细胞周期的调控与检测ppt课件.ppt

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1、提纲,一、基本概念介绍二、历史回顾三、细胞周期各时相的动态变化四、细胞周期的调控五、细胞周期得以进行的两大机制六、细胞周期的界面机制七、肿瘤与细胞周期八、常用的细胞周期检测方法九、细胞周期同步化,生命是如何生长、生存、繁衍和死亡？在每一个生命个体中都存在一个精密的程序，或生物钟。生物钟决定着细胞是否、何时生长、分裂、或死亡。这就是细胞周期调控机制，它在相关基因的控制下，依据一定的规则和节奏运行着，调控细胞的生长、分裂和死亡。在胚胎细胞，细胞周期保持快速运行，在一些成年细胞中其运行慢得多，而在神经元细胞细胞周期几乎完全不运行。在生长过程中的细胞，如果细胞周期不能运行，结果是死亡。而在成熟细胞，细

2、胞周期不正确的运行，结果则是肿瘤的发生。,细胞周期(cell cycle),细胞周期调控(cell cycle regulation),“细胞周期”也称“细胞分裂周期”，是指一个细胞经生长、分裂而增殖成两个所经历的全过程，通常可分为若干阶段，即G1期、S期、G2期和M期。细胞在G1期完成必要的生长和物质准备，在S期完成其遗传物质染色体DNA的复制，在G2期进行必要的检查及修复以保证DNA复制的准确性，然后在M期完成遗传物质到子细胞中的均等分配，并使细胞一分为二。,一、基本概念介绍,2001 Nobel Prize,Leland H. Hartwell 1970s“Checkpoint”Yeas

3、t genetics100 CDC genesStart gene,Tim Hunt 1980sCyclinsSea Urchins,Paul M. Nurse1970sCDKsyeast,二、历史回顾,生命复制之谜的揭开 （1）1858年建立细胞理论： 生命的基本形式是细胞，机体由细胞构成，细胞的生长复制形成了生物体的生长繁衍，细胞的异常或死亡导致机体的疾病或死亡。 （2）1951年发现了细胞分裂周期：G1 S G2 M G0 细胞生长中有两种形式- 有丝分裂期和细胞间期,细胞周期,细胞间期,有丝分裂期（M期）,DNA合成前期（G1期）,DNA合成期（S期）,DNA合成后期（G2期）,前期,

4、中期,后期,末期,细胞分裂周期图,（3）随着成熟刺激因子（maturation promoting factor, MPF），细胞周期素（cyclin），细胞周期素依赖性蛋白激酶(cyclin dependent kinase，CDK)的发现使对细胞周期及与肿瘤的发生发展关系的研究有了很大进展,三、细胞周期各时相的动态变化、G1期（DNA合成前期，指有丝分裂完成到DNA合成之前的一段时间） RNA在此期大量合成，导致蛋白质量明显增加。S期所需的DNA复制相关的酶系，如DNA聚合酶，G1期向S期转变相关的蛋白质如触发蛋白、钙调蛋白、细胞周期蛋白等均在此期合成。蛋白质的磷酸化作用在G1期开始增加，

5、这将有利于G1晚期染色体结构成分的重排。非组蛋白、一些蛋白激酶在G1期也可发生磷酸化，已知大多数蛋白激酶磷酸化发生于其丝氨酸或苏氨酸、酪氨酸部位。,触发蛋白是一种不稳定蛋白，它对细胞从G1期进入S期是必须的。只有当其含量积累到临界值，细胞周期才能朝DNA合成方向进行。钙调蛋白是真核细胞内重要的钙受体，它调节细胞内钙的水平，钙调蛋白的含量，在G1晚期可达峰值，用抗钙调蛋白药物处理细胞，可延缓其从G1期到S期的进程。G1期蛋白质量的增加，可能与蛋白质合成增强有关，而另一原因则可能使其降解的减弱。,、S期（DNA合成期，从DNA合成开始到DNA合成结束的全过程，是细胞增殖周期的关键阶段） S期是细胞

