单卫民凝血培训ppt课件.pptx

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1、,出凝血基础知识培训,概述,血液止血过程涉及到血管、血小板、凝固系统、抗凝系统、纤溶系统。此外还与机体自身的防护，如免疫应答、细胞的吞噬作用、激肽生成过程有关。 简单的说，当血管破损，血小板聚集，凝血酶生成，交联纤维蛋白在聚集血小板的基础上形成，巩固用于堵住伤口的塞子。继而激活纤溶系统，溶解多余的纤维蛋白，避免形成血栓栓塞，最终修复破损的血管，以维持血管的完整和通畅。,出凝血的过程,血小板,RBC,出血,黏附,聚集,凝固反应,初级血栓,二级血栓,内皮层,血管内皮受损,纤维蛋白凝块,出凝血的过程,凝血酶,黏附和聚集,纤维蛋白,止血块,血小板的黏附和聚集,0 min,10 min,5 min,二级

2、止血,初级止血,凝固,血小板的结构,血小板的生理功能,血小板是一个多功能的无核细胞，其主要生理作用是参与正常的血栓与止血。血小板的功能主要包括粘附(adhesion)、聚集(aggregation)、释放(release)反应以及其他凝血功能。此外，血小板还参与各种炎性、免疫反应及保持血管完整性的功能。血小板粘附：是指血小板粘着在受损血管内皮胶原上的过程。这是血小板参与止血反应的第一步，此过程需要有vWF和血小板膜GPIb受体参与。血小板聚集：是指血小板之间相互粘附的过程。此过程需要有纤维蛋白原和血小板膜GPIIb/IIIa受体参与。血小板释放:是指在诱导剂的作用下储存在血小板内的颗粒包括-颗

3、粒、致密颗粒或溶酶体颗粒中的许多物质释放到血小板外的过程。,一期止血,最先是由血管受损后引起血小板的的生理反应以阻止出血机制 -血小板经凝血酶等刺激而活化 -血小板经 GPIb 和 von Willebrand 因子 (VWF)之间的交互 作用黏附变形 -血小板颗粒物质的释放以补充更多血小板到受损部位 -血小板的聚集在GPIIb/IIIa和纤维蛋白原交互作用下以形成 最初的栓子 引发二期止血 (凝固蛋白),一期止血的检测实验,出血时间 - Assesses all components of Virchows triad -体内测试 直接在患者身上执行 -使用替代的工具进行“体外”出血时间的检

4、测血小板聚集 -检测血小板聚集的能力，通过体外添加不同的诱导剂 -主要用于评价血小板糖蛋白 IIb/IIIa 受体的功能 Von Willebrand 因子 (VWF) 测试 -测定VWF的数量和功能, 协同血小板在受损部位发挥黏附的作用 -评价VWF 与血小板糖蛋白 Ib 受体交互作用的功能,二期止血,血液凝固过程机制 -凝血因子相继激活形成凝血酶 -凝血酶使纤维蛋白原形成纤维蛋白 -纤维蛋白加固在一级止血中形成的血小板栓子成为更稳固的 血栓块 (二级止血栓子) 防止受损部位进一步的血液流失,血液凝固简称凝血，是血液由液体状态转变为凝胶 状态的过程。此过程是由多种酶和辅助因子参与的复 杂过程

5、。其核心是生成凝血酶，后者将纤维蛋白原转 变成纤维蛋白。 当凝血活动达到止血目的时，机体迅速启动抗凝系 统阻止凝血继续下去，避免造成血管阻塞。 凝血和抗凝两者间的动态平衡是正常机体维持体内 血液液体流动状态和防止血液丢失的关键。,凝血机制,血液中的凝血因子,凝血因子,组织因子(TF)：凝血过程中的启动因子。血管内皮细胞、神经 胶质、血管平滑肌和上皮细胞都能表达TF。因此能在血管和器 官外围形成保护，只要血液漏出血管，TF就会启动凝血过程。VII因子(F-VII)：在血管损伤时，VII因子与TF结合启动凝血过程。 也许是因为在血浆中没有有效的抑制物中和游离的F-VIIa，所 以近些年来，基因重组

