实验动物质量控制ppt课件.ppt

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1、1,第一节 实验动物分级及特点,一、从微生物控制方面分级,2,(1)普通动物(conventional animal, CV)(2)清洁动物(cleaning animal, CL)(3)无特定病原体动物(specific pathogen free animal, SPF)(4)悉生动物(animal with known bacterial flora)(5)无菌动物(germ free animal ,GF),1、按微生物学控制的动物分类,3,2、国际分级法,4,3、国家标准分级,5,二.主要动物特点及应用,1.清洁动物与SPF动物的应用CL动物国际上认为仅适合短期或部分科研实验；我国认

2、为适用于大多数科研实验，可用于生物医学研究的各领域。SPF动物适用于所有科研实验，是目前国际标准级别的实验动物。,6,2、无菌动物的特点形态学改变消化系统: 盲肠膨大，易发生盲肠扭转，导致破裂。循环系统：心脏变小。免疫系统：胸腺上皮细胞变大，胞浆泡状结构和溶酶体变小。生理学改变免疫功能：免疫应答慢，过敏反应、对异体移植物的排斥反应以及自身免疫现象消失或减弱。对微生物感染非常敏感。生长率：豚鼠、兔生长率降低，大、小鼠改变不大。代谢：水分代谢周期延长，肠管对水的吸收率低。营养：体内不能合成VitB、VitK。抗辐射能力：增强。寿命：长于普通动物。,7,3、悉生生物学(gnotobiology)：

3、1885年pasteur认为宿主动物没有肠道菌群参与，生命难以维持。无菌动物的问世，证明肠道菌群的存在，并非完全是哺乳动物生存所必需。 悉生生物学是以无菌隔离技术提供的各种动物为实验对象，研究实验动物本身以及各种动物与微生物之间相互依存和制约关系的一门综合科学。,8,悉生动物的特点（1）GN动物是动物与微生物的共生复合体。（2）肠道存在能合成维生素和氨基酸的细菌，不会出现维生素缺乏症。（3）生活力、抵抗力明显增强，易于饲养。,9,4、GF动物的应用微生物研究（1）GF是研究微生物与宿主相互作用，即微生生物与宏生生物相互关系，微生物与微生物的共生与拮抗关系的最佳动物。（2）口服霍乱弧菌使幼龄GF

4、豚鼠死亡，口服前感染梭状芽胞杆菌，动物不发生死亡；口服福氏痢疾杆菌使幼龄GF豚鼠死亡，口服前接种大肠杆菌，动物不发生死亡。（3）炎症涉及细菌感染的多因素作用，GF可把多因素变成单因素，整体反应变成局部反应。,10,老年学研究 GF大鼠寿命比CV大鼠延长1/3。 雌性GF寿命比雄性动物短，雌性CV动物比雄性长。 2-3年的GF大鼠脏器均未呈现同龄CV大鼠所具有的各种衰老变化。,11,肿瘤学研究在致癌因素中，微生物引起癌变的比重较大。GF大鼠比CV大鼠易发生激素依赖性肿瘤。GF动物口服苏铁素不出现肿瘤，但CV动物口服苏铁素出现肿瘤。,12,三. 按遗传学控制分类 近交系(inbred strain

5、) 封闭群（closed colony）或远交系(outbred stock) 杂交群(hybrids),13,（一）近交系的应用1遗传组成和遗传性状一致，对实验反应一致，因此，只需用少量的动物，即可得到非常规律的实验结果。2组织相容性抗原一致，异体移植不产生排斥反应，是组织细胞和肿瘤移植实验中最为理想的材料。3明显的生物学特征，如先天畸形，高肿瘤发病率，对某些因子敏感和耐受等，这些特点在医学研究中是天然模型，非常重要。4多个近交系同时使用不仅可分析不同遗传组成对某项实验的不同反应与影响，还可观察实验结果是否具有普遍意义。,14,（二）封闭群的特征及应用1封闭群动物的遗传组成具有很高的杂合性，

6、在遗传学上可作为选择实验的基础群体，用于某些性状遗传的研究。用于药物筛选和毒性试验等。2封闭群动物具有较强的繁殖力和生活力，表现为每胎产仔多，胎间隔短，仔鼠死亡率低等、生长快、成熟早、对疾病抵抗力强、寿命长、生产成本低优点。因而广泛应用于预实验、学生教学等实验中。3突变种所携带的突变基因通常导致动物在某些方面的异常，从而可成为生理学、胚胎学和医学研究的模型。,15,（三）杂交一代动物的特征及应用 1遗传和表型上的一致性 2杂交优势 3杂合的遗传组成 4作为某些疾病研究的模型,16,一、微生物和寄生虫感染的危害性 1影响实验结果 实验动物的微生物和寄生虫感染可不同程度干扰实验结果，从而影响研究工

