生物化学技术原理与应用全套ppt课件443p.ppt

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1、1,生物化学技术原理及应用,2,第一章 生命大分子物质的制备,第一节 材料的选择与处理第二节 确定测定方法第三节 细胞的破碎第四节 抽提第五节 浓缩第六节 纯化方案的设计与评价第七节 有效成分纯度和性质的分析第八节 应用实例,3,一、材料的选择,有效成分：指欲纯化的某种单一的生命 大分子物质。有效成分具有含量少和稳定性差的特性。材料选择原则(1)含量多、稳定性好； (2)来源丰富、保持新鲜； (3)工艺简单、有利用价值。,4,二、材料的处理,1、动物脏器： (1)冰冻：短时间零下10冰库或零下70 低温冰箱（数月）贮存； (2)脱脂：人工剥离；有机溶剂；快冷快热；脂肪分离器； (3)干燥：丙酮

2、中脱水；沸水中蒸煮烘干。,5,2、植物组织：(1)叶片：水洗净或在10小时内置零下4 到零下30 冰箱贮藏备用;(2)种子：泡胀或粉碎。,6,3、微生物： (1)胞内活性分子：离心法收集上清液，低温下短时间贮存;(2)胞外活性分子：经破细胞膜处理后提取，制成冻干粉。,7,第二节 确定测定方法,一、目的和要求二、常用的测定方法,8,一、目的和要求,确定的方法简单、灵敏、需时少、专一性,9,二、常用的测定方法,1.光谱法(1)吸收光谱法（absorption spectrophotometry) 直接测定法：将待测物配制成一定浓度的溶液 移至分光光度计，读取吸光度。吸光度与待测物 浓度成正比。例如

3、：总蛋白含量的测定。 比色法（间接法）：将待测物与相关试剂或酶的 底物作用后，移至分光光度计，读取吸光度。例如： 酶活性的测定。,10,(2)荧光光谱法(fluo-spectrophotometry) 激发光激发待测物质发射发射光，读取 荧光强度。荧光强度与待测物质浓度成正 比。荧光光谱法的精确性、重复性和灵敏 度比吸收光谱法好。例如：乙醇中蒽的测定。,11,(3)浊度法 极稀的悬浮液采用此法，测定悬浮液在不被吸收的波长下表现的消光值。,12,2.电化学法 有些反应可放出质子氢，可用PH计或NaOH滴定等方法追踪变化计算出待测物的含量。,13,3.生物活性检测法 细胞或动物摄入待测物质后，待测

4、物质摄入量与细胞或动物的生理指标变化有相关性，以此检测待测物质含量。,14,4.免疫分析法 利用抗原与抗体的特异性反应，并结合生物标记，可对待测物质进行定量定性分析。,15,5.生物传感器 用生物传感器中的敏感膜与待测物质反应，可通过显示器反映有效成分的含量。,16,17,18,第三节 细胞的破碎,1.物理方法 2.化学处理 3.生物方法,19,1.物理方法,（1）研磨法：研钵，匀浆器（2）捣碎法：捣碎器（3）超声波法：超声仪（4）压榨法:挤压（5）冻融法：低温冷冻迅速取出,20,2.化学处理,（1）脂溶性溶剂：丙酮；氯仿；甲苯（2）表面活性剂：十二烷甲基黄酸钠；十 二烷基硫酸钠,21,3.生

5、物方法,（1）溶胀（2）自溶（3）生物酶降解：溶菌酶；蛋白水解酶K,22,第四节 抽提,一.抽提的含义二.抽提有效成分的影响因子,23,一、抽提的含义,用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。用缓冲液，稀酸，稀碱或有机溶剂（丙酮，乙醇）等抽提，有时还可以用蒸馏水抽提。,24,二.抽提有效成分的影响因子,1.PH值2.溶剂的极性和离子强度3.水解酶4.温度：选择合适的抽提温度5.搅拌：温和搅拌可增加溶解度 6.氧化7.金属离子8.抽提液与抽提物的比例:1:5,25,1.PH值 对蛋白质或酶等具有等电点的两性电解质物质，选择抽提液的PH值在偏离等电点。,26,2.溶剂的极性和离子强度

6、有些蛋白质或酶在极性大、离子强度大的溶液中稳定，有些则相反加入蔗糖、甘油、DMSO降低溶液极性加入KCL、NaCL、NH4CL升高溶液离子强度,27,3.水解酶 为防止酶与欲抽提的蛋白质或核酸发生反应，采取以下措施：(1)加入PMSF等酶抑制剂；(2)调节抽提液的极性、离子强度和PH值。,28,6.氧化一般蛋白质或酶含有必需集团巯基，若抽提液 中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间二硫键，导致蛋白质变性。为此，常加入2-巯基乙醇、半胱氨酸还原剂。植物组织和微生物细胞中含酚类物质，在多酚氧化酶作用下，可变为有色的醌类物质。加入苯基硫脲，可抑制这一反应。,29,7.金属离子 蛋白质的巯

