转录产物的加工ppt课件.ppt

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1、第 8 章转录产物的加工,基因转录的直接产物即初级转录物通常是没有功能的，必须经历转录后加工才会转变为有活性的成熟RNA分子。 转录产物的加工是基因表达的一个重要环节 核酶就是在研究转录产物加工时发现的。 参与转录产物加工的小RNA，及其与蛋白质的复合物RNP如何影响某些基因的表达和细胞的功能，有无可能用此途径控制疾病，,加工是必要的吗？,8.1 原核生物RNA的转录后加工 在原核生物中，rRNA的基因与某些tRNA的基因组成混合操纵子，其余tRNA基因也成簇存在，并与编码蛋白质的基因组成操纵子。它们在形成多顺反子转录物后，经切割成为rRNA和tRNA的前体，然后进一步加工成熟。除了少数例外，

2、原核生物的mRNA一经转录，通常都立即进行翻译，一般不进行转录后的加工。,8.1.1 原核生物tRNA前体的加工 原核生物的tRNA基因以多顺反子(poly-cistron)的形式被转录，转录产物都是很长的前体分子。通常由多个相同tRNA基因或不同的tRNA串联排列，或与rRNA的基因，或与编码蛋白质的基因组成混合转录单位。tRNA前体必须经过切割和核苷酸的修饰，才能成为有功能的成熟分子。,8.1.1.1 tRNA 3-端的成熟 tRNA前体分子的3-端是在多种RNase的共同参与下逐步加工成熟的，在离体条件下，这些酶是RNase P、RNase F、RNase D、RNase BN、RNas

3、e T、RNase PH、RNase II和多核苷酸磷酸化酶(polynucleotide, PNPase)。 (1) 切割 首先由内切核酸酶RNase P将tRNA前体分子水解成为3-端和5-端仍含有额外核苷酸的tRNA片段，随后，由内切核酸酶RNase F对tRNA前体靠近3-端处进行逐步切割。研究发现，RNase PH和RNase T对tRNA前体分子3-端的正确剪接和成熟十分重要。 (2) 修剪 外切核酸酶RNase D从前体3-端再逐个切去附加序列，这个酶具有严格的选择性，它能识别整个tRNA分子的结构，是tRNA的3-端成熟酶。,(3) 添加3-端CCA 已知所有成熟tRNA分子的

4、3-端都有CCA-OH结构，这是氨基酸接受部位的特有结构。细菌有两类不同的tRNA前体，I型前体分子的附加序列被切除后，即显露出自身所具有的3-端CCA-OH结构。II型前体分子自身没有3-端的CCA结构，其成熟分子的CCA-OH结构是在切除3-端附加序列后，在tRNA核苷酰转移酶的作用下，逐个添加上去的。 tRNA + CTP tRNA-C + PPi tRNA-C + CTP tRNA-CC + PPi tRNA-CC + ATP tRNA-CCA-OH + PPi,8.1.1.2 tRNA分子5-端的成熟 由RNaseIII水解生成的tRNA片段，其5-端仍含有额外的核苷酸，这些额外的核

5、苷酸由RNase P催化切除。来自细菌和真核细胞细胞核的RNase P结构非常类似，都含有RNA和蛋白质，体外实验发现Ml RNA单独存在时，也有一定的催化活性。tRNA前体分子的5-端一般都有约40nt的前导序列，可以形成RNase P能够识别的茎环二级结构，使RNase P能将tRNA前体5-端额外的核苷酸逐个切除。8.1.1.3 核苷酸的修饰 成熟的tRNA分子中存在着许多的修饰碱基等成分，包括各种甲基化碱基和假尿嘧啶核苷。tRNA修饰酶具有高度特异性，每一种修饰核苷都有催化其生成的修饰酶。tRNA甲基化酶对碱基及tRNA序列均有严格要求，甲基供体一般为S-腺苷甲硫氨酸。 tRNA分子中

6、的假尿嘧啶核苷合成酶催化尿苷的糖苷键转移，由尿嘧啶的N1变为C5。,8.1.2 原核生物rRNA前体的加工 E.coli有rrnArrnG共7个rRNA转录单位分散在基因组中，每个转录单位由16S rRNA、23S rRNA、5S rRNA以及tRNA的基因组成。它们在染色体上并不紧密连锁，但每个rRNA的排列和序列十分保守。tRNA基因在操纵子中的数量、种类和位置都不固定，或在16S rRNA和23S rRNA之间的间隔序列中，或在5S rRNA的3-端之后。所有的转录单位都含有两个启动子，P1在16S rRNA基因的转录起点上游150300bp处，P2在P1下游110bp处。,原核生物rR