7、作的准确性和可靠性，甚至得出错误的结论。隐性感染常导致动物生理生化指标的改变，使实验得不到应有的结果。或因实验处置，动物抵抗力下降，使隐性感染显性化，导致疾病的发生。,第二节 实验动物微生物与寄生虫学 质量控制,17,2影响动物生产 某些烈性传染病如鼠痘、兔出血症、犬细小病毒性肠炎等的流行，可导致动物大批死亡或质量下降，从而给动物的生产和实验的正常进行带来严重影响。3威胁人类健康 许多人兽共患性疾病对饲养和研究人员的健康构成威胁。特别是那些在动物呈隐性感染、而对人类呈致死性感染的病原微生物（如流行性出血热病毒），应引起我们高度重视。4污染实验材料 如病原微生物污染了细胞培养物、肿瘤移植物或以动

8、物组织和细胞为生产原料的生物制品，不仅干扰实验，而且还可将病原扩散，以至危害人类的健康。,18,5.实验动物感染寄生虫后不仅虫体对机体造成一定的损害，而且动物机体也对虫体产生反应，使动物机体的生理、生化及免疫学指标发生改变，从而影响实验结果。1）掠夺宿主的营养：2）体外寄生虫对动物的骚扰：3）对宿主机体产生机械性损伤：4）对宿主产生毒性作用：5）对宿主生理、生化和免疫系统的影响。,19,二、实验动物常见感染性疾病 重要的人兽共患病 主要的烈性传染病 常见的微生物和寄生虫感染,20,1、重要的人兽共患病（1） 流行性出血热（2） 弓形虫病（3） 淋巴细胞脉络从脑膜炎（4） 沙门菌病（5） 狂犬病

9、（6） 猴B病毒感染（7） 猴结核病,21,22,2、主要的烈性传染病（1）鼠痘（2）兔出血症（兔瘟）,23,3、常见的微生物和寄生虫感染（1）鼠肝炎病毒感染（2）仙台病毒感染（3）鼠肺支原体病（4）嗜肺巴斯德杆菌病（5）小鼠呼肠孤3型病毒感染（6）球虫病（7）犬细小病毒感染（8）犬瘟热,24,三、实验动物的微生物和寄生虫控制国家标准 不同等级啮齿类、兔、犬和猴等实验动物要求排除的细菌、病毒应根据国家技术监督局制定的有关实验动物微生物学等级及监测标准(GB14922.22001)。有关实验动物寄生虫学等级及监测标准是(GB14922.12001) 。,25,26,27,28,四、实验动物的微生

10、物学和寄生虫学质量监测 （一）监测的意义 实施微生物学与寄生虫学监测，是保证实验动物质量及标准化的必要手段。通过监测可掌握动物群中病毒、细菌、寄生虫的流行情况，及时诊断感染性疾病，发现并控制其传播，以保证实验动物的健康。 （二）监测的内容 不同级别实验动物的微生物和寄生虫监测内容不同。国家技术监督局制定了标准(GBl4922.12001和GBl4922.22001) 。 （三）检验方法 目前国标推荐使用的方法学和详细检验程序。病原菌以分离培养鉴定为主，病毒以检测抗体为主，寄生虫以镜检为主。,29,实验动物微生物及寄生虫监测,监测程序：1. 微生物检测程序 分离血清，检查病 毒抗体或其它病原的抗

11、体 气管分泌物，肠内容物 脏器分离细菌 真菌检查,动物,编号,外观检查,麻醉,皮肤取样,取血,无菌解剖,检测,检测报告,（四）检验程序,30,2. 寄生虫检测程序 弓形虫检测 体外寄生虫检测 体内寄生虫检测 体外寄生虫检测,动物,编号,外观检查,麻醉,拔毛或梳毛,取血,挤压或刀片刮取皮层物取样,检测,检测报告,解剖、脏器、肠内容物、粪便取样,31,取样要求与监测规则：1. 普通动物、清洁级动物和无特定病原体动物 每三个月至少检测一次。2. 无菌动物每年至少检测一次。3. 每2-4周检测一次粪便标本。,32,实验动物不同生产繁殖单元取样数量,取样应在每一生产繁殖单元的不同方位（如四角和中央）选取