7、基还能与源于缓冲液金属离子铅、铁、铜作用，产生沉淀。解决办法： 无离子水配制缓冲液 加入1-3mM EDTA,30,31,第五节 浓缩,一.沉淀法二.吸附法三.超过滤法四.透析法五.减压蒸馏法六.冰冻干燥法,32,一.沉淀法 抽提液中加入适量的中性盐如硫酸氨或有机溶剂,使有效成分沉淀，离心除去不溶物，获得上清透析或层析柱去盐。,33,二.吸附法 干葡聚糖凝胶G25或吸水棒加入抽提液，两者比例一比五，能缩小抽提液体积三倍左右.,34,三.超过滤法 在空气或氮气压力下，使小分子物质通过半透膜而大分子物质留在膜内的装置。,35,四. 透析法（1）把装透析液的透析袋埋在吸水力强的 聚乙二醇PEG或甘油

8、中；（2）真空透析。,36,五.减压蒸馏法 简易减压蒸馏装置（降低沸点）.,37,六. 冰冻干燥法 冰冻的抽提液在真空状态下，可由固体直接变为气体。,38,39,40,第六节 纯化方案的设计与评价,一.纯化方案的设计二.纯化方案的评价,41,一. 纯化方案的设计纯化的总原则：考虑抽提液中有效成分与杂质的理化性质差异，几种方法组成一个科学合理的纯化方案切忌：一种方法重复使用,42,二.纯化方案的评价 考察比活力、纯化倍数和收得率,43,第二编 纯化方法,第二章 沉淀法第三章 吸附层析第四章 疏水层析第五章 离子交换层析第六章 凝胶过滤第七章 亲和层析第八章 聚焦层析第九章 高效液相色谱第十章 固

9、定化的酶与微生物,44,第二章 沉淀法,第一节 基本原理与沉淀类型第二节 应用实例,45,第一节 基本原理与沉淀类型,一、基本原理二、制备蛋白质三、制备核酸,46,一、基本原理,根据各种物质结构不同，改变溶质的性质，致使抽提液有效成分溶解度变化。,47,二、制备蛋白质,1. 盐析法2. 有机溶剂沉淀法3. 蛋白质沉淀法4. 聚乙二醇沉淀法5. 选择性沉淀法6. 结晶沉淀法,48,1. 盐析法,(1) 盐分级沉淀(2) 盐析曲线制作(3) 盐析的影响因子(4) 脱盐,49,(1)盐分级沉淀 盐的选择：常选用硫酸铵 硫酸铵盐析 A.固体法：逐步加入固体硫酸铵，当加到一定 的饱和度时，蛋白质便可沉淀

10、出来。 B.饱和溶液法：逐步加入预先调好pH值的饱和硫酸铵， 蛋白质便可沉淀出来。 C.透析法：透析袋放入一定浓度的大体积溶液中，通过 透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度，沉淀蛋白质 。,50,(2)盐析曲线制作 硫酸铵饱和度% VS 蛋白质沉淀%,51,(3)盐析的影响因子 盐析常数 盐分级范围的差异性 PH和盐浓度 蛋白质的纯度和浓度 其它,52,盐析常数 lgS=beta-Ks X M 其中，S表示蛋白质的溶解度，M表示溶液中盐的浓度。 盐析常数Ks值大，意味着蛋白溶解度减低速度随着盐浓度增加而快速降低。,53,盐分级范围的差异性 当分离两种以上蛋白质时，若每一种蛋 白质的的Ks值都大，

11、而且盐析范围差异明显，则分离效果好。,54,蛋白质的纯度和浓度 一般控制样品液蛋白质浓度在0.2%-2%为宜。,55,其它有时需在溶液中加1mM的EDTA盐，除金属离子硫酸铵沉淀时间控制好，一般在2h左右,56,(4)脱盐：凝胶过滤法和透析法 透析法注意事项 透析带处理：用蒸馏水洗净，检查无漏洞 透析液选择：一般为低离子强度中性缓冲液 掌握透析时间：搅拌，样品液与透析液体积 比为1：10，3h.,57,2. 有机溶剂沉淀法,基本原理：与盐溶液一样具有脱水作用；有机溶剂介电常数比水小，使溶剂极性减小注意事项 (1)低温下操作 防止有机溶剂的放热使蛋白变性 (2)中性盐作用 增加蛋白质溶解度，防变

12、性 (3)多价阳离子作用 结合蛋白质，致其溶解度降低,58,3. 蛋白质沉淀法,盐沉淀法和有机溶剂沉淀法可以沉淀很多蛋白质，但是蛋白质沉淀法则仅对一类或一种蛋白质起作用。常用碱性蛋白质、凝集素和重金属离子。,59,4. 聚乙二醇沉淀法,聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。,60,5. 选择性沉淀法,根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的热点，用选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分的目的。,61,6.结晶沉淀法,蛋白质沉淀可分为晶体沉淀和无定形沉淀两类 ，前者分子排列有规则，后者分子排列无规则在提