6、进行大量DNA复制的阶段，组蛋白及非组蛋白也在此期大量合成，最后完成染色体的复制（）DNA复制需要多种酶的参与 包括DNA聚合酶、DNA连接酶、胸腺嘧啶核苷酸激酶、核苷酸还原酶等。随着细胞由G1期进入S期，这些酶的含量或活性可显著增高（）DNA复制具有严格的时间顺序 通常，GC含量较高的DNA序列在早S期复制，晚S期复制的主要为含量高的DNA序列；就染色体而言，常染色质的复制较异染色质要早，典型的例子如人类女性的细胞中，当其它染色体都被复制完以后，才开始进行纯化的X染色体复制。,（）S期是细胞合成的主要时相 此时细胞质中可出现大量的组蛋白mRNA，新合成的组蛋白从胞质进入胞核，与复制后的DNA

7、迅速结合，但绕成核小体，进而形成具有两条单体的染色体。除了蛋白质合成以外，在S期细胞中不断进行着组蛋白的持续磷酸化。（）中心粒的复制也在S期完成 原本垂直的一对中心粒发生分离，各自在其垂直方向形成一个子中心粒，由此形成的两对中心粒在以后的细胞周期进程中，将发挥微管组织中心的作用，纺锤体微管，星体微管的形成均与此相关。,、G2期（DNA合成后期，从DNA复制完成到有丝分裂开始前的时期，为有丝分裂 进行物质条件） 为细胞分裂准备期，细胞中合成一些与M期结构功能相关的蛋白质，与核膜破裂，染色体凝集相关的成熟促进因子在此期合成。微管蛋白G期合成达高峰，为M期纺锤体微管的形成提供了丰富的来源。已经复制的

8、中心粒在G2期逐渐长大，并开始向细胞两极分离。、M期（有丝分裂期，细胞经过分裂将染色体平均分配到两个子细胞中） 在此期细胞中，染色体凝集后发生姊妹染色单体的分离，核膜核仁破裂后再重建，胞质中有纺锤体收缩环出现，随着两个子核的形成，胞质也一分为二，由此完成细胞分裂。,G1期：为DNA合成准备所需要的RNA、 蛋白质、脂类、糖类等G1早期：细胞的生长G1晚期：为S期的DNA合成做准备,S期（DNA合成期） DNA合成(复制) 染色体蛋白的合成：组蛋白、非组蛋白等中心粒的复制,G2期（DNA合成后期）有活跃的RNA和蛋白质合成微管蛋白，促有丝分裂因子（MPF）中心粒向两极移动,M期（有丝分裂期） D

9、NA、RNA、蛋白质合成停止。 细胞发生一系列形态变化、结构建成。将加倍的DNA平均分配到两个子细胞中,细胞周期调控研究过程的重要事件-MPF的发现：MPF是一种在G2期形成，能促进M期启动的调控因子，称之为促细胞成熟因子或促细胞分裂因子（MPF)。MPF由调节亚单位细胞周期素（ cyclin ）和催化亚单位细胞周期素依赖性蛋白激酶（CDK）组成。,1、 细胞周期调控蛋白（cell cycle- regulating protein),四、细胞周期的调控,2）细胞周期调控蛋白的种类,A、CDK类蛋白激酶：CDK与细胞周期素结合才具有激酶的活性，故名细胞周期素依赖性蛋白激酶(cyclin-dep

10、endent kinase，CDK). 作用：CDK可将特定蛋白磷酸化，促进细胞周期运行。在动物中已知7种CDK，CDK1-7。,B、细胞周期素（cyclin)特点：在细胞周期中呈周期性变化。作用：能与CDK结合，激活CDK，间接调节细胞周期运行。已知30余种，在脊椎动物中为cyclinA1-2、B1-3 、C、 D1-3、E1-2、F、G、H等。,Cyclins与CDKs结合后，CDKs才具有活性，它们两者的结合使细胞周期有序进行。具体结合方式如下：,C、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI),CKI对细胞周期起负调控作用，分为：Ink4: P16ink4a, P15ink4b, P18i