6、的F-VIIa被导入临床作为一种治疗手段， 1，用于血友病治疗，血友病患者有针对外源性F-VIII的抑制物 时；2，更为广泛的出血问题和一般外科干预治疗。凝血酶原(F-II)：凝血酶原被F-X-F-V复合物激活后，可以激活很 多蛋白酶。包括：促凝因子F-V、F-VIII、F-XI，抗凝因子PC，一 系列跨膜激活蛋白酶受体（PARs），凝血酶激活纤溶抑制物（TAFI）。,凝血因子,VIII因子(F-VIII)：VIII因子是F-IXa激活F-X的必要辅助因子，由凝血 酶或F-Xa激活，由APC灭活，缺乏VIII因子导致血友病A。IX因子(F-IX)：缺乏IX因子会导致血友病B，因为F-IX的主要

7、功 能是参与F-X的激活，TF-F-VIIa或F-XIa能激活F-IX。XI因子(F-XI)：XI因子由凝血酶激活，以前认为XI因子由接触 因子XII因子激活。但现在的观点是XI因子由凝血酶反馈激活， 继而激活IX因子、X因子，从而大量激活凝血酶，使凝血过程进 入放大期。血管性血友病因子(vWF)：vWF由内皮细胞、巨核细胞、血小板合 成，并在各种刺激(包括凝血酶的刺激)下释放入血。血液循环中 也有一定量的vWF(由内皮细胞释放)。vWF的两个主要功能： 1，作为VIII 因子的载体并稳定VIII 因子；2，诱导血小板GPIb 粘附在胶原纤维上。,经典的凝血机制,血凝瀑布学说, 当缺乏F-XI

8、I、激肽释放酶原、高分子量激肽原时，体外实验会显示凝血时间延长，但机体为什么没有出现出血倾向？ 为什么缺乏F-VIII或F-IX时，机体会出现严重的出血，而外源凝血途径不能阻止出血？ 为什么缺乏F-XI引起的出血程度要比F-VIII或F-IX因子缺乏轻得多？体外试验时，为什么凝血酶爆发性生成前有一个延缓期？,经典理论产生的几个问题,组织因子途经,血管血管损伤,TF,TF/a,a,凝血酶原,a,凝血酶,纤维蛋白原,纤维蛋白,XI,XIa,TFPI,(-),Va,a,外源性的因子在组织因子的结合下既可激活因子，又可激活内源性的第因子，从而打破了内源与外源的界限。因子缺乏时并不引起出血，这说明第因子

9、并不一定只被因子激活，现已证明本身具有自身激活作用。凝血酶（因子）也可激活因子，原来认为只有因子才能激活因子。TF被激活并与因子结合后会被组织因子途径抑制物（TFPI）所抑制；后者已成为一种新型抗凝剂。是组织因子、 、因子的天然抑制物。,传统的凝血途径的修改,组织因子联合FVIIa 在创伤处启动凝固 少量形成的凝血酶激活血小板 凝血因子在血小板表面形成复合物 大量形成的凝血酶使纤维蛋白原转化成纤维蛋白 纤维蛋白加固了血小板栓子 (一期止血) 并使止凝血完成,更新的二期止血,内源途径,XII,XI,IX,VIII,共同,X,V,II,途径,APTT内源+共同,纤维蛋白原,纤维蛋白凝块,VII,外

10、源途径,组织因子,PT外源+共同,实验室检查,TT,Fbg,血液收集于枸橼酸钠抗凝的试 管中 由于枸橼酸钠结合了钙使血液 保持流动，可用于检测凝固功 能。 将试管经过离心分离血浆层 (白细胞 & 血小板) 和红细胞,用于测试的血浆 - 血浆含有纤维蛋白原 - 血清不含有纤维蛋白原 血浆是“乏血小板的” 血小板层留 在淡黄色层里,血浆,淡黄色层,红细胞层,样 本,演算纤维蛋白原,PT单位的表达方式,1、以秒(s)表示:参考值为11-14s。待测者的结果超过正常对照3s以上有临床意义。2、凝血酶原时间比值(PTR)：待测血浆的凝血酶原时间与正常血浆凝血酶原时间的比值。参考值为0.82-1.15。3