13、纯阶段，当某一蛋白质浓度达到5%- 30%水平时，只要条件合适，就能产生一一定形状的晶体,62,三、制备核酸,1.DNA/RNP复合物的解聚2.多糖等杂质的消除3.核酸沉淀,63,1.DNA/RNP复合物的解聚,通常使DNA/RNP复合物有效解聚的办法，主要是采用加入去污剂、有机溶剂和蛋白水解酶等试剂加以实现。(1)去污剂:SDS、DOC、NP40、Triton X-100(2)有机溶剂:苯酚、氯仿（注意事项P34）(3)蛋白水解酶：溶菌酶、蛋白酶E/K,64,2.多糖等杂质的消除,(1)多糖(2)DNA与RNA的分离,65,(1)多糖动物材料分离多糖，处理前饥饿12h植物材料分离多糖，处理前

14、暗室培养数天核酸分离液中多糖，使用选择性沉淀剂,66,(2)DNA与RNA的分离 盐析：NaCL分离DNA和RNA 酶水解法：提取DNA时，可用RNase;反之，可 用DNase,67,在核酸溶液中加入某些有机溶剂和非离子型聚合物等试剂时，核酸会被有效沉淀出来。(1)有机溶剂：乙醇-盐溶液、乙丙醇(2)聚乙二醇(3)CTAB,3.核酸沉淀,68,第二节 应用实例,一、皮磷酸二酯酶的纯化二、细菌染色体DNA的制备,69,一、皮磷酸二酯酶的纯化,1.制备丙酮粉2.第一次硫酸铵分级3.第二次硫酸铵分级4.丙酮分级分离,70,第三章 吸附层析,吸附层析又称色层法或色谱法。按流动相分类，有液相层析和气相

15、层析；按固定相床的形式分类，柱层析、薄层层析、薄膜层析等。按原理不同可分为： 第一节 吸附柱层析 第二节 薄层层析 第三节 聚酰胺薄层层系,71,第一节 吸附柱层析,一、常用术语二、基本原理三、吸附剂四、洗脱剂五、层析柱的制备与层析操作六、应用与实例,72,一、常用术语,1.固定相 2.流动相 3.层析 4.操作容量 5.床体积（ Vt ） 6.洗脱体积（Ve）7.外水体积 （Vo） 8.内水体积（Vi） 9.基质体积 （Vg） 10.膨胀度11.分配系数和迁移率,73,固定相是由层析基质组成的物质，包括固体物质（吸附剂、离子交换剂）和液体物质（固定在纤维素或硅胶上的溶液）。这些物质与相关的化

16、合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。,74,在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。又称洗脱剂或洗涤剂，在薄层层析中称展层剂。,75,以基质为固定相，以液体或气体为流动相，有效成分和杂志在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物得到分离。,76,在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克（或毫升）基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。数值大，结合力强；数值小，结合力弱。,77,膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积（ Vt ）： Vt= Vo +Vi+ Vg,78,某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度

17、达到最大时的流动相体积。,79,外水体积指基质颗粒之间体积的总和。,80,内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。,81,基质体积是指基质自身所具有的体积。 Vo 、Vi、Vg都是随着床体积和基质性质变化而变化的。,82,每克溶胀基质所具有的床体积。一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大。,83,分配系数：一组分在固定相与流动相中含量的比值（K）。迁移率：一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比。 K值大，说明该组分与固定相结合力大，迁移率小；反之则结合力小，迁移率大。,84,二、基本原理,在吸附层析法中，使用的固定相基质是颗粒状的吸附剂。在吸附剂的表面存在着许多随机分布的吸附位点，

18、这些位点通过范德瓦尔力和静电引力与蛋白质和核酸等生物大分子结合。结合力大小与生物分子结构和和吸附剂的性质有密切关系。,85,三、吸附剂,1.吸附剂的选择2.吸附剂的性质,86,应具备：表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强、成本低。极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。但是为了解吸附，对于极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂。,87,使用前预处理：过筛除去大颗粒，悬浮除去细小颗粒，酸、碱浸泡，接着沸水煮，清水洗，末了用有机溶剂处理。羟基磷灰石和硅胶吸附剂的性质。,88,羟基磷灰石（HA）：吸附容量高，稳定性好，主要用于制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒、和其他生命物

19、质。 HA为干粉，使用前先在蒸馏水中浸泡。 HA悬浮液需要用旋涡振荡器混合。 忌用柠檬酸缓冲液和Ph5.5的缓冲液。 细颗粒操作容量比粗的大，分辨率也比粗的好，但用细颗粒层析时，宜采用直径较大的柱子。,89,性质 A.含水量 B.粒度活化活性测定,90,四、洗脱剂,符合条件：纯度较高；稳定性好；能较完全洗脱下所分离的成分粘度小；易和所需要的成分分开。,91,五、层析柱的制备与层析操作,1.层析柱2.吸附剂的用量3.装柱和平衡4.上样和洗脱5.吸附剂的再生,92,一般柱的直径与长度之比为1：10-1：40。采用极细颗粒吸附剂装柱时，宜用比例大的层析柱，反之采用比例小的层析柱。这样有利于节省时间和