7、NA前体的加工,rRNA基因的初级转录物为30S的 rRNA前体分子，其Mr为2.1106，约6500nt，5-端为pppA。由于原核生物rRNA前体的加工一般与转录同时进行，因此不易得到完整的前体。rRNA前体的加工主要由RNase III负责，从RNase III缺陷型的E.coli中可分离得到30S rRNA前体(P30)。RNase III是一种负责RNA加工的内切核酸酶，它的识别部位是特定的RNA双螺旋区。比较不同rRNA前体分子序列时发现，其间隔序列很相似，且23S rRNA和16S rRNA各自的5-端与3-端可形成茎环结构。RNase III在茎部错位两个2bp的位点切割，产生

8、16S rRNA的前体P16(17S)，和23S rRNA的前体P23(25S)。5S rRNA的前体P5在RNase E作用下产生，RNase E可识别P5两端形成的茎环结构。随后，P5、P16和P23两端的多余序列需被核酸酶切除。,图8-1为原核生物rRNA前体加工的示意图，图中1所指的是RNase III的水解位置，2所指的是RNase P的水解位置，3所指的是RNase E的水解位置。,前体rRNA的加工过程, 转录产物内部碱基配对折叠形成茎环结构茎环结构与蛋白复合，形成 RNPs特定碱基的甲基化(S-腺苷甲硫氨酸，SAM)酶的剪切，首先 RNase剪切释放出16S、23S前体分子，

9、RNaseE剪切释放出5S前体分子；随后 RNase M16、M23 、 M5分别在其前体分子末端进一步剪切，最终释放成熟的rRNA分子,8.1.3 原核生物mRNA前体的加工 细菌的转录和翻译不存在时空间隔，mRNA的初始转录产物一般不需要加工，在转录的同时即可翻译。多顺反子的mRNA可被翻译成多聚蛋白质，再切割成不同的蛋白质分子， 少数多顺反子mRNA需通过内切核酸酶切成较小的单位后才进行翻译。例如，E.coli位于8990位置的一个操纵子含有rp1J(编码核糖体大亚基蛋白L10)、 rplL(编码核糖体大亚基蛋白L7/L12)、rpoB(编码 RNA pol 亚基）和rpoC (编码 R

10、NA pol 亚基)4个基因，在转录出多顺反子mRNA前体后，由 RNase III将核糖体蛋白与RNA pol亚基的mRNA切开，各产生两个成熟的mRNA，之后再各自进行翻译。?,某些噬菌体多顺反子mRNA也有类似的加工过程，如大肠杆菌T7噬菌体早期转录区的6个基因，转录生成一条多顺反子的mRNA前体，前体分子内每个mRNA之间分别形成茎环结构。由RNase III对茎结构内不配对的小突环进行酶切，将前体分子酶切成为6个成熟的mRNA，再进行各自的翻译。研究发现，这种由茎环结构调控的RNA加工有一定的普遍性。,8.2 真核生物tRNA前体的转录后加工8.2.1 真核生物tRNA前体的结构特点

11、 真核生物tRNA基因的结构与原核生物有两个较大的差异。 (1) 基因排列 tRNA基因数目比原核生物多，E.coil约有60个tRNA基因，果蝇有750个，酵母有320400个，爪蟾约8000个。真核生物的tRNA基因成簇排列，基因之间有一定间隔。各tRNA基因作为独立单位转录， tRNA前体是单顺反子的。 (2) 内含子结构 真核生物tRNA基因有内含子，其前体必须经过剪接。内含子的特点是： 长度和序列没有共同性，1646个核苷酸。 位于反密码子的下游(即在3-端一侧)。 内含子和外显子间的边界没有保守序列，其内含子的剪接方式不符合一般规律。真核生物tRNA前体中内含子的精确切除信号是tR

12、NA分子高度保守的二级结构，而不是内含子的保守序列，剪接需要RNase的参与。,8.2.2 内含子的剪接 tRNA内切核酸酶切割前体分子中的内含子； RNA连接酶将两个半分子连接在一起。又称为tRNA的半分子，是剪切的中间产物。,3-端切点生成2, 3-环磷酸5-端切点生成-OH基，由于3-端的末端结构特殊，不能直接连接，需在环磷酸二酯酶作用下，使2, 3-环磷酸水解，形成3-OH和2-磷酸基。3-端半分子的5-OH在多核苷酸激酶催化下磷酸化，才能进行连接反应。在连接过程中，首先由ATP通过形成连接酶-AMP共价中间物将连接酶激活，然后，将两个外显子通过3, 5 -磷酸二酯键连接起来。多余的2

13、-磷酸由磷酸酶水解除去。,8.2.3 在3-端添加-CCA 真核生物中所有tRNA前体分子均缺乏3-端的-CCAOH结构，必须在tRNA核苷酸转移酶催化下，由CTP和ATP提供胞苷酸和腺苷酸，添加3-端的-CCAOH结构。,8.2.4 核苷酸的修饰 tRNA分子中稀有核苷酸很多，有多种酶参与tRNA分子核苷酸修饰，主要是多种tRNA甲基化酶，催化tRNA分子特定位置上的甲基化，例如A m7A，G55 m7G55等。此外还有一些其它类型的酶，如催化合成tRNA2-异戊烯的tRNA异戊烯转移酶，催化S4U以及含硫嘧啶化合物合成的tRNA硫转移酶等。,真核生物的tRNA加工,酵母tRNATyr加工为

