植物组织培养ppt课件.ppt

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1、植物组织培养,Plant tissue culture,目 录,第一章 实验设备及技术第二章 外植体的选择与灭菌第三章 外植体的接种培养与驯化,植物组织培养是二十世纪发展起来的新技术，近几十年来，由于组培基础理论的研究深入，发展极为迅速，几乎以植物为研究对象的各个分支学科都在广泛进行组培。定义：是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工控制的条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化形成完整植株的过成。,一、 植物组织培养的分类及相关概念,1 根据培养的对象不同，可分为： 器官培养（organ culture） 组织培养（meristem culeure） 胚胎培养

2、（embryoid culeure ） 细胞培养（cell culeure ） 原生质体培养（protoplast culeure ）,2 根据培养过程不同，分为 初代培养（primary culture） 继代培养（ subculture）3 根据培养基物理状态，分为 固体培养（solid culture） 液体培养（liquid culture）,4 相关概念（1）外植体（explant）：由活体（in vivo） 上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。（2）愈伤组织（callus）：在人工培养基上由外植体形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。（3）分化（differentia

3、tion）：指由受精卵或胚状体经细胞分裂，引起极性生长形成根、茎、叶、花等不同组织器官的过程。,（4）脱分化（dedifferentiation）：由高度分化的植物组织或器官产生无分化状态的愈伤组织的过程。（5）再分化（redifferentiation）：将脱分化形成的愈伤组织转移到适当的培养基上继续培养，这些无定形的愈伤组织又会重新分化出根、茎、叶、花形成完整植株的过程。,二、植物组织培养的理论依据及特点,（一）理论依据 植物细胞的全能性（totipotency）： 是指植物体任何一个细胞都携带着一套发育成完整植株的全部遗传信息，在离体培养条件下，这些信息可以表达，产生出完整植株。,原理：

4、生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必须的全套基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。差异：（1）受精卵的全能性最高（2）受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞低。,在正常情况下： 受精卵分裂、分化种子萌发 完整植株（具有根、茎、叶、花、果实） 在离体条件下： 离体组织、器官 （在培养基上） 细胞分裂（脱分化） 愈伤组织 再分化 完整植株（具有根、茎、叶、花、果实）,（二）植物组织培养过程： 植物体 （分离）外植体 （脱分化）愈伤 组织 （再分化）生长点 完整植株（具有 幼根、幼茎）,（三）植物组织培养条件： 含有全部营养成分的培

5、养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时的光照。（四）外植体生长和分化途径： 1 .器官发生途径： A.由分生组织直接分生芽。 B.由分生组织形成愈伤组织，经过再分化形成完整植株。 2.胚状体发生途径： 由游离的细胞或原生质体形成胚状体（embryoid），直接重建完整植株，或制成人工种子后重建植株。,（五）植物组织培养的特点 1、优越性：可以在不受植物体其他部分干扰的情况下研究被培养部分（外植体）的生长和分化规律。 2、 特点： （1）取材少，培养材料经济； （2）人为控制培养条件，不受自然条件影响； （3）生长周期短，繁殖率高； （4）管理方便，利于自动化控制 。,3、重要性：

6、（1）理论上：是研究细胞学、遗传学、育种学、生物化学和药物学等学科的重要手段。 （2）生产上：在农学、园艺、林业和次生代谢物工程等生产领域得到广泛应用。,三、植物组织培养的发展历史,1902年，德国植物学家Haberlandt提出细胞全能性的概念。1904年，E. Hanning 培养萝卜和辣根菜属的一种植物的胚，使其发育成熟。1908年，S. simon 研究培养白杨嫩茎，观察到愈伤组织的发生和根芽的形成。1958年，美国科学家Steward等和德国Reinert分别用胡萝卜根细胞诱导形成胚状体，使细胞全能性得到证实，为组织培养技术程序奠定了基础。,1960年，E. C.cocking采用纤