20、提高分辨率。,93,操作容量高时，吸附剂用量少。一般吸附剂用量为被分离样品的30-50倍。若样品成分难分开，应加大吸附剂用量。,94,装柱方法有干装法和湿装法。干装法不宜将气泡排尽。湿装法先加适量溶剂到柱内，排走空气，然后把浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/3时打开柱下端开口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。,95,平衡液流至固定相表面时，关闭下端螺旋夹；加样后，打开螺旋夹；样品液向固定相移动；样品液流至固定相表面时，关闭下端螺旋夹；用洗涤液冲洗柱壁后，打开螺旋夹；洗涤液流至固定相表面时，关闭下端螺旋夹；在柱上加缓冲液，并与储液

21、瓶连通，打开螺旋夹后进行洗涤。,96,用过的吸附剂经过适当处理恢复其原有性能。,97,六、应用与实例,1.应用2.实例,98,（1）纯化生命物质（2）分离蛋白质的亚基（3）浓缩溶液,99,（1）用HA层析柱分离胞质型多角体病毒双链RNA（2）用硅胶层析柱分离纯化红曲色素（3）用硅胶层析柱分离银杏黄酮类物质,100,第二节 薄层层析,薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。 优点： 1.展层时间短 2.设备简单、操作方便，既适用于分析，也适用于制备 3.温度变化和溶剂饱和程度对Rf值影响较小 4.可使用腐蚀性显色剂 5.灵敏度高,101,主要应用于鉴定小

22、分子物质和制备少量物品，有时也用于鉴定某些大分子物质的纯度。 一 主要操作过程 二、应用实例,102,一、主要操作过程,1.薄板制备2.点样3.展层4.显色,103,玻板制板：a.玻棒涂布法 b.有机玻璃尺涂布法c.半机械涂布法 活化活性测定,104,点样量不宜太多，否则会降低Rf值；原点直径要小于2mm；薄层板在空气中放置时间要尽量短。,105,把点好样的薄层板放入预先饱和的展层装置中，让点样一端浸入展层剂中，其深度约为0.5cm，切忌样品点浸入展层剂中。当展层剂上升到离玻璃板的另一端0.5-1.0cm时，停止展层，取出玻璃板并立即画出展层剂的前缘，迅速吹干。 注意：选择适当的展层剂； 使用

23、适当的展层装置。,106,薄层可采用喷雾显色，展层谱可在紫外光下检测。,107,二、应用实例,1.用薄层法纯化和鉴定淀粉中单半乳糖苷甘油二酯和双半乳糖苷甘油二酯；2.用薄层法检测环境中残留的有机磷药物。,108,第三节 聚酰胺薄层层析,一、基本原理二、应用实例,109,一、基本原理,聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。氢键的强弱决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离物在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附和再解吸附的连续过程，就能达到分离的目的。,110,二、应用实例,1.用DNS-氨

24、基酸的聚酰胺薄膜层析鉴定肽N末端；2.用DABTH-氨基酸的薄层层析分析蛋白质序列。,111,第四章 疏水层析,基本原理：疏水层析也称疏水作用层析，它是根据有效成分和固定相之间相互作用的疏水力差异性大小，进而设法将有效成分分离出来。,112,第一节 基本原理第二节 操作与应用,113,第一节 基本原理,一、疏水作用二、吸附剂,114,一、疏水作用,结合作用：1.蛋白质表面的一些疏水补丁2.令蛋白质变形，暴露其疏水性残基3.疏水层析的特性所致,115,二、吸附剂,疏水层析过程中，所使用的固定相一般是由基质和配体两部分构成。 1.亲水性吸附剂：基质主要是交联琼脂糖， 配体是苯基或辛基化合物。 2.

25、非亲水性吸附剂：基质有硅胶和树脂，配体为苯基、辛基和烷基等。,116,第二节 操作与应用,一、层析柱的制备二、加样与洗脱三、应用实例,117,一、层析柱的制备,1.层析柱规格：h:d3；2.固定相：苯基-Sepharose CL-4B吸附剂适合分离纯化与芳香族化合物具有亲和力的物质，而辛基- Sepharose CL-4B则适用于分离纯化亲脂性较强的物质；3.装柱。,118,二、加样与洗脱,加样前，在样品溶液中加适量盐类，混匀，放置片刻即可上柱。当把样品溶液徐徐加入固定相后，先用平衡缓冲液洗涤，再用降低盐浓度的平衡缓冲液洗涤，同时用部分收集器分段收集洗脱下来的溶液，并对其进行检测。,119,三