14、例转录产物前体具有特征 茎环结构的二级结构RNAaseP D内切酶识别二级结构，并切除5端16nt前导区和3 端额外的2nt, tRNA核苷酸转移酶将5- CCA-3序列添加到3端， 形成成熟的3端内切酶切除14nt的内含子，再将两分子片段连接,8.3 真核生物rRNA前体的转录后加工8.3.1 rRNA基因的结构 rRNA基因在基因组内成串重复数百次，转录区与非转录区交替 每个rRNA基因由16S18S, 5.8S和26S28S rRNA基因组成一个转录单位，彼此被间隔区分开，经RNA pol I转录产生一个长的rRNA前体。 哺乳类动物的18S、5.8S和28S rRNA基因转录产生45S

15、 rRNA前体 酵母的17S、5.8S和26S rRNA基因的转录产物为37S的rRNA前体。,新手产物 新生的rRNA前体与蛋白质结合，形成巨大的前体核糖核蛋白(pre-rRNP)颗粒。 剪切过程 核仁、多个步骤 无内含子 大多数真核生物rRNA基因 有些rRNA基因有内含子，但转录产物中的内含子可自体催化切除，或不转录内含子序列。例如，果蝇的285个rRNA基因中有约1/3含有内含子，但都不转录。四膜虫(Tetrahymena)的核rRNA基因和酵母线粒体的rRNA基因含有内含子，它们的转录产物可自体催化切除内含子序列。 机制: snoRNA指导的核苷酸修饰，以及snoRNA与rRNA前体

16、形成的特定立体结构为参与切割的RNase提供了识别位点。,8.3.2 rRNA前体的核苷酸修饰 8.3.2.1 snoRNA的结构 已发现上百种snoRNA存在于核仁内，长约87275nt，能与核仁纤维蛋白或自身免疫抗原等结合，生成核仁小分子核糖核蛋白体(snoRNP)。snoRNP可指导rRNA中核糖和碱基的修饰，参与rRNA前体的剪切。 在指导核苷酸修饰的过程中，snoRNA分子内与rRNA互补的序列片段，以高密集的方式复盖于rRNA分子的保守区域上。新生的rRNA被加工修饰以后，在RNA解旋酶作用下，snoRNA从rRNA解离下来，再与新生的rRNA前体结合，周而复始地参与rRNA前体的

17、加工，其作用具有分子伴侣的特征。 snoRNA分为两类。一类是C盒/D盒snoRNA，可借助互补序列识别rRNA前体中进行甲基化和切割的位点，C盒的序列为UGAUGA，D盒为CUGA。另一类是H盒/ACA盒snoRNA，含H盒(ANANNA)和ACA盒，能识别假尿苷酸()化位点。,8.3.2.2 rRNA前体的甲基化 C盒/D盒snoRNA与 rRNA前体的甲基化位点具有互补序列，其中的C盒参与甲基的转移反应，所以，C盒/D盒snoRNA又称为指导甲基化的snoRNA。 甲基化位置主要在核糖2-羟基上。来自人HeLa细胞的rRNA前体分子中有约110个甲基化位点，其中绝大多数在核糖的2-羟基上

18、。研究发现，这些甲基化位点在刚转录后就已存在于rRNA前体分子中，但在非编码区域则没有任何甲基化位点。 与原核生物类似的是，真核生物rRNA前体也是先甲基化后切割。一旦45S rRNA前体分子被转录产生，就会很快与snoRNP结合，开始进行甲基化修饰。rRNA的甲基化可能是剪接加工的信号，使RNase能够确认rRNA前体中的哪些序列要被删除，哪些序列需要保留。,8.3.2.3 rRNA前体假尿苷酸的生成 酵母rRNA中有43个假尿苷酸残基，依赖于snoRNA才能精确加工。H盒/ACA盒snoRNA能形成茎环二级结构，有多处能与rRNA的假尿苷酸化位点互补。H盒和ACA盒虽然不在双链区，但有研究

19、表明，假尿苷酸化位点与ACA盒之间有确定的距离，这一机制对假尿苷酸化位点的确定有重要意义(图8-6b)。,8.3.3 rRNA前体的剪切 在不同的真核生物中，rRNA前体的每个转录单位内各rRNA的排列顺序和加工过程都十分相似。由于rRNA加工速度较慢，若用同位素3H或14C-尿苷标记HeLa细胞的RNA，可以分离得到45S rRNA前体，以及41S、32S、20S等加工产物。通过标记动力学实验证明它们是rRNA生成过程中的前体和中间物。 不同真核生物rRNA前体的大小和加工过程略有不同，但其主要步骤是相同的。,(1) 在snoRNA指导下对45S的rRNA前体进行核苷酸修饰。 (2) 切除5