11、.国际标准化比值(INR):即PTRISI。参考值为0.8-1.5。ISI为国际敏感度指数。指数越大，组织凝血活酶的敏感性越低。4.活性%,若仅 APTT 延长，最可能的缺乏 是 Factors XII, XI, IX 或 VIII 若仅 PT 延长，最可能是 Factor VII 缺乏 当两种初筛实验均延长时，缺乏 的是共同途径的 Factors X, V, II和 I.,凝血疾病的筛查,APTT,PT,XII,XI,IX,VIII,X,V,II,I,VII,延长的 PT / APTT,in Blood,in Plasma,without,without,without,IX,XII,IX,

12、VIII,VII,III,II,I,IX,XII,X,IX,VII,V,IV,III,I,Thrombin Reagent,Fibrin,Thrombin,37癈,I,II,BloodSampling,TrisodiumCitrate,凝血酶时间(TT)测定,Measure Clotting Time,Normal Range16-18 sec,凝血酶时间 (TT) 评估血浆中纤维蛋白原的功能 TT 凝固时间延长 - HEPARIN - 直接凝血酶抑制剂 - 低纤维蛋白原血症 - 纤维蛋白原结构异常 - 纤维蛋白降解产物升高,凝固与抗凝: 一种平衡的行为,因子,抑制物,产生凝血酶,抑制凝血酶形

13、成,凝固抑制,外源途径,XII,组织因子,纤维蛋白原,纤维蛋白凝块,内源途径,XI,IX,VIII,X,II,VII,抗凝血酶,蛋白 C 系统,V,抗凝系统,I,II,III,IV,V,VII,VIII,IX,X,XI,TFPI,PS,PC,AT-III,PL,APA,XIII,抑制物,天然抑制物 - 蛋白 C (活化的) 和蛋白 S 抑制凝血因子 FVIIIa 和 FVa - 抗凝血酶(AT) 抑制 FXIa, FIXa, FXa, FVIIa/TF, 和凝血酶 (IIa) 病理抑制物 - 获得或自体免疫抗体对应特异性凝固因子 药物抑制剂 - 肝素和低分子量肝素 - Warfarin - 直

14、接凝血酶抑制剂,抗凝血酶(AT),抗凝血酶(antithrombin，AT )由肝脏、血管内皮 细胞、巨核细胞合成，是依赖肝素的丝氨酸蛋白酶抑 制剂，是人体内主要的血浆抗凝物质，尤其对凝血酶 的灭活能力占所有抗凝蛋白的70%80%。 AT与丝氨酸蛋白酶作用的活性位点位Arg393, ser394处,蛋白酶攻击该键使其裂解并引起AT变构， 从而形成AT与酶1：1复合物,这种共价结合是不可逆 的,肝素作用于AT的赖氨酸残基从而大大增强AT的抗 凝酶活性（2000倍以上）。,肝素和抗凝血酶的抑酶作用,Antithrombin,Thrombin,Heparin,Heparin,蛋白C系统是人体内另一重

15、要的抗凝系统，它是通过一组蛋 白的相互作用，最终使因子V和灭活，从而起到抗凝作用。 蛋白C系统除蛋白C（protein C，PC）外，还包括： 蛋白S（protein S，PS）、 血栓调节蛋白（thrombomodulin，TM）、 活化蛋白C抑制物(activated protein inhibitor APCI) 内皮细胞蛋白C受体（endothelial protein C receptor， EPCR）。,蛋白C系统,蛋白C系统,PC是由肝细胞合成的依赖维生素K的糖蛋白，是PC抗凝系统中的中心物质。 在血浆中PC为无活性的丝氨酸蛋白酶原，它必须转变为具有丝氨酸蛋白酶活性的活性蛋白C，

16、才能发挥抗凝作用，凝血酶-TM复合物是其生理激活剂。 PS也是由肝细胞合成的依赖维生素K的蛋白质，但不具有蛋白酶活性，在血浆中以游离形式和与4b结合的形式存在，发挥抗凝辅助作用的是游离形式。 TM是一种单链糖蛋白，已知TM存在于除脑血管外的所有血管内皮细胞中。TM主要是与凝血酶结合成复合物，激活PC。,蛋白C的抗凝途径,EPCR,蛋白C的主要抗凝作用,APC,抗凝血酶(AT)检测,抗凝血酶活性测定(发色底物法)原理： 在待测血浆中加入过量的凝血酶，凝血酶与血浆中的AT形成1:1的复合物，剩余的凝血酶作用于显色肽，裂解出显色基团，显色程度与剩余凝血酶的量呈正相关，而与血浆AT:Ag呈负相关。参考

