胞,动物细胞融合（也称细胞杂交）：是指两个或多个动物细胞结合形成一个单核细胞的过程。,一、动物细胞融合,融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞称为杂交细胞。,正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞,正在融合鸡血细胞,2.动物细胞融合过程,灭活病毒（常用仙台病毒）、（聚乙二醇）PEG、电

3、激等,诱导的手段？,思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的病毒需要灭活？不灭活行吗？,因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。 不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。,细胞膜的流动性,灭活病毒、PEG、电激等,融合后的细胞进行有丝分裂，形成两个完整的杂交细胞,诱导的手段？,融合后细胞的类型？,AB杂交细胞遗传物质有什么特点？,三种 AA、AB、BB,含两种生物的遗传物质,原理？,3.动物细胞融合技术的意义和应用,细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。,最主要用途：利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。,主要用于制备单克隆抗体,获得杂种植株

4、,用途,物理、化学方法（同左）,灭活的病毒,物理（离心、振动、电激）化学（聚乙二醇）,诱导方法,使细胞分散后诱导细胞融合,去除细胞壁后诱导原生质体融合,细胞融合的方法,细胞膜的流动性,细胞膜的流动性、细胞全能性,原理,动物细胞融合,植物体细胞杂交,比较项目,植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较,抗体：能够与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。,温故知新,二、单克隆抗体,B淋巴细胞,效应B淋巴细胞（浆细胞）,记忆B淋巴细胞,分化,能产生抗体的细胞是浆细胞（即效应B细胞）。,强调：效应B淋巴细胞是能够产生抗体的B淋巴细胞，下文将其简称为B淋巴细胞,抗体的传统生产方法,抗原,反复注射动物,从动物的血清中分

5、离抗体,该法制备抗体的缺点：,如何解决这个问题呢？,单克隆抗体！,产量低、纯度低、特异性差、灵敏度低。,单克隆抗体的概念,单克隆抗体：单个B淋巴细胞增殖形成的细胞群所产生的化学性质单一、特异性强、灵敏度高的抗体。,2.哪种细胞是可以无限增殖的？,3.有什么方法能使B淋巴细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？,1.B淋巴细胞在体外培养液中能否生长增殖？,（一）单克隆抗体的制备,B淋巴细胞在体外不能无限增殖。,肿瘤细胞,B淋巴细胞与肿瘤细胞融合,科勒,米尔斯坦,荣获1984年诺贝尔生理学或医学奖,如果把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞既能大量增殖

6、，又能产生足够数量的特定抗体。,单克隆抗体的制备过程,骨髓瘤细胞,小鼠,（选择性培养基）,杂交瘤细胞,注射抗原,聚乙二醇、灭活的病毒、电激等,BB、B瘤、瘤瘤 （B、瘤）,既能产生抗体又能大量增殖,二筛选：能产特异性抗体的杂交瘤细胞,（克隆化培养、抗体检测）,阳性孔,方法抗原-抗体杂交法,在单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。,骨髓瘤细胞,免疫小鼠,（选择培养基）,（克隆化培养、抗体检测）,杂交瘤细胞,注射抗原,能产特异性抗体的杂交瘤细胞,单克隆抗体的特点：特异性强、灵敏度高、产量大、纯度高,腹水,培养液,体内优点：不需特定的培养基；不需严格外界环境条件,骨髓瘤细胞,免疫小鼠

7、,（选择培养基）,（克隆化培养、抗体检测）,杂交瘤细胞,注射抗原,能产特异性抗体的杂交瘤细胞,动物细胞融合技术,动物细胞培养技术,制备单克隆抗体, 利用 产生特异性抗体的功能。 利用 无限增殖的特性。 利用 技术将两种细胞融合获得杂交瘤细胞。 利用 技术大量培养杂交瘤细胞。,效应B细胞,骨髓瘤细胞,动物细胞融合,动物细胞培养,3.为何要进行两次筛选？,4.如何进行第2次筛选？,培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。专一抗体检验呈阳性。,第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选得到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。,1.本过程利用了哪些原理？,免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理,2

8、.为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？,杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体,（1）作为诊断试剂最广泛用途 准确、高效、简易、快速,（如同位素标记单克隆抗体，可诊断肿瘤、心血管畸形等疾病）,（二）单克隆抗体的应用,用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体技术做成的“早早孕诊断试剂盒”，灵敏度高，在妊娠第8天就可以做出诊断，比原来的诊断方法提前了10天左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%以上。,（2）用于治疗疾病和运载药物,主要用于治疗癌症治疗，单克隆抗体作为载