20、-端的非编码序列，生成41S中间产物。 (3) 41S的RNA被切割为两段，一段为32S，含有28S rRNA和5.8S rRNA。另一段为20S，含有18S rRNA。 (4) 通过剪切和修剪，将32S片段加工成28S rRNA和5.8S rRNA，将20S片段加工成18S rRNA。 (5) 5.8S rRNA与28S rRNA的部分序列相互配对，形成核糖体大亚基的rRNA 复合物。,8.4 真核生物mRNA前体的加工 hnRNA须在细胞核中经过复杂的加工过程，才被转移到细胞质中行使功能。8.4.1 形成5-端帽子结构8.4.1.1 帽子结构的类型 真核生物的hnRNA和绝大多数成熟mRN

21、A的5-端，都含有以7-甲基鸟苷为末端的帽子结构，G与mRNA链上的核苷酸方向相反，像一顶帽子倒扣在mRNA连上，因此而得名。有3种帽子结构形式，帽子0没有2-甲基-核苷酸，帽子1末端的第一个核苷酸为2-甲基-核苷酸，帽子2末端的第一个和第二个核苷酸为2-甲基-核苷酸(图8-8a)。,8.4.1.2 帽子结构的形成 已知在转录的初始产物中，在5-端都有三个磷酸基团(位、位和位)，5-帽子结构就是在此位置上逐步形成的， (1) 核苷酸磷酸水解酶从生长着的RNA 5-端切去磷酸基团。 (2) 鸟苷酸转移酶催化一分子游离GTP的位磷酸基攻击RNA5-端的位磷酸基，形成5, 5-三磷酸的连接，封闭了R

22、NA的5-端。 (3) 由鸟苷酸-7-甲基转移酶催化，将SAM的活性甲基转移到鸟嘌呤的N7位，形成帽子0。 (4) 由2-O-甲基转移酶催化，将SAM的活性甲基转移到mRNA 5-端第一个核苷酸的2-OH上，形成帽子1。再转移一个甲基到mRNA 5-端第二个核苷酸的2-OH上，形成帽子2(图8-8b)。,RNA pol II CTD的磷酸化与加尾和加帽反应的关系,8.4.1.3 帽子结构的功能 (1) 对mRNA的保护作用 细胞中有许多能够水解mRNA的核酸酶，如果没有5-端帽子结构，有可能在mRNA还未完全转录就被降解了。 (2) 对翻译的促进作用 真核生物合成蛋白质时，有一种起始因子能够识

23、别5-端帽子结构，称帽子结合蛋白，使mRNA能与核糖体小亚基结合起始翻译。如果没有帽子结构，mRNA的翻译能力就下降或消失。用化学方法除去5-端的m7G后，mRNA的模板活性立即消失。 (3) 促进mRNA的输送 5-端帽子结构有利于成熟的mRNA从细胞核输送到细胞质。 U6snRNA由RNA pol III转录，缺乏5-帽子结构，仍保持着转录起始时形成的5-三磷酸末端，因而被留在细胞核内，不能进入细胞质。 此外，帽子结构可能有助于mRNA前体的正确拼接。,8.4.2 形成3-端的多聚腺苷酸8.4.2.1 3-端多聚腺苷酸的特点 除了组蛋白的mRNA以外，真核生物mRNA的3-端都有polyA

24、序列，其长度一般为40200nt。 RNA的3-端加入polyA的过程称为3-端多聚腺苷酸化。转录产物3-端加上polyA的位置称为polyA位点。,8.4.2.2 3-端多聚腺苷酸的形成 polyA不是由转录产生的，因为在真核生物基因组中没有任何一个基因有一长段T序列能作为polyA的转录模板。研究发现，放线菌素D(actinomycin D)能抑制转录反应，但不抑制polyA化。polyA序列是在转录以后，由细胞核内的polyA聚合酶催化mRNA前体的3-端逐个添加A，即在细胞核中的hnRNA阶段就已经加上了polyA。,精确 与加尾有关的最重要的顺式元件为一段保守的六聚核苷酸序列，其一致

25、序列为 AAUAAA。 动物细胞有一段富含U/GU的序列，还可能有一段富含U的序列，前者位于加尾点的下游，后者位于AAUAAA的上游。 酵母的mRNA在AAUAAA序列的上游，还有一段六聚核苷酸序列，其一致序列为UAUAUA 植物mRNA在AAUAAA信号的上游有一段富含U的序列。,3端加尾,多聚腺苷酸尾巴,AAUAAA：准确切割加poly（A）,参与加尾反应的反式因子包括： 剪切/多聚腺苷酸化特异性因子(CPSF) 特异性识别和结合AAUAAA序列，并参与和poly A聚合酶以及剪切刺激因子的相互作用。 剪切刺激因子(CstF)也是一种RNA结合蛋白，可识别U/GU序列并与CPSF结合。 剪