11、nk4c, P19ink4d。特异性抑制cdk4-cyclin D1, cdk6-cyclin D1。Kip：P21cip1、P27kip1、P57kip2，抑制大多数CDK的激酶活性。P21cip1还能与DNA聚合酶的辅助因子PCNA结合，直接抑制DNA的合成。,作用机制：未完全清楚，大多数CKI是通过直接与Thr160/161磷酸化后的CDK-cyclin复合物密切结合，直接抑制其蛋白激酶活性。现较为肯定的是p21，其调控水平在基因转录的层面，当DNA损伤和细胞衰老时，具有转录因子作用的p53增高，抑制其蛋白激酶活性，阻滞细胞周期的进行。,M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的积累。结

12、合M -cyclin的CDK1被Wee1（抑制因子）将Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不断积累。在M期，Wee1的活性下降，CDC25磷酸酶使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障碍。CDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CAK)的作用下完成的。,3）M期CDK的激活,CDK activating,活性位点,抑制位点,由于某些环境因素的作用细胞周期出现故障或差错， 这些信号可是细胞停留在某些点上，称为限制点。主要检验点：G1/S限制点：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restri

13、ction point)。S期限制点：DNA复制是否完成？G2/M限制点：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？中-后期限制点：纺锤体组装限制点。,2、细胞周期限制点（check point）,Four checkpoints,3、细胞周期中的信号系统调控,单细胞生物的增殖取决于营养，多细胞生物细胞的增殖与信号途径有关。A、生长因子：是与细胞增殖有关的信号物质，已知几十种，多数能促进细胞增殖，又称有丝分裂原（mitogen），如EGF、NGF。作用方式：旁分泌。信号通路：ras途径，cAMP途径、磷脂酰肌醇途径。,B、抑素（chalone)是一种由细胞自身产生、分泌的，对细胞增殖起抑制作用的糖蛋

14、白，与膜上的受体结合，引起信号转换及在胞内传递，影响细胞周期相关的蛋白的表达。,具有严格的组织特异性和细胞周期阶段特异性。作用于G1期的抑素可阻止细胞进入S期，称S因子。作用于G2期的抑素可阻止细胞进入M期，称M因子。,五、 细胞周期得以进行的两大机制 细胞周期得以进行的核心机制是在一系列cyclin时相起伏的调控下，相应的CDK依次激活，驱使细胞通过G1,S,G2期，达到M期，细胞一分为二，实现忠于亲代的细胞复制。这一过程的顺利完成取决于是否启动和能否忠于运行，达到忠实复制，是细胞周期调控的两大生物学机制。,1、细胞周期的启动机制 细胞周期能否启动进行细胞增殖，主要的调控点在G1期，它决定细

15、胞是否通过G1期进入S期。这一调控点首先在芽殖酵母的研究中被认识，人们称其为“起始点”（START）。一旦细胞通过start,它们势必进入S期，完成整个细胞分裂周期。因此start有人称之为酵母细胞周期的“决定点”。在人体细胞增殖中，在G1期存在相似的调控机制。在G1期较晚时，也有一个决定点，称为“限制点”（restriction point），与酵母的START功能类似，不同的是，人类细胞是否通过“限制点”，进入细胞周期，主要受与细胞增殖有关的细胞外生长因子的调控，而不是营养素。只要有相应的生长因子存在，细胞就能通过R点进入S期，完成整个细胞周期。回到G0/1期。相反，如果细胞在G1期就缺乏

16、相应的生长因子，细胞周期的运行将停止在R点，此时细胞进入“安静状态，称之为G0期。,连接信号转导与细胞周期有两条途径，一是cyclinD/CDK4，二是cyclinE/CDK2。二者都是G1期进行的限速步骤，即cyclinD或cyclinE的过度表达，均能缩短G1期时间或加速G1期进行,2、细胞周期的监控机制 DNA损伤检测点 抑癌基因p53在人类细胞周期G1期检测点起着关键性作用。还存在G2期检测点。时相次序监测点MPF(有丝分裂促进因子)，可以诱导所有细胞周期时相的细胞核发生染色体凝集。SPF(S期促进因子)，只能诱发G1期细胞进入S期而不能使G2期细胞进入M期。,六、细胞周期的界面机制1