26、、应用实例,1.纯化鸡胗钙调蛋白2.纯化苯丙氨酸裂解酶,120,第五章 离子交换层析,离子交换层析是常用的层析方法一，它是在以离子交换剂为固定相，以液体为流动相的系统中进行的。 第一节 基本原理 第二节 离子交换剂的分类及性质 第三节 离子交换剂与缓冲液的选择 第四节 操作 第五节 应用,121,第一节 基本原理（图）,离子交换剂是由基质、电荷集团和反离子构成的，它与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷集团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。反应通式：离子交换剂与各种水合离子的结合力是与离子的电荷量成正比，与水合离子半径平方成反比。,RA+B,RB

27、+A,122,各种阴阳离子结合力大小的排列顺序： 一价阳离子：Li+Na+K+Rb+Cs+ 二价阳离子：Mg2+Ca2+Sr2+Ba2+ 一价阴离子：F-Cl-Br-I-不同价阳离子：Na+Ca2+Al3+Ti4+上述排列只适用于稀溶液中；对于呈两性离子 的蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离子 交换剂的结合力，主要取决于它们的物理化学 性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。,123,第二节 离子交换剂的分类及性质,常用的离子交换剂应满足下列要求：有高度的不溶性；有疏松的多空结构和巨大的表面积，使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换；有较多的交换集团；有稳定的物理化学性质。,124,一、分类

28、二、性质,125,一、分类,1.疏水性离子交换剂：疏水性离子交换剂中的基质是一种人工合成的、与水结合力较小的树脂物质。分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。主要应用于分离无机离子、有机酸、核苷、核苷酸和氨基酸等小分子物质。2.亲水性离子交换剂：它是一类天然的或人工合成的、与水结合力较大的物质。常用的有纤维素、交联纤维素、交联葡聚糖和交联琼脂糖等。,126,阳离子交换剂电荷集团带负电，反离子带正电。根据电荷集团的强弱，又可将其分为强酸型（即带磺酸基）、中强酸型（即带磷酸集团和亚磷酸集团）、弱酸型（即带羧基和酚基）。,127,阴离子交换剂是在树脂中分别引入季胺、叔胺、仲胺和伯胺集团后构成的。 （1）当引

29、入季胺和叔胺集团时，分别为强阴性和中强阴性离子交换剂， （2）当引入仲胺和伯胺集团时，为弱阴性离子交换剂。,128,二、性质,1.颜色与形状2.交联度3.吸水量或膨胀度4.交换容量5.稳定性6.比重7.流速,129,离子交换剂在水溶液中吸水量或膨胀度与基质和电荷集团的性质，以及溶液的pH和离子强度密切相关。,130,交换容量是指离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的能力。一般用总交换容量和有效交换容量表示。影响交换容量因素：筛孔、离子强度、pH值。,131,第三节 离子交换剂与缓冲液的选择,一、离子交换剂的选择二、缓冲液的选择三、加样量的确定,132,一、离子交换剂的选择,1.阴、阳离子

30、交换剂的选择2.强、弱离子交换剂的选择3.不同离子交换剂的选择4.不同基质离子交换剂的选择,133,如果被分离物质带正电，应选择阳离子交换剂；如果被分离物带负电，则应选择阴离子交换剂；如果被分离物质为两性离子，一般根据其在稳定 pH范围内所带电荷来选择交换剂。,134,一般强离子交换剂使用pH范围较广，而弱离子交换剂适用范围较窄，分离生物样品常采用弱离子交换剂。,135,为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。 强阳性和强阴性离子交换剂应分别选择H型和OH型。 弱酸性和碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。,136,二、缓冲液和洗脱液的选择,选用的缓冲液的pH值一般比有效成分的值高一

31、个单位或低一个单位，离子强度为pI0.1时，就能很快把有效成分与杂质分开。选用的洗脱液，其离子强度和pH值应使有效成分从离子交换剂上解离下来，一般离子强度要比起始缓冲液高，pH值随着离子交换剂性质变化而变化。,137,三、加样量的测定,在10支盛离子交换剂的试管中，先用相同缓冲液进行充分洗涤、平衡，然后按总交换容量的百分数，分别加入不同量的样品液，吸取毕，取上清液测定待分离物的含量，并绘制相应图谱。,138,第四节 操作,一、离子交换剂的处理、再生和转型二、分离物质的交换三、物质的洗脱与收集四、标准操作,139,一、离子交换剂的处理、再生和转型,常规的处理步骤：（1）加过量的水悬浮除去细颗粒（