26、切因子I和II (CFI/CFII)为核酸内切酶，负责剪切反应。 Poly A聚合酶(PAP)是一种特殊的RNA聚合酶，不需要DNA模板，而且只对ATP有亲和性，负责催化在切开的mRNA的3-羟基上连续添加多聚腺苷酸序列。 PolyA结合蛋白PABP)与新生的poly A结合，能够提高PAP的聚合反应的连续性，加速 poly A的延伸，对PolyA具有保护作用，还能控制PolyA的长度。,3-端PolyA形成的过程首先CPSF识别和结合AAUAAA序列，接着是CFI/CFII，随后CstF和PAP依次被招募到复合物上。在CFI/CFII的催化下，mRNA前体在AAUAAA序列下游1030nt的

27、位置被切开，PAP催化在新暴露的3-羟基进行多聚腺苷酸化反应。一开始多聚腺苷酸化反应进行得很慢，但在CFI/CFII，CstF和被切割的mRNA前体的3-端序列脱离以后，PABP与已形成的polyA结合，导致多聚腺苷酸化反应加快，使polyA快速延长到合适的长度。,加尾过程 特定的蛋白因子识别信号序列后，结合前体mRNA上，组装成复合体内切酶CF (cleavage factor)在AAUAAA下游1120 nt 的特定位点对前体mRNA进行剪切;聚腺苷酸聚合酶PAP在3端添加多至250个A残基 PABP 结合到poly(A),8.4.2.3 PolyA尾巴的功能 (1) 提高mRNA的稳定性

28、 polyA尾巴在与PABP结合以后，可保护mRNA免受3-核酸外切酶的降解。已有证据表明，当一种mRNA的尾巴长度降到一个临界值，常常被作为mRNA降解的信号。控制其mRNA尾巴的长度来调控某些基因的表达。 (2) 提高mRNA翻译的效率 poly A+ mRNA的半寿期比polyAmRNA长有关，但更重要的是poly A提高了mRNA的翻译效率。翻译时，PABP I与mRNA结合，促进了mRNA的翻译，而polyAmRNA因为不能与PABP I结合，所以不能有效翻译。 poly A可以使带有帽子结构的mRNA翻译效率提高21倍，而帽子结构可以使poly A+ mRNA的翻译效率提高297倍

29、。 不过，某些mRNA虽然没有poly A尾巴，但仍然能够被有效地翻译，比如组蛋白的mRNA,(3) 影响最后一个内含子的切除 PolyA和帽子结构都参与了mRNA的拼接，二者均可以促进与其最近的内含子的拼接。 (4) 参与基因表达调控 许多mRNA前体的3-端含有不止一个拷贝的AAUAAA序列，利用不同的加尾信号进行加尾反应，可形成不同长度的mRNA，合成不同的蛋白质。某些先天缺乏终止密码子的mRNA，通过加尾反应可形成终止密码子。 此外，可用含有oligo dT或oligo U的亲和层析柱或磁珠，将mRNA与其他类型的RNA分离开来。还可用人工合成的oligo dT作为引物，将含有poly

30、 A的mRNA逆转录成cDNA。,8.4.3 断裂基因的拼接 基因断裂普遍存在于真核生物及其病毒的基因组中，一般说来，一个典型的真核生物蛋白质基因，内含子序列约占90%。包含内含子序列的mRNA前体必须通过拼接，切除内含子，将外显子连接起来，才能形成成熟的mRNA。 拼接反应与加帽加尾一样都属于共转录事件。 mRNA前体拼接的精确性同样取决于顺式元件和反式因子，最重要的顺式元件位于外显子和内含子交界处，而反式因子主要是五种snRNP，以及一些游离的蛋白质因子。,8.4.3.1 拼接反应的顺式元件控制拼接反应的4个顺式元件。 5-拼接点(5-splicing site, 5-SS)，内含子的前两

31、个核苷酸总是GU。 3-拼接点(3-splicing site, 3-SS)，内含子中的最后两个核苷酸总是AG，这一规律被称为GU-AG规则(GU-AG rule)。GU和AG两侧的序列也有一定的保守性。 在3-SS上游的一段主要由11个嘧啶碱基组成的富含嘧啶序列(Py)。 存在于内含子内部的分支点序列。在酵母细胞中，这一段序列总是UACUAAC，该序列对于拼接反应至关重要。此外，很多外显子内有外显子拼接增强子，可以提高拼接的效率。,8.4.3.2 拼接反应的反式因子 由snRNA和蛋白质组成的复合物snRNP，是拼接反应最主要的反式因子。snRNA是细胞核内一些序列高度保守的小分子RNA，一