7、维素酶,果胶酶等酶制剂分离番茄幼根，获得大量健康的原生质体。1962年，Murashige和Skoog在烟草培养中筛选出至今仍然被广泛使用的MS培养基。1964年，印度科学家S. Guha和 Msheshwari培养南洋金花未成熟的花药时，发现了由大量胚状体形成的小植株（单倍体植株）。罗士韦是我国植物组织和细胞培养研究的开拓者和奠基人之一。在30年代即开始离体根的培养，随着又进行幼胚和茎尖的培养。,70年代初期开始，我国掀起了单倍体育种的高潮，在小麦、水稻、烟草、玉米、三叶橡胶等作物上取得了一批有意义的成果。80-90年代，全国研究工作内容明显倾向无性系的快速繁殖，许多机构开始转向应用，成为生

8、产实体，如甘蔗、草莓、葡萄、菠萝、香蕉，各色观赏植物等。现在，我国在原生质体培养，体细胞杂交、突变体筛选、去除病毒、次生代谢物的发酵生产、人工包装超级种子等方面都有了进步。,四、植物组织培养的应用,1、快速繁殖：运用组织培养途径，一个植株一年可以繁殖几万到几百万个植株，例如，一株葡萄一年繁殖3万多株，一株兰花一年繁殖到400万株。2、种苗脱毒：针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗，已经取得的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等。,3、远缘杂交：利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。4、突变育种：采用组织培养可以直接诱变和筛选出具

9、抗病毒、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。,5、基因工程：基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后，必须通过组织培养途径才能实现植株再生。6、生物制品：有些极其昂贵的生物制品，比如抗癌首选药物紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。,第一章 实验设备及技术,第一节 实验室,植物组织培养是在严格的无菌的条件下进行的，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。 1、实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。 2、实验室组成： 化学实验室、洗涤灭菌室、无菌操作室（接种室）、培养室、细胞学实验室、 移栽大棚。,化学实验室（准备室）：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、

10、配制、培养基分装等。 主要设备：药品柜、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器。洗涤、灭菌室：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。 主要设备：水池、操作台、高压灭菌锅、干燥灭火器（如烘箱）等。,无菌操作室（接种室）：主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。 主要设备：紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）等。 接种室宜小不宜大，一般78平米，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。

11、,接种室要求干爽安静，清洁明亮，在适当位置吊装12盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。接种室应设有缓冲间，面积为1m为宜。进入无菌操作室前在此更衣换帽，以减少进出时带入接种室杂菌。缓冲间最好也安装一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。,培养室：培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。培养材料放在培养架上培养。培养架大多有金属制成，一般设5层，最低一层离地面高约10cm，其他每层间隙30cm左右，培养架即高1.7m左右。培养架的长度是根据日光灯的长度

12、而设计的，如采用40W的日光灯，则长1.3m，30W的长度为1m，宽度为60cm。,培养室最重要的因子是温度，一般保持在2027C左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70%80%为好，可安装加湿器。控制光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照1016小时，也有的需要连续照明。,现代组培实验室大多设计为采用天然太阳能作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天可用灯光作补充。主要设备：培养架（控光）、摇床、培养箱（控温控光控湿）、加湿器、空调、紫外光源等。,细胞学实验室：用于培养物的显微观察分析与培养物的记数

13、等。主要设备：实体显微镜、显微镜、倒置显微镜。其他小型仪器设备：分注器、血球计数器、移液器、过滤灭菌器、电炉等加热器具、磁力搅拌器、低速台式离心机等。,移栽大棚基本要求： A：配置培养架（台），与相关器具， B：防晒、防雨、防虫， C：缓冲间，堆料件。,第二节 植物组织培养的 培养条件,一、营养条件培养基（culture medium）在离体培养条件下，不同种植物的组织对培养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才能成功。,培养基种类,固体培养基,液体培养基

14、,营养分布均匀，生长整齐一致，但通气性差。,通气性较好，便于操作，但营养分布不均，生长发育不整齐。,培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基（MS培养基），也有对某些成分进行改良的改良培养基。,常用培养基种类,目前国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下：（1）MS培养基：它是1962年由Murashige和Skoog为烟草细胞而设计的。 特点是 无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。 其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。 它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛用于植物的器官、花药、细胞和原

15、生质体培养效果良好。,（2）B5培养基：是1968年由Galmborg等为培养大豆而设计的。 特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。（3）White培养基：是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSo4的浓度和增加了硼素。 特点是无机盐数量较低，适于生根培养。,（4）N6培养基：是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。 特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4 的含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养