17、、细胞周期与DNA修复 所有的真核细胞中都高度保守者这一整套完整的精密机制，承担着DNA损伤、错误地发现，并将其信号传递给相应的机制，去阻滞细胞周期的运行，并同时进行DNA损伤的修复。然后视修复情况，细胞基因的突变。决定继续分裂或死亡，执行一系列细胞的重要生命活动。,DNA修复方式 切除修复 错配修复 : 将局部一段错配的寡核苷酸链切除，重新合成之,碱基切除修复核苷酸切除修复,全基因组切除修复转录切除修复,2、细胞周期与细胞凋亡 细胞凋亡存在有细胞周期特异性，不同因素诱导的细胞凋亡发生在细胞周期不同的时相 3、细胞周期与细胞分化 细胞周期不仅与细胞增殖、细胞凋亡有关，还调控着细胞分化,1、细胞

18、周期与肿瘤的关系目前从多方面对肿瘤进行了深入研究（流行病学、病因学、遗传），肿瘤是多因素，多步骤，多阶段的。但是肿瘤的恶性增生从生物学角度看，主要表现在两方面：一是肿瘤细胞的不灭性，即细胞凋亡障碍；二是细胞增殖失控，程序发生紊乱，只是增殖超常加快。这两方面均已成为肿瘤发生发展研究的热点。通过研究发现了1.存在于正常细胞内的原癌基因发生错误转变为癌基因2.一些基因失活后正常细胞转变为癌细胞抑癌基因。经过70年代的癌基因时代，80年代的抑癌基因时代90年代的多基因时代或癌基因蛋白网络时代，提出了一系列的理论：肿瘤多步骤里论、DNA修复理论、细胞凋亡理论，进一步阐明细胞周期核心机制、细胞周期启动机制

19、、细胞周期检测点机制。,七、肿瘤与细胞周期,2、肿瘤细胞中细胞周期检控机制的破坏细胞周期中检测DNA损伤的检测点至少有两处：一处在G1-S过渡期：控制进入S期的检测点，防止DNA受损细胞进入S期的DNA复制。另一处在G2-M过渡期：控制进入M期的检测点，防止受损的DNA和未完成复制的DNA进入有丝分裂。这些DNA损伤检测点的主要机制有二：一是p53依赖性机制，另一是p53非依赖性机制每一个完整的检测点应由四部分组成，即发现或传感器（detect或sensor）、制动或拘留（stop or arrest）、修复（repair）、决定（decision，divide or death）。理论上说监

20、测点的任何一部分出了问题，都会导致功能的异常，结果是遗传不稳定，基因受损的细胞存活和复制或细胞遗传物质的改变，如此细胞多步骤进化，最终成为失控性生长的肿瘤细胞。,3、肿瘤细胞中细胞周期驱动机制的破坏细胞周期监测点功能的减弱，导致突变基因的累积和正常细胞的进化，只有当这些累积的突变基因破坏了细胞周期驱动机制，细胞才能进入失控性生长的境界。人们把细胞周期驱动机制比作一辆汽车或引擎，驱使其运行的因素好比“油门”；制动器运行的机制犹如“刹车”。持续地踏住“油门” 或“刹车”失灵，终将失控。这正是致变因素导致基因突变，检测点基因突变，突变基因累积，驱动机制失控的必然结果。,肿瘤的发生发展过程中，监控机制

21、破坏的典型例子是P53基因的突变。大约50%的人类肿瘤都存在P53基因的突变，说明DNA损伤检测点在肿瘤的发生、发展中，具有重要的位置。,From: British J. Cancer 87:129-133,1:222-231,Mutation of G1/S regulators in human cancer,八、常用的细胞周期检测方法,流式细胞术,PI(碘化丙锭),可以与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同,因此,通过流式细胞术PI染色法对细胞内DN