12、动物。动物的送检容器应按动物级别要求编号和标记，包装好后安全送达检测实验室，并附送检测单，写明送检动物的品种品系、级别、数量和检测项目。,33,检测项目的分类国标对必须检测和必要时检测作了限定性说明：“必须检测项目：是指在进行实验动物质量评价时必须检测的项目。必要时检测项目：是指从国外引进实验动物时、怀疑有本病流行时、申请实验动物生产许可证和实验动物质量合格证时必须检测的项目”。,34,监测方法：1. 实验动物病毒检测：1）血清学诊断：血凝抑制试验（HI）；酶联免疫吸附试验（ELISA）。2）病原学检查：接种细胞培养物观察CPE出现（鼠痘、鼠肝炎）；血吸附试验（仙台病毒）；免疫酶试验（LCM病

13、毒）。连续三次传代未有病毒迹象为阴性。接种敏感动物，观察发病、抗体产生、病理改变、接种动物病毒再分离。动物组织细胞传代培养。,35,3）病毒颗粒、抗原和核酸的检出光镜检查病理改变或包涵体的存在。电镜检查组织内或排泄物中的病毒颗粒。PAGE、PCR检查病毒核酸。免疫法检查组织内、排泄物中的病毒抗原。,36,2. 实验动物细菌检测：1）正常动物主要取气管或鼻咽分泌物和盲肠内容物作细菌培养。2）发病动物对发生病变的各组织和脏器做细菌检查。3）细菌监测多采用病原学方法。,37,3. 实验动物寄生虫检测：1）体内寄生虫检查直接涂片：适于肠道蠕虫虫卵、肠道原虫及血液内寄生虫。虫卵收集：饱和生理盐水漂浮；沉

14、淀集卵，用于吸虫卵；透明胶纸粘取，用于蛲虫虫卵；尿液检查，用于鼠膀胱线虫卵；尸体剖检。2）体外寄生虫检查被毛检查透明胶纸粘取皮刮取法,38,（五）报告 规定了实验动物质量判定原则，即：经检测，如有一只动物的一项指标不符合该级别标准要求，则判为不符合该级别标准。根据检验结果，由检验人员及其负责人签发检测报告。,39,第三节 实验动物遗传学质量控制,实验动物的遗传质量控制主要包括两个方面内容，一是科学地进行引种、繁殖和生产，即对生产过程进行控制；二是建立定期的遗传监测制度，对产品的质量进行控制。遗传质量控制的重点是近交系和封闭群动物。 遗传监测的目的是为了证实各品系应具有的遗传特性，以及是否发生遗

15、传突变和遗传污染等，以确保被监测的样品符合该品系的要求。 实验动物遗传质量监测应作为常规工作，在某种程度上讲，实验动物遗传质量比微生物质量对动物实验结果的影响更大。,40,遗传是会发生改变的,我们为什么长的不同呢？,41,一、遗传改变的原因1、近交系遗传改变的原因残余的杂合性，尽管我们采用严格的兄妹交配，20代后还是存在1.4的残余杂合性，杂合子个体在受精率、繁殖率和生活力上均远远超过纯合子遗传型个体，其在群体中地扩散引起群体遗传变异。,1.4,42,人为失误造成外来的基因组杂交成一个近交系，产生遗传污染 可以避免染色体片段存在重复，缺失，易位，倒位，基因位点存在突变，若这些变异在繁育过程中固

16、定下来，会引起群体遗传改变。（染色体结构的改变）,43,遗传突变，来自DNA序列的变化，这种变化可能是某核苷酸碱基的置换、缺失或插入。（是在基因水平上遗传物质中任何可检测的能遗传的改变）各种品系分布到各地长期隔离繁育，造成品系特性发生很大变异,44,2、封闭群（远交群）遗传改变的原因 最主要的是选择压 同近交系一样，遗传污染和基因突变都能造成远交群的遗传差异，但远交群等位基因分布改变的主要原因在于选择。 原因：理论上要保持一个远交群所有基因频率的相对比例没有变化，最恰当的核心繁育群应有1000个动物。,45,但事实上我们不可能做到这一点，特别是近代，人们为了控制微生物污染，采用剖腹产和悉生生物