32、2）然后改用酸碱浸泡，以便除去杂质并 使其带上需要的反离子。（3）酸碱处理的次序决定了离子交换剂携带反离子的类型。,140,再生：使用过的离子交换剂，可采用一定的方法令其恢复原来的性状。转型：离子交换剂由一种反离子转到另一种反离子的过程。 阳离子交换剂转型： A.欲使其转成钠型时，用NaOH处理； B.欲使其转成氢型，则要用HCl处理； C.欲使其带铵离子，则需要用NH4OH或NH4Cl处理。,141,二、分离物质的交换,使用离子交换剂的方法有两种： A.一种是柱层析法，即将离子交换剂装入层析柱内，让溶液连续通过，该法交换效率高，应用范围广； B.另一种是分批法，即将离子交换剂加入盛溶液的容器

33、内缓慢地不断搅拌，该法设备简单，易操作。,142,三、物质的洗脱和收集,在离子交换层析过程中，常用梯度溶液进行洗脱，而溶液的梯度则是由盐浓度或酸碱度的变化形成的。梯度溶液按组成来分，一般有两种： 一是增加离子强度的梯度溶液； 二是改变pH值的梯度溶液。,143,对于增加离子强度的梯度溶液，不管用于何种类型的离子交换剂，其离子强度绝大部分是增加的。改变pH值的梯度溶液则不然，如果使用的是阳离子交换剂， pH值应从低到高递增；如果使用的是阴离子交换剂， pH值应从高到底递减。当被分离物质之间的选择系数相差较小时，洗脱液的离子强度或酸碱度的变化速率小，这样有利于分辨率的提高。,144,第五节 应用,

34、一、制备、纯化生命物质二、测定蛋白质的等电点,145,一、制备、纯化生命物质,1.用强阳离子交换树脂732分离4中核苷酸2.用离子交换法从胰酶水解的肠粘膜中提取肝素钠3.用DEAE-纤维素22层析法纯化邻苯二酚-2，3-双加氧酶4.用SP sephros HP分离生物碱,146,147,第六章 凝胶过滤,特点：设备简单、操作方便、重复性好和样品回收率高。应用：分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等，还可用于测定蛋白质的分子质量，样品的浓缩和脱盐等。,148,第一节 凝胶的分类及性质第二节 基本原理第三节 操作第四节 应用,149,第一节 凝胶的分类及性质,一、葡聚糖凝胶二、琼脂糖凝

35、胶三、聚丙烯酰胺凝胶四、Sephacryl五、Superdex,150,一、葡聚糖凝胶,1.理化性质2.稳定性 3.吸附性,151,外观为白色珠状颗粒，亲水性好。型号不同，交联度不同，筛孔的大小和分级范围也有明显的差异，其性质也不一样。一般以G型葡聚糖凝胶作为固定相，以水溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的方法称葡聚糖凝胶过滤层析。以LH型葡聚糖凝胶为固定剂，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶渗透层析。,152,在水、盐、碱、弱酸和有机溶液中性质稳定，在强酸或氧化剂溶液中易变性，保存时应加防腐剂 。,153,葡聚糖凝胶含有羧基集团，该集团能与份礼物中电荷集团发生

36、吸附作用，一般用NaCl的缓冲液消除影响。,154,二、琼脂糖凝胶,琼脂糖的商品名称因厂家不同而不同：瑞典称Sepharose；美国称Bio-gelA；英国称Segavac；丹麦称Gelarose；我国的和瑞典相同，除Segavac外，其它都以珠状琼脂糖凝胶形式出售。 琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好。,155,三、聚丙烯酰胺凝胶,商品名为Bio-gel，一般制成珠状颗粒，并以干凝胶形式出售，保存时避强酸强碱和高温。,156,四、Sephacryl,属于硬性凝胶，具有一定大小的筛孔和羧基集团。一般用于分离蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖，甚至大的病毒颗粒。,157,五、Super

37、dex,Superdex是由高交联度多空琼脂糖与葡聚糖共价结合而成的。该凝胶具有良好的分子筛特性和物理、化学稳定性。,158,第二节 基本原理 （图）,凝胶过滤又叫分子筛层析，凝胶具有网状结 构，小分子 物质能进入其内部，而大分子物质却被排阻在外部，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子质量筛分开了。任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱被排阻的范围均在0-100%之间，其被排阻的程度可用分配系数Kav表示。 Kav=（Ve-Vo）/(Vt-Vo)Vt:总体积；Vo：外水体积；Ve：洗脱体积，某一成分从柱顶达到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时流动相体积.Kav值差异性大，分离

38、效果好； 差异性小，分离效果差。 Kav值既是判断分离效果的参数，又是测定蛋白质分子质量的重要依据。,159,洗脱体积Ve的判定：1.溶液中的分子大于凝胶孔径上限者，不能进入凝胶网孔内，而 被排阻在外水体积的溶液中， Ve刚好等于Vo。2.溶液中的分子小于凝胶孔径下限者，能自由进入凝胶网孔内， Ve=Vt。3.溶液中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者，则有一部分能进入凝胶网孔，则Ve是在Vo和Vt之间。,160,测定外水体积的物质常选用蓝色葡聚糖2000，测定内水体积的物质常选用硫酸铵、N-乙酸酪氨酸乙酯，或者其他与凝胶无吸附力的小分子物质。,161,第三节 操作,一、凝胶的选择和处理二、