9、体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”，准确杀伤癌变细胞。这样既不损伤正常细胞，又减少了用药剂量。,“生物导弹”抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学药物或细胞毒素,单克隆抗体导向，药物为弹头,利用单克隆抗体的特异性,两个过程,动物细胞融合过程,单克隆抗体制备过程,三个“一”,一个诱导细胞融合的新方法 灭活病毒,一个新细胞杂交瘤细胞,一个优势单克隆抗体特异性强、灵敏度高，并可大量制备的优势,本节小结,重点,比较动、植物细胞杂交技术,基因型为Aa与基因型为Bb的动物体细胞混合，用灭活的仙台病毒处理后，不可能获得下列哪种基因型的细胞 ( )AAAaa BAaBb CAabb DBBbb,C,趁热打铁

10、,【例1】能使动物细胞融合的特有的诱导因子是 （ ）A.离心 B.灭活的病毒 C.电刺激 D.振动【例2】融合后的杂交细胞的遗传物质有何特点（ ）具有原来两个或多个细胞的遗传信息 B.能无限增殖 C.可形成新个体 D.培养过程会贴壁【例3】动物细胞融合的作用中最重要的是（ ）A.克服远源杂交不亲和 B.制备单克隆抗体 C.培育新物种 D.生产杂种细胞,B,B,初试牛刀,A,【例4】科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（ ）A.经过免疫的B淋巴细胞 C.经过免疫的T淋巴细胞B.不经过免疫的T淋巴细胞 D.不经过免疫的B淋巴细胞【例

11、5】单克隆抗体是由下列哪种细胞产生的 （ ）B淋巴细胞 BT淋巴细胞 C骨髓瘤细胞 D杂交瘤细胞,A,初试牛刀,D,【例6】用动物细胞工程技术获取单克隆抗体，下列实验步骤中错误的是（ ）A将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的B淋巴细胞B用纤维素酶处理B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞C用聚乙二醇作诱导剂，促使能产生抗体的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合D筛选杂交细胞，并从中选出能产生所需抗体的细胞群，培养后提取单克隆抗体,B,初试牛刀,谢谢,(1)若A细胞是小鼠骨髓瘤细胞，则B细胞是取自小鼠体内的 细胞，从小鼠体内提取分离该细胞之前，应给小鼠注射_类物质。（2）d过程是一个_过程，该过程的进行常用_或_

12、的诱导。(3)假设仅考虑某两个细胞的融合，则可形成 种类型的C细胞，因此需用_培养基筛选出D细胞用于培养，D细胞的名称是 ，其特点是_。,效应B,抗原,细胞融合,聚乙二醇 灭活的病毒,选择性,3,既能无限增殖又能产生特异性抗体,杂交瘤细胞,(4)在培养时通过_分裂方式大量繁殖。D细胞体外培养需要注意的条件是（要求答5项）_。（5）单克隆抗体在疾病的诊断、治疗和预防方面，与常规抗体相比，其特点是_。,特异性强、灵敏度高,有丝,无菌、无毒的环境；充足的营养；适宜的温度和pH；适宜的气体环境,15、（1）单克隆抗体是指 。,（2）制备单克隆抗体的步骤：将_注入小鼠体内，从小鼠脾脏中获得淋巴细胞，其中

13、至少1个淋巴细胞带有抗该抗原的抗体。将步骤获得的B淋巴细胞与步骤培养的骨髓瘤细胞在_的诱导下融合。将诱导后产生的多种细胞，放在_培养基的多孔培养板上培养，筛选。这样获得的杂交瘤细胞既具有B淋巴细胞_的能力，又具有_的本领。检测和分离带有抗X抗体的阳性细胞，培养板中每孔放一个细胞进行培养。将阳性细胞进行增殖，从而制备出大量抗该抗原的单克隆抗体。,化学性质单一，特异性强的抗体,抗原,聚乙二醇,选择性,无限增殖,产生专一抗体,（3）大量制备单克隆抗体的方法主要有两种：体外培养法，可获得10g/mL的抗体；动物体内诱生法可获得520mg/mL的抗体。你选择的方法及原因是 。,（4）用本法制备出的单克隆