16、基和其他组织培养。（5）KM8P培养基：它是1974年为原生质体培养而设计的。 特点是有机成分较复杂，它包含了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质体融合的培养。,水（H2O）配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。,无 机 盐,元素名称 添加形式 N KNO3,NH4NO3大量 P KH2PO4 NaH2PO4元素 K KCl KNO3 (0.5mmol/L) Ca CaCl2 2H2O Mg Mg2SO4 7H2O S Mg2SO4 7H2O Fe FeNa2-EDTA微量

17、 B H3BO3元素 Mn MnSO4( 0.5mmol/L) Cu CuSO4 Mo Na2MoO4 2H2O Cl CaCl2 2H2O,二、有机物,维生素,肌醇,氨基酸,天然复合物,椰乳,香蕉泥,水解酪蛋白,碳水化合物,马铃薯,其它,碳水化合物,选用种类：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等蔗糖浓度：23%，胚培养为415%高压灭菌部分糖会分解。大生产时可用绵白糖,糖在培养基的作用： 1）、为细胞提供合成新物质的碳骨架 2）、为细胞的呼吸代谢提供底物和能量 3）、维持渗透压,种类： VB1、 VB6、 Vpp、Vc(生物素 、叶酸）浓度：0.11.0mg/L作用： VB1促愈伤组织产生，提高活力 V

18、B6 促根生长 Vpp与代谢和胚发育有关 Vc防组织褐变,维生素,维生素：硫胺素(VB1)、烟酸（VB3又称VBPP ） 、泛酸(VB5)、吡哆醇(VB6)、钴胺素(VB12)、叶酸(VM又称VB11)、抗坏血酸(VC)等等.因培养基的种类不同，其种类和浓度不同 氨基酸：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、 天冬酰胺、丙氨酸等等。因培养基的种类不同，其种类和浓度不同。 肌醇：又称环己六醇，在糖类的转化中起作用。根据培养基的植物不同，是否添加。 腺嘌呤、硫酸盐：加入培养基时，可促进芽的形成和生长。,常见糖和维生素及其主要性质,椰乳：促愈伤组织和细胞培养，用量1020%，使用注意茎尖大小香

19、蕉泥：对PH值缓冲大，用量150 200ml/L ，应用在兰花组培马铃薯：对PH值缓冲大，用量150200g/L，使苗壮水解酪蛋白：浓度100200mg/L，应用在微茎尖培养其它：,天然复合物,植物生长调节物质（hormone）植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各种成分中，植物生长物质是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。,1）生长素类（auxin）：在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、

20、伸长生长。在极低的浓度下（10-510-8mg/L）就可促进根生长，其次是茎和芽。天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。,IBA（indolebutyri acid 吲哚丁酸）：是促进发根能力较强的生长调节物质。IAA（indo acetic acid 吲哚乙酸）：是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小。高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。2，4D（2，4二氯苯氧乙酸）启动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育，适宜的用量范围较窄，过量常有毒效应。,N

21、AA（naphthalene acetic acid 萘乙酸）：在组织培养中的启动能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛应用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。,2）细胞分裂素类（cytokinin）：这类激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA（6-苄基氨基嘌呤）、Kt（kinetin 激动素）、Zt（zeatin 玉米素）等。在培养基中添加细胞分裂素有三个作用（1）诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长（2）促进细胞分裂与扩大（3）抑制根的分化。 因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养中使用

22、较少或用量较低。,3）GA（gibberellic acid 赤霉素）： 有二十多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同、培养基中添加的是GA3，主要是促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株；赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素/赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化,此外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。,激素配比模式生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，即是诱导愈伤组织、长根还是长芽。 高 有利于根和愈伤组织形成生长素/细胞分裂素中 有利于芽的分化 低 有利于芽

23、的形成,生长调节物质的使用甚微，一般用mg/L表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0.05%-5mg/L，细胞分裂素的浓度0.05-10mg/L。,抗生物质（antibiotic）抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5-20mg/L之间。添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物，采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间。尤其对大量通气长期培养，效果好。对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5%-10%的抗菌素。抗生素各有其抗菌谱，要选择加以利用，也