17、学技术定期地重建新的群体。在重建过程中，群体骤然变小，近交系数必将上升，因而导致杂合性下降，这也意味着某些基因被固定下来。在不同的单位这种对位点的不同固定，往往导致了同一品种动物等位基因分布的改变。,无主观意识的定向选择,46,二、实验动物的繁殖方法 （一）近交系动物的繁殖方法 1、引 种：引种动物应来自近交系的基础群 2、基础群：目的是保持近交系自身的传代 繁衍和 提供种源 3、血缘扩大群：种动物来自基础群 4、生产群：目的是生产供应动物，种子来 自基础群或血缘扩大群,47,（二）封闭群动物的繁殖方法1、引种：引种动物数量要足够多，小型啮齿类动 物引种数目一般不少于25对。2、繁殖：封闭群应

18、足够大，尽量避免近亲交配。,48,近交系动物国际命名的规则是根据动物在来源、历史和培育经过而命名的。除一些历史较长已经广泛使用并获得认可的品系外，近交系、亚系和支系的命名按下面原则进行。 1、普通近交系的命名 (1)一般均用1至4个大写英文字母表示。如A BA AKR STAR (2)有些品系可由大写英文字母为首，结合数字加以命名。如C3H C57BL (3)非正规的命名，如果已为国际广泛认同者，可保留沿用，如129、6l5等， (4)近交代数表示，一般在品系符号后括号里写上代数，并在代数前加写“F”如A(F78)。 (5)品系命名符号书写要全，应使用公布的全称，不能随便缩写，尤其写论文报告，

19、在材料方法里一定要把品系命名符号写全。例如C57这个缩写意味着七、八个特征不同的品系；只写C57BL也包括C57BL/1、C57BL/6J、C57BL/6N C57BL/10J等特征不同的亚系。,（三）实验动物命名,49,2、重组近交系的命名重组近交系的命名是在两个祖系名称缩写中间加大写字母X。同一系列中不同的近交系可在其后顺加连字号，再加数字表示。例如AKR和C57BL/10杂交培养的一系列重组近交系可命名为AKXB3、亚系的命名方法是在原品系的名称后加一道斜线，斜线后标明亚系的符号，如DBA/2、C57BL/6J 等。有些近交系的不同亚系之间遗传差异较大，对实验处理的反应不同，在实验报告或

20、论文中应注明所使用的亚系名称。,50,4、封闭群的命名 封闭群由24个大写英文字母命名，种群名称前标明保持者的英文缩写名称，第一个字母须大写，后面的字母小写，一般不超过4个字母。保持者与种群名称之间用冒号分开。例如：N:NIH表示由美国国立卫生研究院（N）保持的NIH封闭群小鼠。 某些命名较早，又广为人知的封闭群动物，名称与上述规则不一致时，仍可沿用其原来的名称。如：Wistar大鼠，日本的ddy小鼠等。,51,三、实验动物遗传学质量监测 (一)检测目的 是检查是否发生遗传变异、是否混入其它动物血缘或发生了错误的交配等，以确保检测群体符合该遗传群体的要求。,52,(二)实验动物遗传学监测的一般

21、性原则 1.整体性原则 2.必要性原则 3.连续性原则,53,四、实验动物遗传质量监测国家标准基本内容（一）主题内容与适用范围（二）实验动物的遗传分类及命名（三）实验动物的繁殖方法 （四）近交系动物的遗传质量监测,54,五、实验动物遗传学监测的常用技术方法（一）近交系动物的遗传质量检测原理：由一个基因和多个基因决定的任何特征都能用来检测一个品系。1.生化标志基因(Biochemical markers) 检测法 近交系小鼠生化基因位点有13个，近交系大鼠的生化基因位点有9个。2.免疫标志（Immunogenetic markers）检测法 （1）皮肤移植法（Skin grafting） （2）

22、混合淋巴细胞反应法 （3）血清学反应法 （4）肿瘤移植法,55,3形态学标记（Extermal manifestations）检测法（1）毛色基因测试（Coat color gene testing） （2）下颌骨分析 4.细胞遗传学标记（Cytogenetic markers）检测法5.分子生物学标记（DNA markers）检测法（1）限制性酶切片段长度多态性（RFLP）（2）DNA指纹（3）微卫星DNA的多态性（4）小卫星DNA（5）随机扩增多态性DNA（RAPD）（6）单核苷酸多态性（SNP）,56,57,形态学方法,1.毛色基因检测 遗传群体发生遗传变异有时产生明显可见的表型特征。,