14、抗体仍具有局限性，因为它是用小鼠的_细胞制备的，其化学本质是_，应用于人体，会作为 产生 ，解决这个问题的方法是_。,大量生产选，小规模生产选,效应B,蛋白质,异物,免疫反应,采用人的效应B细胞制备,15、右图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌抗体的实验方案。据图回答：（1）该方案能达到预期效果吗？。原因是_。（2）图中为 过程，常用 作为诱导剂。该细胞继承了_ ，因此不仅能分泌_，还有 本领。,不能,没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生专一抗体的B淋巴细胞,细胞融合,灭活病毒,双亲细胞的遗传物质,特异性抗体,大量增殖,制备单克隆抗体,（3）该方案的目的是_。,具有一定的流动性

15、,C,有丝,不变,抗体能与抗原发生特异性结合的特点,例题2（1）在用动物细胞融合技术制备单克隆抗体时， 将抗原注射到小鼠体内，可获得(多选) （ ） AT淋巴细胞 B效应B淋巴细胞 C抗体 D记忆细胞（2）下列关于单克隆抗体的制备和应用的叙述中， 正确的是 (多选) （ ） AB淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合，一般需要灭活的仙台 病毒或聚乙二醇诱导 B融合后形成的杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生单克 隆抗体 C体外培养时，一个B淋巴细胞可以产生一种抗体，但不 能无限增殖 D单克隆抗体与常规抗体相比，特异性强，灵敏度高， 优越性明显,BCD,ACD,已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被

16、氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请回答： （1）试管中除融合的杂种细胞外，还有 种融合细胞。（2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出 杂种细胞，并说原理。 方法： 。 原理：,培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞,加入氨基嘌呤后,使D合成的途径阻断,所以仅D合成途径的骨髓瘤细胞或彼此融合的细胞就不能增殖,但杂种细胞则可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖,下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌单克隆抗体的实验方案,制备单克

17、隆抗体,B细胞,抗体,细胞融合,灭活病毒,双亲细胞,分泌抗体,无限增殖,原代,传代,50,例3：,下列过程与细胞培养无关的是 （ ） A.检测有毒物质 B.生产单克隆抗体 C.筛选抗癌药物 D.杂交育种,D,2002年12月30日， 两场筹备了10年的“太空婚礼”首次在神舟四号飞船上举行，植物细胞“新人”黄花烟草和革新一号烟草叶肉细胞原生质体，动物细胞“新人”是小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞，两批新人同时在 “产房”电融合仪内孕育新生命。,“太空婚礼”,这两场“太空婚礼”实质是哪两项细胞工程技术,？,植物体细胞杂交技术,动物细胞融合技术,细胞融合是正常的生命活动,两个细胞正在融合,受精作用,2、诱

18、导融合的因素生物法：灭活的病毒诱导融合.(利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。 这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。) 化学法：聚乙二醇PEG诱导融合. 物理法：电激融合,病毒颗粒黏 附细胞表面,细胞膜连接,细胞膜被 病毒颗粒穿通,细胞融合、形成杂种细胞,BB 、B瘤 、瘤瘤 （B、瘤）,（一选）：杂交瘤细胞,获得已免疫的B淋巴细胞,（二选）：选能产生所需特异性抗体的杂交瘤细胞,体外培养,小鼠腹腔内培养,杂交瘤细胞特点：既能产生特异性抗体，又能大量增殖。,单克隆抗体特点：特异性强、灵敏度高，可大量制备。,骨髓瘤细胞,免疫小鼠

19、,（选择培养基）,（克隆化培养、抗体检测）,特点：特异性、强灵敏度高，可大量制备,杂交瘤细胞,动物细胞融合技术,动物细胞培养技术,特点：既能产生抗体又能大量增殖,注射抗原,能产特异性抗体的杂交瘤细胞,单克隆抗体,杂交细胞,杂交瘤细胞,骨髓瘤细胞,特异性杂交瘤细胞,杂交瘤细胞系,提取,经过免疫的B淋巴细胞,动物细胞融合技术,动物细胞培养技术,单克隆抗体的制备过程：,特点：既能产生特异性抗体又能大量繁殖,特点：特异性、强灵敏度高，可大量制备,动物特异性免疫分离B淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意B淋巴细胞是一个系列。（B1,B2,B3,-Bn）细胞融合三种融合方式:（BB;BG;GG）第一次筛选：在“选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞（只有BG杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列：如B1G,B2G-BnG。而BB,GG在此培养基上不能存活。）第二次筛选：在“多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列 ，每孔只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并进行“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂交瘤细胞。选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖。提取单克隆抗体。,单抗的制备过程要点：,