32、般由60nt300nt组成，参与拼接反应的snRNA富含U，所以称U-snRNA，在U后面加数字，来表示不同的U-snRNA。 U-snRNP含有多种蛋白质，不同的U-snRNP所含的蛋白质不尽相同。但有一类蛋白质是许多U-snRNP共有的，即Sm蛋白，针对Sm蛋白的抗体可抑制体外的拼接反应，说明它们是拼接反应必需的。现已发现7种Sm蛋白，这些Sm蛋白具有相似的三维结构，由一段-螺旋和紧随其后的5个-股组成。,参与拼接反应的snRNP有U1-snRNP、U2-snRNP、U4-snRNP、U5-snRNP和U6-snRNP。U1-snRNA含有与mRNA前体5-SS互补的序列，负责识别5-SS

33、的剪接信号。U2-snRNA含有与分支点互补的序列，识别分支点。此外，U2与U6之间也存在互补区，通过配对形成的两段双螺旋对于拼接反应非常重要。U5-snRNP能够与上游外显子的最后一个核苷酸，以及下游外显子的第一个核苷酸结合，使两个相邻的外显子相互靠近，为外显子之间的连接创造条件。U6-snRNP除了能与U2-snRNP配对以外，还能与内含子的5-端互补配对，也能与U4-snRNP之间配对。U4和U6之间的配对导致两者形成紧密的复合物。 除snRNP以外，还有一些游离的蛋白质因子参与拼接反应，,8.4.3.3 拼接反应的过程 为完成拼接反应，需要将mRNA前体，mRNA前体结合蛋白质(如SR

34、, SC35和SF2/ASF等蛋白)和5种snRNP在细胞核内按照一定的次序组装成称作拼接体的超分子复合物。 拼接体的组装是一个有序过程，其中的不少步骤需要消耗ATP，而且拼接体本身又处在动态变化中，随着拼接反应的进行，某些成分可能离开拼接体，某些成分也可能进入拼接体。一旦拼接反应完成，拼接体即解体，拼接体的各个成员均可循环利用。,分支点结合蛋白(BBP)识别并结合到分支点 U2-snRNP取代BBP，并与分支点的一致序列发生碱基配对，形成一段短的RNA-RNA双螺旋。这一步需要U2辅助因子(U2AF)参与，并需要水解ATP限速步骤。 U2-snRNA与分支点之间配对时，缺少一个能与分支点内的

35、 A互补配对的U，因此，这个A突出在双螺旋之外而被激活，为随后的第一次转酯反应提供了条件。 U1-snRNP与5-SS的一致序列互补配对， U4/U6-U5-snRNP三聚体进入拼接体。U6在进入拼接体之前与U4通过互补区结合，在进入拼接体之后，则与U4脱离，转而与U2结合。同时，还代替U1与5-SS的一致序列结合。,第一次转酯反应 U6作为中间桥梁将分支点上突出的腺苷酸上的2-羟基拉近到5-SS，并对5-SS处的磷酸二酯键进行亲核进攻，紧接着U5-snRNP通过依赖于ATP的重排，使相邻的外显子靠近第二次转酯第一次转酯反应中游离出来的外显子上的3-羟基，亲核进攻5-SS上的磷酸二酯键，导致内

36、含子以套索结构释放出来，并很快被水解，而外显子连接。,8.4.3.4 次要拼接途径 不遵守GU-AG规则，例如，人PCNA基因的第6个内含子以AT开头，AC结尾。 这一类内含子在5-SS和分支点上具有高度保守的序列ATATCCTY和TCCTTRAY。根据这些序列，有人提出含有与这两段保守序列互补序列的U11和U12-snRNAs参与AT-AC内含子的拼接，这种预测很快得到证实，并发现U4atac和U6atac分别代替U4和U6参与这种拼接途径，只有U5同时参与主要和次要拼接途径。,8.5 不同类型内含子的比较8.5.1 I型内含子8.5.1.1 I型内含子的发现 1980年代初，发现原生动物四

37、膜虫(Tetruhymenu) 的rRNA内含子能够自我剪接(self splicing)，这一类内含子随后被称作I型内含子。 在无蛋白质的条件下保温培养，单一的rRNA前体依然可形成片段更小的电泳条带，其中移动最快的是39nt的条带，测序发现，它相当于413nt的rRNA内含子中的片段。 证明rRNA前体的确可以进行有GTP参与的自我剪接。,8.5.1.2 I型内含子的剪接机制 (1) I型内含子剪接的过程 第一次转酯反应一个游离的鸟苷或鸟苷酸(启动的。鸟苷酸或鸟苷的3-OH亲核攻击内含子5-端剪接点的磷酸二酯键，将G转移到内含子的5-端，同时切割内含子与上游外显子之间的磷酸二酯键，上游外显

38、子末端产生新的3-OH。第二次转酯反应上游外显子3-OH攻击内含子3-端剪接点的磷酸二酯键，将上游外显子和下游外显子连接起来，并释放线性的内含子。两次转酯反应是连续的，,第三次转酯反应是线性内含子的环化，发生在已切除的内含子片段中，内含子的3-OH攻击其5-端附近的第15和第16核苷酸之间的磷酸二酯键，从5-端切除15nt的片段，并形成399nt的环状RNA。环状RNA随即被切割生成线状RNA，由于切割位置与环化位置相同，生成的线状RNA依然为399nt。接着，再从5-端切去4个核苷酸，最终产物是395nt的线性RNA，由于这一产物比最初释放的内含子少19个核苷酸，因而被称作L19。,(2)