17、值： 108.55.3%,抗凝血酶(AT)检测,AT:Ag含量测定(ELISA法) 原理： 将抗AT抗体包被在固相板，标本中的AT与固相的抗AT抗体相结合，再加入酶标记的抗AT抗体，形成抗体-抗原-酶标记抗体的复合物，加入显色剂后，根据显色的深浅来判断标本中AT的含量。 参考值： 29030.2mg/L,抗凝血酶检测的临床意义,AT缺乏是发生静脉血栓与肺栓塞的常见原因之一，但与动 脉血栓形成关系不大。 一.遗传性AT缺乏： 遗传性AT缺乏是一种常染色体显性遗传性疾病，患病率约1/5000,发病多在19-25岁，患者常在手术、创伤、感染、妊娠 或产后发生静脉血栓，并可在多出反复发生血栓。此病可分

18、为 两型：1.交叉反应物(cross reaction material)阴性型(CRM），即抗原与活性均下降； 2. (CRM ）型，即抗原正常，活性下降。 共同表现是对肝素的亲和力降低，从而对凝血酶的灭活能力明显减弱。,二.获得性AT缺乏： 1.合成降低，主要见于肝硬化、重症肝炎、肝 癌晚期等。 2.丢失增加，见于肾病综合征。 3.消耗增加，见于血栓前期和血栓性疾病，如心脑血管疾病、 DIC、外科手术后、深静脉血栓形成 、肺梗死、妊高症等。 三.AT水平增高： 在血友病、口服抗凝药物、使用黄体酮类药物时，AT水平增高。,蛋白C的检测,蛋白C活性测定(PC:A,发色底物法): 原理： 从蛇毒

19、中提取的Protac作为PC的激活剂,可特异性 激活PC,生成的活性PC（APC）作用于特异发色底物（Chromozym-APC ),并释放出产色基团对硝基苯胺, 颜色的深浅与PC:A的相对活性（%）呈正相关。 参考值： 100.2413.18%,蛋白C:Ag含量测定（PC:Ag,免疫火箭电泳法） 原理： 在电场的作用下，一定量的待测血浆（含有PC抗原）在含有抗人PC抗体的琼脂糖凝胶中电泳，扩散一定时间，抗原与相应抗体反应形成不可见的沉淀。电泳后在1%磷钼酸溶液中显色形成有色的火箭免疫沉淀峰，该峰的高度与PC抗原浓度呈正相关，由此计算PC:Ag的含量。 参考值： 102.520.1%,蛋白C检

20、测的临床意义,一.遗传性PC缺乏：主要见于反复不明原因的血 栓形成。 二.获得性PC缺乏：常见于DIC、肝功能不全、大 手术后、长期制动、口服抗凝剂患者。 三.PC抗原或活性增高：主要见于代偿性增加如 冠心病、糖尿病、肾病综合征、妊娠后期等。,蛋白C Global试验,检测方法： 在待测血浆中加入蛇毒温育，蛇毒可直接激活PC转 变为APC。随后加入APTT试剂以检测依赖PC活性的血浆凝固时间（Protein C activity-dependent clotting time，PCAT）。若待测血浆中的PC系统正常，则加入Ca2+后 血浆凝固时间显著延长。为了避免诸多因素的影响,本 试验设计了

21、对照组，即在试验过程中以缓冲液代替PC 激活剂，血浆不依赖PC活性的血浆凝固时间(PCAT/O) 其结果应短于60秒。,参考值： PCAT为85200秒，PCAT/O为3355秒（n234），PCAT:PCAT/0 本实验结果应以正常化比率(Normalized Ratio,NR) 来表示。 NR(PCAT:PCAT/0)样本CF CFSV/(PCAT:PCAT/0)正常人血浆 CF：校准系数，SV：试剂对正常人血浆的敏感值。 NR:0.69-1.56,临床意义： PCAT:PCAT/0小于0.8，说明蛋白C系统有缺陷。 本试验多用于蛋白C、蛋白S、FV Leiden突变和 FII 20210