39、凝胶柱的制备三、加样与洗脱四、凝胶柱的再生与保存,162,一、凝胶的选择和处理,1.凝胶的选择2.凝胶用量的计算3.凝胶的处理,163,（1）型号 型号不一样，筛分范围也不一样。SephadexG型一般使用于分离蛋白质。在除去蛋白质溶液中的盐类时，可选用凝胶SephadexG-25。 （2）粒度 细颗粒凝胶之间空间小，装柱易均一，因此分离效果好。但由于细颗粒凝胶流速慢，故宜采用大直径层析柱；而粗颗粒凝胶流速快，宜采用小直径层析柱。,164,干凝胶用量（g）=r2h/膨胀度,165,加水充分溶胀，倾斜法除去悬浮颗粒，碱溶液中浸泡半小时，以抽滤法除去悬浮颗粒，用蒸馏水洗至中性。 排气方法除去颗粒空

40、隙中的气泡。,166,二、凝胶柱的制备,1.柱的选择2.装柱3.凝胶柱的鉴定,167,一般理想的层析柱的直径与长度之比是1：25-1：100。,168,同第三章吸附柱层析的装柱方法。,169,新装的凝胶柱用适当缓冲液平衡后，将带色的蓝色葡聚糖-2000、或者红色葡聚糖、细胞色素C、血红蛋白等物质配成2mg/ml的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。若均匀下降，则表明柱中凝胶是均匀的，没有裂缝或气泡。,170,三、加样与洗脱,1.加样2.洗脱,171,加样量与测定方法和层析柱大小有关。如测定样品含量的方法灵敏或床体积小时，加样量可少。否则反之。分离效果与加样体积、被分离样品在层析柱中的洗脱体积或分配

41、系数，以及凝胶床的体积有关，此外，样品的黏度也影响层析的分辨率。,172,所有的洗脱液均以能容解被洗脱物质和不使其变性或失活为原则。除特殊情况外，一般都以单一缓冲液或者盐溶液作为洗脱液，有时也用蒸馏水。洗脱时流速要严格控制，否则收集的每一部分洗脱体积就不恒定，理想的分配系数就难以测定。一般而言，洗脱流速慢，分离效果就好，但是太慢也会因扩散加剧而影响分离效果。,173,四、凝胶柱的再生及保存,1.再生2.保存,174,再生方法： （1）先用水反复进行逆向冲洗再用缓冲液进行平衡。 （2）把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行，处理后重新装柱即可再行使用。,175,短时间保存，需进行反复洗涤

42、以除去蛋白质等杂质，并加入适当的防腐剂；长时间保存，需将凝胶从柱中取出，进行洗涤、脱水和干燥。,176,第四节 应用,一、脱盐和浓缩二、分离生命物质三、去热源物质四、测定分子质量五、其他,177,一、脱盐和浓缩,利用盐类小分子物质可以进入凝胶筛孔中，而大分子物质则被排阻在其外的原理，可应用凝胶层析法除去蛋白质等溶液中的盐类，从而使其与盐类分开，一般用于这些操作的是细颗粒葡聚糖凝胶G-25。,178,二、分离生命物质,对于某些理化性质相似而分子质量不同，或者是聚合体不等的混合溶液，采用凝胶过滤法就很容易分离。目前在多糖、多肽、蛋白质、酶、激素和核酸等物质的分离提纯及制备工作中，已广泛采用凝胶过滤

43、法进行。,179,180,三、去热源物质,所谓热源物质可能是糖蛋白一类大分子物质。一般在制备水解蛋白、核苷酸和酶注射液时，采用凝胶过滤法除去热源物质效果好。,181,四、测定分子质量,由于加入凝胶柱的物质分子质量不同，故洗脱体积也不同。将已知分子质量的标准物质，在同一凝胶柱上以相同条件进行过滤层析。根据洗脱体积求出Kav值，Kav值与蛋白质分子质量之间又存在线性关系 Kav=b-clgM，因此可以绘制一条标准曲线。 例如：用葡聚糖凝胶柱色谱法测定蛋白质分子质量。,182,用葡聚糖凝胶柱色谱法测定蛋白质分子质量,1.标准曲线绘制： Kav or Ve = b-clgMA, 据Kav=(Ve-Vo

44、)/(Vt-Vo)，记录Vt和Vo蓝色葡聚糖2000洗脱体积=Vo；重铬酸钾洗脱体积=VtB，加入已知M值的蛋白混合液，记录Ve值， 绘制标准曲线，回归方程。2.未知样品分子量测定记录样品Ve值，计算出M值。,183,局限性： 洗脱液在pH6-8的范围内效果较好，而在极端pH时，会引起偏差。 一般球状蛋白质的轴比虽有差异，但lgM与Kav值的线性关系依然维持。而纤维蛋白质轴比大，不能运用以上公式。 糖蛋白中糖的比例大于5%时，测得的分子质量偏大。 变性剂和盐酸胍存在时，只要在同样的条件下测出标准曲线，依然遵守上述公式。,184,第七章 亲和层析,第一节 基本原理第二节 操作第三节 提高吸附剂的