39、I型内含子的结构 I型内含子-核酶 I型内含子的自我剪接活性依赖于RNA分子中的碱基配对。通过比较不同的I型内含子序列，发现其中有9个主要的碱基配对区域，命名为P1P9，在I型内含子中高度保守的双链结构有3个， P1的内部引导序列(IGS) P4的保守短序列元件P/Q P7的保守短序列元件S/R， I型内含子自我剪接所需的最小催化 活性中心由P3、P4、P6和P7组成。该结构包括由两个结构域构成的催化核心，每个结构域由两个碱基配对区域构成。包含上游外显子末端序列和内含子端IGS的P1，构成底物结合位点，IGS是内含子中能与外显子进行碱基配对的序列，这种配对使剪接位点暴露而易受攻击，剪接反应具有

40、专一性。,8.5.2 II型内含子8.5.2.1 II型内含子的特点 II型内含子主要存在于某些真核生物的线粒体和叶绿体rRNA基因中，也具有催化功能，能够完成自我剪接。此外，大约25%的细菌基因组中有II型内含子。几乎所有的细菌II型内含子能够编码逆转录酶，并可作为逆转录转座子，或逆转录转座子的衍生物高频率插入特定区域，或低频率插入其它区域。,II型内含子与I型内含子自我剪接的区别? 转酯反应无需游离鸟苷酸或鸟苷的启动，而是由内含子靠近3-端的腺苷酸2-羟基攻击5-磷酸基启动剪接过程，经过两次转酯反应连接两个外显子，并切除形成套索结构的内含子。,II型内含子的5-端和3-端剪接位点序列为5G

41、UGCGYnAG3，符合GUAG规则。II型内含子的空间结构保守而复杂，其自我剪接的活性有赖于其二级结构和进一步折叠的构象，因此在细胞内的存在受到限制。在II型内含子特有的二级结构中，有6个茎环结构形成的结构域(dld6)，在空间上靠近的d5和d6，构成催化作用的活性中心(图8-18)。,8.5.2.2 II型内含子的剪接机制,在II型内含子剪接过程中，首先由内含子靠近3-端d6结构中的分支点保守序列上A的2-OH向5-剪接位点的磷酸二酯键发动亲核攻击，形成外显子1的3-OH，内含子5-端的磷酸基与分支点A的2-OH基形成2, 5-磷酸二酯键，产生套索结构，完成第一次转酯反应。接着，外显子1的

42、3-OH亲核攻击3-剪接位点，切断3-剪接位点的磷酸二酯键，并形成外显子1与外显子2之间的3, 5-磷酸二酯键，完成第二次转酯反应。经过两次转酯反应，两个外显子被连接在一起，并释放含有套索结构的内含子。,尽管某些II型内含子在体外就能够完成自我拼接，不需要任何蛋白质的帮助。但在体内，有一种拼接因子即成熟酶参与了II型内含子的剪接。成熟酶是由内含子编码的逆转录酶(RT)，与其中内含子d6结构中的分支点保守序列有很高的亲和力，二者相互结合后，由于蛋白质-RNA的相互作用，导致内含子构象发生变化，促进了RNA的拼接反应。在拼接结束以后，RT仍然与释放的内含子结合，参与随后的转座反应。,II型内含子主

43、要的转座事件是归巢(homing)，归巢的实质是以内含子RNA作为模板，将逆转录合成的DNA插入靶位点。逆转录反应由与RNA内含子结合的RT催化，属于靶位点为引物的逆转录。如图8-20所示，归巢反应开始于双链DNA外显子连接点上RNA内含子在靶位点的反拼接(reverse splicing)插入，这一步由RNA催化，RT协助，相当于由成熟酶协助的拼接反应的逆反应。随后，RT的En结构域在下游9 bp10 bp的位置切开DNA的另一条链，再由RT催化，以被切开的DNA链作为引物进行逆转录反应。最后，通过DNA的修复合成和连接完成内含子的插入过程。,8.5.3 内含子剪接机制的比较 从内含子的剪接

44、机制来看，I型内含子、II型内含子和核pre-mRNA剪接的III型内含子是相似的，只有tRNA的IV型内含子剪接机制完全不同。 对比研究发现，III型内含子的剪接体内snRNA的整体形态和II型内含子自我剪接时的形态类似，特别是剪接体的snRNA和II型内含子的催化部位之间的结构和功能十分相似。可以认为，这些snRNA可能来自早期自我剪接系统的II型内含子。例如，Ul snRNP和5-端剪接点配对，U6-U2和分支点序列配对形成的空间结构，与 II型内含子本身d5和d6配对形成的空间结构很相似。看来，在生物进化过程中，snRNA和mRNA前体之间的相互作用，取代了II型内含子剪接过程中有关片