22、 GA突变的检测，起到蛋白C系统筛选 检测作用。 本试验也有假阳性，见于凝血因子V、VIII活性升 高，口服抗凝剂和狼疮抗凝物等。,凝固与纤溶: 一种精密的平衡,凝固,纤溶,形成血栓,溶解血栓,产生凝血酶,产生纤溶酶,纤溶的降解产物,纤溶酶,纤维蛋白原,凝血酶,纤溶酶,纤维蛋白,纤维蛋白原降解产物,Fibrinogenolysisprimaryactivation,纤维蛋白降解产物,Fibrinolysissecondaryactivation,纤维蛋白(原)的降解,纤维蛋白原,纤维蛋白原,碎片 X,D,Y,E,D,D,E,E,纤维蛋白单体,纤维蛋白聚合体,D-dimer,FXIII,FXII

23、Ia,纤维蛋白凝块,D,D,D,D,FPB,FPA & B,纤溶酶,E,E,D,D,D,D,凝血酶,D,FXIIIa,纤维蛋白降解产物(FDP)的测定,免疫比浊法 原理： 在待测血浆中加入包被了单克隆抗体的聚苯乙烯颗粒，此抗 体可与血浆 中的DD发生凝集反应，产生浊度。DD的含量与浊度增加呈正比。 参考值：小于5mg/L 临床意义： 1.原发性纤溶亢进； 2.高凝状态、DIC、肺栓塞、妊高征、恶性肿瘤、静脉栓塞、溶 栓治疗等。,D-二聚体(免疫比浊法)的测定,原理： 在待测血浆中加入包被了单克隆抗体的聚苯乙烯颗粒，此抗体可与血浆 中的DD发生凝集反应，产生浊度。DD的含量与浊度增加呈正比。 参

24、考值：64-246g/L 临床意义： 1.是排除深静脉血栓和肺栓塞的筛选试验。当血浆DD浓度低于某一临界 (通常为500g/L)，其阴性预测值大于90%。 2.DD升高的疾病深静脉血栓形成；肺栓塞；弥散性血管内凝血；心血管疾病：急性心肌梗死、不稳定性心绞痛、动脉粥样硬化、冠状动脉硬化、高血压等；恶性肿瘤：乳腺癌、卵巢癌、手术、创伤后；溶栓治疗后；脑血管疾病；严重感染、脓毒血症、坏疽等；绝经后激素替代治疗、先兆子痫、妊娠；其他：甲减、慢性肝病等。,定量测定纤维蛋白原,凝固形成时间 5-14 seconds,37C 孵育 3 分钟,0.2 ml 稀释血浆,0.1 ml 凝血酶,定标血浆通过系列梯度

25、稀释(1:5, 1:10, 1:20, 和 1:40) 建立参考曲线 (见下图) 病人血浆用缓冲液10 倍稀释 (1:10),患者凝固时间为秒通过参考曲线换算为浓度 - 例：患者凝固时间为 8.0 seconds 对应纤维蛋白原浓度为 281 mg/dl 纤维蛋白原浓度与凝固时间成反比,Clotting Time - Seconds,58,115,230,460,10,35.0,18.3,9.5,281,5.1,8.0,Patient,mg/dL Fibrinogen,PT 和 APTT小结,当患者需要使用PT 和 APTT 来筛查时，都可能有潜在的出血 - 若样本不存在华法令或肝素, 那么: PT延长而 APTT 正常= FVII的缺乏 PT 正常而APTT 延长= 内源凝血因子的缺乏 (FVIII, FIX, FXI, 或 FXII) PT 和 APTT 同时延长= 共同途径的因子缺乏 (FX, FV, FII, 或纤维蛋 白原) PT, 通过 INR, 用于口服抗凝剂治疗的监测 (warfarin) APTT 用于肝素抗凝治疗的监测 APTT 受抑制物影响如狼疮抗凝物,谢谢！,