24、可两种抗生素混用。,活性碳（active carbon）活性炭为木炭加工形成的粉末结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附力越强。温度低吸附力强，温度高吸附力弱，甚至解吸附。通常使用浓度为0.510g/L。,活性炭作用：茎尖初代培养，可以吸附外植体产生的致死性褐化物。活性炭在生根时有明显促进作用。其机理一般认为与活性炭减弱光照有关。在培养基中加入0.3%的活性炭，还可降低玻璃苗的产生频率。活性炭在胚胎培养中也有一定作用，可减少组织变褐和培养基变色，产生较少的愈伤组织。,研究表示，每毫克活性炭吸附100mg左右的生长调节物质，这说明只要极少

25、量的活性炭就可以完全吸附培养基的调节物质。大量活性炭加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加一些琼脂。很细的活性炭也易沉淀，通常在琼脂凝固之前，要轻轻摇动培养瓶。,二 .培养材料的支持物琼脂（agar）：在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40C即凝固为固体溶胶。通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于90C以上的热水。琼脂的用量在6-10g/L之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度太低，凝固性不好。,琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力除与原料

26、、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、PH值等因素有关。长时间的高温会使凝固力下降，过酸过碱会加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。,三、环境条件 在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、pH值、渗透压等各种化学环境条件都会影响组织培养育苗的生长和发育。,温度(temperature),大多数植物组织培养都是在2327之间进行，一般采用25 2。低于15时培养，植物组织会表现生长停止，高于35时对植物生长不利。不同植物培养的适温不同，百合的最适温度是20、月季足25-27、番茄是28。温度不仅影响植物组织培养育苗的生长

27、速度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以28为最好，在120以下，33以上形成率皆最低。,不同培养目标采用的培养温度也不同，百合鳞片在30以下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率都比在25以下的高。桃胚在25条件进行一定时间的低温处理，有利于提高胚培养成活率。用35处理草莓的茎尖分生组织35d，可得到无病毒苗。,光 照 (light),1光照强度(light intensity)光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光照强度对外植体及细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。2光质(light

28、wave)光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。,3光周期(light period)试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，有时需要暗培养，尤其是一些植物的愈伤组织在暗下比在光下更好。如红花、乌饭树的愈伤组织.,湿度 (humidity),湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件，容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季应适当减少琼脂用量，否则，将使培养基干硬，以致不利于外植体接触或插进培养基，导致生

29、长发育受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，但封闭性较高的封口材料易引起透气性受阻，也会导致植物生长发育受影响。,环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，一般要求70%80%的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进行。湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。,渗透压(penetrating pressure),培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，会影响到渗透压的变化。通常12个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而56个大气压植物生长就会完全停止，6个大

30、气压植物细胞就不能生存。,H值 (pH value),大多在5、6.5左右，一般培养基皆要求5.8，这基本能适应大多植物培养的需要。 pH值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。以硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一样，后者较高一些。一般来说当pH值高于6.5时，培养基全变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低pH值(约0.20.3个pH值)因此在配制时常提高pH值0.20.3单位。pH值大小调整可用0.1M的NaOH和0.1M的HCl来调整。lml的NaOH可使pH值升高0.2单位，lml的HCl可使pH值降低0.2单位。调节时一定要充分搅拌均匀。,氧气(oxygen),氧气是

31、组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。培养室要经常换气，改善室内的通气状况。液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类型、培养基等 .,第三节 培养基的制备,一、母液(stock solution)的配制和保存通常先配制一系列母液，即贮备液。 所谓母液是欲配制液的浓缩液，这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高10-100倍。 母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。,配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如Ca2+和S042+，Ca2+、 Mg2+和PO43-

32、一起溶解后，会产生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等母液，其中维生素、氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。母液配好后放人冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。,为什么要配制母液？ 1）、方便 2）、准确（有些成分量太小） 3）、溶液要分类配，否则有些成分混合一起会产生沉淀 以MS培养基为例：钙离子与硫酸根离子容易结合成溶解性较差的硫酸钙。,MS培养基母液的配制,(一)母液配制流程图,称 量,母液分装,确定培养基,溶 解,定 容,贴标签,保存于冰箱,一、母液配制 (以MS为例),称量药品,天平预置全显示清 零称 药,(二)母

