分解尿素的细菌、分解纤维素的微生物的分离说课讲解ppt课件.ppt
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1、课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌能利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,3、课题目的,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,1、实例: PCR技术,启示:寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求,到相应的环境中去寻找。,原因:因为热泉温度70800C,淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。,DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA
2、大量复制(PCR)的技术,此项技术要求使用耐高温(930C)的DNA聚合酶。,.筛选菌株,要分离一种微生物,必须根据该微生物的特点,包括营养、生理、生长条件等;方法: 抑制大多数微生物的生长 促进目的菌株的生长结果:培养一定时间后,该菌数量上升,再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。,2、实验室中微生物的筛选原理:,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等),同时抑制其他微生物生长。,3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基:,从物理性质看此培养基属于哪类?,固体培养基,在此培养基中哪些作为碳源、氮源?,碳源:葡萄糖 氮源:尿素,培养基的氮源为尿素,只有能合成脲酶的微
3、生物才能分解尿素,以尿素作为氮源。,5、培养基选择分解尿素的微生物的原理,允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基,叫做选择培养基,6、怎样证明此培养基具有选择性呢?,以尿素为唯一氮源的培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,是,分离尿素细菌,判断该培养基有无选择性,只生长尿素细菌,生长多种微生物,是,找规律:1:判断某个培养基是否具有选择作用时,应设立_培养基进行对照。2:判断所使用的培养基是否被杂菌污染时,应设立_培养基进行空白对照?,基 础,不接该菌种的,1、显微镜直接计数:,利用血球计数板(血细胞计数板),在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,.统计菌落数目:,不
4、能区分死菌与活菌;不适于对运动细菌的计数;,缺点:,2.间接计数法(活菌计数法)原理:在稀释度足够高时,微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的,即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法:稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M其中,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml),M代表稀释倍数。,说明设置重复组的重要性。在设计实验时,一定要涂布至少3个平板,作为重复组,才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时,一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致,结果不一致,意味着操作有误,需要重新实验。,注意事项为了保证结果准确,一般
5、选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中,经涂布,培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,计算公式:,每克样品中的菌株数 =(CV)M,某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234,那么每克样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml) ( )A. 2.34108B. 2.34109C. 234D. 23.4,B,(三)设置对照,判断培养基的制备是否合格(有无被杂菌污染):,将未接种的培养基同时进行培养。,判断选择培养基是否具有筛选作用:,完全培养基(营养成分齐全)接种后培养观察菌落
6、数目。,主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响,提高实验结果的可信度。,实例:在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时,A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落,但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因:土样不同培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),小结:通过这个事例可以看出,实验结果要有说服力,对照的设置是必不可少的。,方案一:由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二:将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养,作为空白对照,以证明培养基是否受到污染。,结果预测:如果结果与A同学一致,则证明A无误;如果结果
7、不同,则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右,再取样,将样品装入事先准备好的信封中。,“微生物的天然培养基”,一土壤取样,数量最大、种类最多,大约70%90%是细菌,取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。,应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中,每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度原因:不同微生物在土壤中含量不同目的:保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,(二)样品的稀释,(三).取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度。,还少了什么吗?,未
8、接种的选择培养基,接种的完全培养基,(四).微生物的培养与观察,在菌落计数时,每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果,以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌:3037培养12d 放线菌:2528培养57d 霉菌:2528的温度下培养34d。,微生物的培养与观察,一无菌操作1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中,塞好棉塞。3、在稀释土壤溶液的过程中,每一步都要在火焰旁操作。二做好标记注明培养基种类、培养日期、稀释度等。三规划时间,三、,四.结果分析与评价1
9、.通过对照实验,若培养物有杂菌污染,菌落数偏高;若培养基没有发挥选择作用,则菌落形态多样,菌落数偏高。2.提示:选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊,如相差较大,表示实验不精确。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板,则说明稀释操作比较成功,1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后,如果PH升高,指示剂将变红,说明该细菌能够分解尿素。,五.课外延伸,纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质,植物每年产生的纤维素超过70亿吨;分布植物的根、茎、叶中;,纤维素生物燃料:最有希望替代石油能源,一
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