45、段之间的相互作用。与II型内含子自身的结构相比，snRNP具有更加复杂和完善的结构，因而具有更加高级而复杂的调控功能，和更加高效的催化功能。,I型内含子与II型内含子都能够完成自我剪接，不像III型内含子那样需要结构复杂的剪接体。正因为如此，I型内含子与II型内含子剪接的效率和调控远远比不上III型内含子。I型内含子的剪接反应使用外源鸟苷酸或鸟苷，II型内含子的转酯反应无需游离鸟苷酸或鸟苷的启动，由内含子内部的腺苷酸引起，也许II型内含子剪接的效率和精确度比I型内含子更好一些。,1985年Cech等通过进一步研究，从切除的内含子中分离得到L19RNA，并发现其可在体外催化一系列分子间的反应，如

46、转核苷酸反应、水解反应、转磷酸反应等。L19RNA催化的转核苷酸反应如图8-21所示，可以看出，L19RNA既可从寡聚C切除核苷酸(图8-21和)，也可在寡聚C上添加核苷酸(图8-21和)，其催化过程具备酶的所有基本特征。,8.6 核酶8.6.1 核酶的发现 1982年Cech等研究原生动物嗜热四膜虫rRNA的转录后加工，发现rRNA的前体可以在鸟苷与镁离子存在下切除自身的内含子，将两个外显子拼接为成熟的rRNA分子，该反应不需要任何蛋白质类型的酶参与，因此Cech认为该rRNA前体具有催化功能，并将其命名为核酶(ribozyme)。,1983年Altman等研究来自大肠杆菌的RNase P，

47、发现该酶由RNA和蛋白质两部分组成，其中的RNA组分即M1 RNA ，在单独存在下具有催化功能。将克隆后的M1 RNA 基因在体外进行转录，转录产物也具有催化活性，这一研究结果证明RNA确实有催化功能。核酶的发现证明了RNA既是信息分子，又是功能分子，是现代生命科学的一个重要进展， 由于这一重要发现，Cech和Altman荣获了1989年的诺贝尔化学奖。 后来的研究发现，T4 RNA也能进行自我剪切，一些植物的类病毒(viroid)、拟病毒(virusoid)和卫星RNA等，在复制过程中也能自我剪切和环化。1990年代初期，研究在核糖体上进行的蛋白质生物合成时发现，肽酰转移酶的活性主要由核糖体

48、大亚基中的23S rRNA提供，核糖体大亚基中的蛋白质只起辅助作用。看来，核酶在自然界的存在有一定的普遍性。,8.6.2 核酶的类型 核酶一般是指无需蛋白质参与或不与蛋白质结合，就具有催化功能的RNA分子。除了I型和II型内含子RNA的剪接酶功能之外，还有核苷酸转移酶、肽酰转移酶、磷酸转移酶和磷酸酯酶等多种酶活性。目前研究较多的RNA加工酶类，又可分为剪接型核酶和剪切型核酶两类。 剪接型核酶即催化磷酸二酯键的转移反应或称转酯反应的酶类，也就是说，在RNA分子的磷酸二酯酶被水解切割的同时，伴随着新的磷酸二酯键形成。剪接型核酶具有序列特异的内切核酸酶、RNA连接酶等多种酶活性，I型内含子和II型内

49、含子的自我剪接均属于这一类。前者的剪接反应需要Mg2+和鸟苷酸等辅助因子参与，典型代表是四膜虫rRNA前体、酵母线粒体细胞色素b的mRNA前体、酵母线粒体核糖体大亚基的rRNA前体、T4噬菌体胸苷酸合成酶的mRNA前体等。后者催化反应只需要Mg2+，无需鸟苷酸参与。这类剪接型核酶在酵母线粒体中较多，如细胞色素氧化酶的mRNA前体，细胞色素c的mRNA前体，脱辅基细胞色素b的mRNA前体等。,剪切型核酶的作用是只剪不接，可以从自身RNA，或另外的RNA分子上切除特异的核苷酸序列，其典型代表是M1 RNA。E.coli的RNase P能特异地剪切tRNA前体5-端的片段，RNase P由Mr为20

50、103的蛋白质和 377nt的Ml RNA组成，这两个组分单独存在时均无催化活性。但在有高浓度Mg2+存在时，单独的MIRNA也可催化tRNA前体5-端的剪切，若加入蛋白质组分，则可提高M1 RNA的催化活性。因此认为，Ml RNA是一种剪切型核酶，Mg2+和蛋白质组分是它的辅助因子。此外，T4噬菌体的RNA前体也属于这一类，其215nt的初始转录产物能自我剪切成139nt的成熟RNA和76nt的无活性片段。,8.6.3 核酶的结构 核酶的催化功能与其空间结构密切相关，已知有多种不同结构的核酶。例如，I型和II型自我剪接内含子、锤头型、RNaseP的Ml RNA、发夹型、丁型肝炎病毒(hepa