45、操作容量第四节 应用实例,185,第一节 基本原理（图),欲分离的大分子物质S和相应的专一物质L以次级键结合，能生成一种可解离的络合物L-S，其中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合，而形成M-L-S复合物。根据L-S之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的层析方法称为亲和层析法。,原理：亲和层析是把具有识别能力的配体L以共价键的方式固化到含有活化集团的基质M上，制成亲和吸附剂M-L，而固化后的配体仍然保持束缚特异物质的能力。因此当把固相载体装入小层析柱后，让欲分离的样品液通过该柱时，样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力，以及结构互补效应等吸附到固相载体上，而无亲和力或非特

46、异性吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰，然后改变起始缓冲液的pH值、或增加离子强度、或加入抑制剂等，即可把物质S从固相载体上解离下来，并形成第二个层析峰。,187,第二节 操作,一、基质的选择二、配体的选择三、亲和吸附剂的制备四、特异性吸附五、分离大分子物质六、亲和层析柱的再生,188,一、基质的选择,要求：1.极低的非特异吸附性2.高度的亲水性3.较好的理化稳定性4.大量的化学集团能被有效的活化，且易于配体结合5.适当的多孔性，实践中用得较多的是聚丙烯酰胺凝胶、多孔性玻璃珠和琼脂糖珠，目前应用最多的是琼脂糖珠。,189,二、配体的选择,配体的选择要耐心细致，可选择的配体有

47、抑制剂、效应物、酶的辅助因子、类似底物、抗体和其他物质。 满足条件： 1.与纯化的物质有较强亲和力； 2.具有与基质共价结合的集团。,190,三、亲和吸附剂的制备,把配体偶联到基质上的方法有物理的和化学的两类。前者如包埋法和吸附法等，后者如偶联法和交联法。 溴化氰偶联法主要包括活化、偶联、除去未结合的配体和配体结合量的测定等步骤。,191,四、特异性吸附,样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量，除了与它们之间的亲和力有密切关系外，还与样品的pH值和离子强度有关系。,192,五、分离大分子物质,洗脱专一吸附大分子物质的条件，要使复合物完全分离，其具体做法可根据亲和力决定： 亲和力比较小时，可以连续

48、用大体积平衡缓冲液洗脱，得到迟缓的大分子物质峰； 亲和力一般时，主要靠改变缓冲液的性质，使复合物之间的亲和力下降到足以分离的程度； 亲和力强时，可用与配体竞争的溶液或用蛋白质变性剂洗脱。,193,A.竞争性洗脱剂：这类洗脱剂的优点是专一性强，并能洗脱出和配体特异结合的大分子物质。,194,B.蛋白质变性条件：如用盐酸胍、尿素等变性试剂配制的溶液洗脱下的蛋白质等生命大分子物质，需要经过适当的处理方可恢复活性。,195,六、亲和层析柱的再生,当洗脱结束后，应连续用大量的洗脱液或高浓度的盐溶液彻底洗涤柱子，接着再用平衡缓冲液使层析柱重新平衡。经过这样处理的柱子可再次上样，进行第二次层析。,196,第

49、三节 提高吸附剂的操作容量,方法1.在配体和基质间引入“手臂”；2.增加配体取代的程度；3.配体与基质以最少的键连接；4.基质多孔性的影响；5.样品的浓度、pH值、离子强度以及上样的速度等因子对其影响也不可忽视。,197,第四节 应用实例,一、纯化大分子物质二、研究酶的结构和功能三、实例,198,一、纯化大分子物质,1.抗体、抗原及其结合物2.糖蛋白3.含巯基蛋白4.核酸5.其他,199,用于纯化抗体、抗原及其结合物的配体主要有抗原、抗体和金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA）等物质。利用SPA-Sepharose CL-4B 固相载体可以分离IgG、抗原和免疫复合物。还可以利用结合的IgG的SPA-

50、Sepharose CL-4B吸附剂还可分离特异性的抗原。,200,目前用于纯化糖蛋白的配体主要是凝集素，不同的凝集素结合糖蛋白的类型不同。,201,用活化的巯基Sepharose 4B或巯基丙酰-Sepharose 6B和Hg-Sepharose4B吸附剂可以分离含巯基的蛋白质、酶、肽以及汞化或巯基化的核苷酸。,202,用Poly-Sepharose吸附剂可以分离mRNA；用Poly-Sepharose4B吸附剂可以分离很多物质，如束缚mRNA的蛋白质、束缚Poly的RNA等；用Lysine-Sepharose4B吸附剂还可以分离rRNA、双链DNA和血纤维蛋白溶酶原等；另外，用固相免疫亲和