33、液配制要求：1.母液浓缩倍数：10-100 ，大量元素10；微量元素、铁盐100；有机物50；2.选用蒸馏水、重蒸馏水、分析纯或化学纯试剂3.防止沉淀4.激素母液浓度：1mg/ml,1次配成50或100 ml5.激素溶解： IAA、IBA、GA、ZT先溶95%酒精再定容； NAA先溶于热水或95%酒精再加水； 2，4-D先溶于1 mlNaOH再加水； KT、BA先溶于1 mlHCl再加水。,二、培养基配制,移母液,调PH值,培养基熬制,灭菌,称取蔗糖、琼脂,扎口,定容,分装,二次定容,接种,确定配方,大量元素母液,微量元素母液,铁 盐母液,有机物母液,取100ml,取10ml,取10ml,取1

34、0ml,注：MS培养基配制,容量瓶,要求：一次性移取，不能吸进吸气球里，数量看准，不滴不漏，吹净为度。,移母液,称取蔗糖、琼脂,用自来水定容到1升取蔗糖2530g，琼脂78g。,培养基熬制：,3.将容量瓶中剩余的液体一并倒入铝锅中，摇晃使均匀。,1.将定容好的培养液取1/3倒入铝锅中，同时加入称好的蔗糖和琼脂，边煮边搅拌，防止糊底。,2.用旺火煮开，再用文火加热，直至琼脂全部融化。,用0.1MNaOH或HCl调PH值为6.0。,调PH值：,分装：,趁热分装，100ml的三角瓶约装入3040ml, 35瓶/L。,扎口与灭菌:,要求封口松紧适宜，系活扣，便于接种操作。,培养基应及时灭菌，防止变质。

35、,灭菌后，应尽快地转移培养瓶使其冷却，一般应将灭菌后的培养基储藏于30以下的室内，最好储藏在410的条件下。 应当注意的是，某些生长调节物质如IAA、ZT、ABA等以及某些维生素是不稳定的，不能和其他的培养基一起高压灭菌，而要进行过滤灭菌。,第二章 外植体的选择及灭菌,第一节 外植体的选择泛指第一次接种所使用的植物组织、器官等一切材料。如，顶芽、茎段、叶片等。（一）外植体的选择：一. 取材部位：不同的植物、器官和组织其形态发生能力很不相同。,在选择植物外植体进行组织培养时，还要考虑待培养材料的来源是否保证，是否容易成苗；茎尖：对大多数植物来讲，茎尖是较好的部位，由于其形态已经基本建成，生长速度

36、快，遗传性稳定，也是获得无病毒苗的重要途径，但茎尖易受到材料来源的限制，而采用茎段（一般木本植物、较大的草本植物）可解决培养材料的不足。,叶片：由于叶片的来源最有保证，因而许多植物的组织培养以叶片为起始培养物，如，玫瑰、海棠、矮牵牛和豆瓣绿等许多植物。子叶或下胚轴：对一些培养较困难的植物，则往往可以通过其子叶或下胚轴来建立其组织培养体系。,二. 取材季节：对大多数植物而言，应在生长开始的季节采样较好。在母株生长旺盛的季节取材料，不仅成活率高而且增殖率也大。,三. 生理年龄：幼年的组织都比老年的组织具有较高的形态发生能力。植株下部组织产生营养芽的比例高，而上部组织产生花器官的比例高。外植体的采集

37、尽量选用植物体最幼态的组织。,四. 外植体的大小：外植体越大，污染率越高，但也不能过小，越小成活率越低。在通常情况下，叶片、花瓣等的面积约为5mm，茎段为0.5cm，除非是用于去除病毒，否则不宜将外植体切得过小。,第二节 灭菌灭菌是组织培养重要的工作之一。有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物.,无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方法必须已经证明是有效的)。高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元

38、素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。,灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物.通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台等)和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。,灭菌室的设置及配备,一. 灭菌方法常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类物理方法如:干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声

39、波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是:使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。,湿热灭菌（培养基）培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。常用方法是： 关闭放气阀，通电后，待压力上升到O.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。 关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时压力0.1-0.15MPa，20min。,对高压灭菌后不变质的物品

40、，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.2-0.3单位。高压后培养基pH值的变化方向和幅度取决于多种因素。,高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。在8%-20%蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基渗透压约升高0.43倍。培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基pH值小于5.5，其水解量更多，培养基中添加0.1%活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1%活性炭，蔗糖水解率可

41、达5%。,1.外桶 2.锅盖3.安全阀4.排气阀5.气压表6.内桶7.排气软管8.支架,手提式高压湿热灭菌锅,自动高压湿热灭菌锅,电源,水位指示灯,温度、压力显示窗,温度压力设置钮,压力表,放汽阀,培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间,容器体积(mL) 121灭菌所需最少时间(min),20-50 15,1000 30,250-500 25,75-150 20,过滤灭菌（不耐热的物质 ）,一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。防细菌滤膜的网孔的直径为0.45m以下，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻.