23、58,近交系的毛色基因,* A-野生色、 aa非野生色 、Aw-白腹野生色 、B-黑色、 bb褐色、 C-有色 、 cch 青紫兰色、cc白化、 D-深色 、dd 淡色 、In-铅灰、 in黑灰、 S-无色斑、 ss有色斑。,许多遗传变异并不涉及毛色的变化，现已很少用,59,2.下颌骨形态分析法 动物的骨骼形态具有高度的遗传性，而各种骨骼的形态、大小及其出现的差异均可作为鉴定品系的方法。,下颌骨形态分析图,1972，英国实验动物中心Festing提出,60,近交系动物遗传监测的免疫学方法,在同一物种的不同个体之间，细胞膜表面抗原、免疫球蛋白和其它血清蛋白存在着不同类型，称为同种异型，从而成为同

24、种异型抗原。同种异型是由遗传基因决定的，因此而被选择作为遗传监测的标记。微量细胞毒法是根据特异性抗体与细胞表面的同种异型抗原结合，在存在适当的补体时，能杀死细胞的原理而进行的测试方法。皮肤移植试验的原理是由于个体间组织相容性抗原不同，受体对供体的组织细胞产生免疫排斥，导致植物坏死。,61,免疫标记探测法,1.皮肤移植，主要用于探测组织相容性基因的差异，它是一个敏感、使用广泛的方法，以尾部皮肤移植法为好,62,小鼠组织相容性位点的分布,63,2.红细胞凝集试验（检测红细胞抗原和某些H-2抗原）3.细胞毒试验（检测H-2抗原、Ia抗原和白细胞抗原）,其它免疫学方法,64,生化标记法,依据生化基因的

25、产物（绝大多数是异构蛋白和酶）在特定电场内携带的电荷不同，采用电泳的方法将它们区分，这些电泳带型称之为生化基因标记。我们可以根据电泳带型即蛋白质的表现型推断被检测小鼠的基因型，建立各种近交系的遗传概貌，定期对它们进行遗传监测。,常规遗传监测中的首选方法,65,66,K：肾脏e：溶血素或红细胞 l：肝脏s：脾脏 p,67,限制性片段长度多态性DNA( RFLP)随机扩增多态性DNA(RAPD)微卫星DNA标记线粒体DNA (mtDNA) 多态性单核苷酸多态性分析(SNPs) 基因芯片分析,分子生物学遗传监测方法,68,分子标记相对于传统的生化标记具有操作简便,多态性丰富等优点, 如何推动高效的遗

26、传多态性检测手段应用于实验动物管理中去,是我们实验动物学工作者应该思考的问题。,69,（二）封闭群实验动物遗传检测 1、目的：对封闭群动物的遗传检测，就是对动物群体的遗传结构进行分析。其目的是通过遗传分析了解动物群体的遗传概貌，得知不同种动物间或动物不同群体间的遗传差异、遗传距离、在进化中的关系等。它对动物的分类，品系资源的保存、开发和利用，对动物的选种、选育具有指导意义。还可确保群体的杂合性和基因库的完整。需计算基因频率 2、方法： （1）生化标记检测 通过计算基因频率来了解基因平衡 状态。 （2）染色体标记检测 了解一些染色体的带型多态性。 （3）形态学 进行下颌骨形态的多变量分析。,70

27、,六、遗传质量标准1 近交系动物的遗传质量标准近交系动物必须符合以下要求：(1）具有明确的品系背景资料，包括品系名称、近交代数、遗传组成、主要生物学特性等，并能充分表明新培育的或引种的近交系动物符合近交系定义的规定。 (2）用于近交系保种及生产的繁殖系谱及记录卡应清楚完整，繁殖方法科学合理。(3）经遗传检测（生化标记基因检测法，皮肤移植法，免疫标记基因检测法等）质量合格。,71,2 封闭群动物的遗传质量标准由于封闭群动物的遗传组成不如近交系稳定，目前尚没有统一的质量标准，但基本要求如下：(1）作为繁殖用原种的封闭群动物必须遗传背景明确，来源清楚，有较完整的资料（包括种群名称、来源、遗传基因特点及主要生物学特性等）。(2）保持封闭群条件，无选择，以非近亲交配方式进行繁殖，每代近交系数上升不超过1。(3）具有一定的种群规模，保持封闭群的主要生物学特性。,72,思考题：1、实验动物微生物与寄生虫检测的程序？ 2、根据微生物和寄生虫控制我国实验动物分为哪几个等级？ 3实验动物按遗传学是如何分类的？4简述实验动物（近交系、亚系、封闭群、杂交群）命名原则是什么？5为什么要进行实验动物的遗传监测？遗传监测的方法主要有哪些？,