42、在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌。,过滤灭菌,滤膜0.45um以下,1.过滤器先灭菌，灭菌温度不超过121。2.溶液先进行初滤(滤膜0.65um),灼烧灭菌（用于无菌操作的器械 ）,在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入75%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入75%的酒精，以便插入工具.,干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）干热灭菌是利用烘箱加热到160-180的温度持续90min来杀死微生物。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。灭菌

43、时应渐进升温，达到顶定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。,紫外线和熏蒸灭菌（空间）(1)紫外线灭菌 在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线的穿透物质的能力很弱，只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。(2)熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。,常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5-8mlm3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。,喷

44、雾灭菌（物体表面）,物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70%的酒精反复涂擦灭菌，l%-2%的来苏儿溶液以及0.25%1%的新洁尔灭也可以。,消毒剂灭菌（用于植物材料表面）第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。最理想的清洗物质是表面活性物质吐温。,第二步 是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用

45、70%酒精浸1030s。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍长的时间。,第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取12种使用见表。,常用灭菌剂使用浓度及效果比较表,灭菌剂应在使用前临时配制，氯化汞可短期内贮用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的，故灭菌时用广口瓶加盖较好；升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的；过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的，这种药剂残留的影响较小，灭菌后用

46、无菌水涮洗34次即可；由于用升汞液灭菌的材料，难以对升汞残毒较难去除，所以应当用无菌水涮洗810次，每次不少于3min，以尽量去除残毒。,灭菌液要充分浸没材料，宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。在灭菌溶液中加吐温80或Tnton X效果较好，这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布，更容易浸人到灭菌的材料表面。但吐温加人后对材料的伤害也在增加，应注意吐温的用量和灭菌时间，一般加入灭菌液的O.5%，即在100ml加入15滴。最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-l0次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。,第三

47、章 外植体的接种培养及驯化,接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起，接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1%3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾，使空气中灰尘颗粒沉降下来。无菌操作可按以下步骤进行：,第一节 接 种,接种室的设置和配备,（一）接种室的灭菌（二）超净工作台的灭菌（三）接种器皿、用具的灭菌（四）工作人员接种前应做的准备工作（五）材料的灭菌,作好接种前准备,超净工作台的灭菌,1、开风机前将紫外灯打开30分钟以上2、之后开风机15

48、分钟3、用75%酒精洗工作台面,接种器皿、用具的灭菌,用具先用75%酒精浸泡，后于酒精灯外焰灼烧,一个典型的灭菌流程,防止空气污染,接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中,正 确 错 误,防止操作带来的污染,A、整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速,正 确 错 误,B、接种过程中尽可能达到悬空要求,防止操作带来的污染,正 确 错 误,C、接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口,防止操作带来的污染,正 确 错 误,D、瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口,防止操作带来的污染,正 确 错 误,分布均匀,外植体必须与培养基紧密接触，且在培养容器内均匀分布，以保证营养的充分利用，以

49、及光照条件均匀一致,正 确 错 误,种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足,正 确 错 误,接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中,正 确 错 误,接种带腋芽的茎段：为促进带顶芽的离体茎段中腋芽的生长，最好将茎段平放在培养基上，可破除顶端优势，有利腋芽生长。,正 确 错 误,第二节 培养和驯化,指把培养材料放在培养室(有光照、温度条件)里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。,培养室的设置及配备,一、培养方法,(1)固体培养法 即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。 虽然该方法设备

50、简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。,(2)液体培养法 即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50-100rmin，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。,二、培 养 步 骤,1 . 初代培养 初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。即接种某种外植体后，最初的几代培养。 初代培养时，常用诱导或分化培养基，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。 初代培养建立的无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。