22、A含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期,S期和G2/M期,并可通过特殊软件计算各时相的百分率:G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N),G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N),S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。值得注意的是,PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞),在标本制备时,必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合。乙醇通常为终浓度为70%的冷乙醇。,将肿瘤细胞以1106接种于60mm培养板，80汇合后传代。2472小时后用胰酶消化收集细胞，PBS洗两遍，弃上清，加入70预冷乙醇中，吹打均匀，4固定

23、12小时以上。PBS洗涤去乙醇，1000rpm, 5min，洗两遍。0.5 ml PBS重悬细胞，加入PI和 RNaseA至终浓度50g/ml，37 温浴30 min。用流式细胞仪测定周期。PI：碘化丙啶，以PBS配成1mg/ml，4保存。RNaseA：10mg/ml,D、方法：,G2,M,G0,G1,s,0,200,400,600,800,1000,s,DNA Analysis,DNA content,Count,Normal Cell Cycle,Purdue University Cytometry Laboratories,G1,S phase,G2,M,G1,1,2 1,DNA co

24、ntent,The Cell Cycle,DNA content by flow cytometry,Deconvolution into cell cycle phases,G0/1,G2/M,S,Events,Measurement of sub G0/1 apoptotic particles,DNA content,Events,Events,G0/1,G2/M,S,Apoptosis,4 hr, control,28 hr, irradiated,G1: 94.1%S: 1.5%G2/M: 4.4%,G1: 94.1%S: 1.1%G2/M: 4.8%,G1: 60.6%S: 34.

25、9%G2/M: 4.5%,G1: 96.6%S: 1.6%G2/M: 1.8%,10%,1%,90%,4%,28 hr, control,28 hr, aphidicolin,O hr,6 hr,12 hr,18 hr,24 hr,93.5%,86.5%,58.5%,21.0%,2%,Induction of p21 results in parallel loss of NPAT foci, down-regulation of histone gene expression and inhibition of S phase entry (1),2 hr,4 hr,6 hr,8 hr,10

26、 hr,12 hr,14 hr,24 hr,0 hr,G1: 47.2%S: 34.2%G2/M: 18.7%,G1: 46.3%S: 34.9%G2/M: 18.8%,G1: 51.9%S: 29.8%G2/M: 18.4%,G1: 56.1%S: 23.9%G2/M: 20.1%,G1: 57.8%S: 17.8%G2/M: 24.5%,G1: 58.5%S: 12.5%G2/M: 29.0%,G1: 60.2%S: 6.8%G2/M: 33.0%,G1: 60.0%S: 3.9%G2/M: 36.1%,G1: 62.1%S: 2.4%G2/M: 35.5%,B.,A.,2、BrdU掺入法

27、 (S phase),A、原理： 在含有5溴脱氧尿嘧啶核苷（5Bromodeoxyuriding，BrdU）的培养基中，BrdU能取代胸腺嘧啶脱氧核糖核苷（TdR）而渗入到新复制的DNA子链中， B、染色要点：短时标记 C、主要用于检测生长中的细胞(S期),G0,G1,S,G2,Prometaphase,Anaphase,Cell cycle-dependent change of NPAT loci in WI38 cells,九、细胞周期同步化,1、自然同步化多核体：如：粘菌、疟原虫。某些水生动物的受精卵：如海胆、海参、两栖类。增殖抑制解除后的同步分裂：如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们

28、一起发芽，同步分裂。,细胞同步化(synchronization)是指在自然过程中发生或经人为处理造成的细胞周期同步化,2、人工同步化,1) 选择同步化A. 有丝分裂选择法：M期细胞与培养皿的附着性低，振荡脱离器壁收集。优点：操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害。缺点：获得的细胞数量较少（分裂细胞约占1%2%）。B. 细胞沉降分离法： M期细胞体积大，可用离心分离。优点：可用于任何悬浮培养的细胞。缺点：同步化程度较低。,2) 诱导同步化DNA合成阻断法：选用DNA合成的抑制剂，可逆地抑制DNA合成。常用TDR双阻断法：在细胞处于对数生长期的培养基中加入过量TDR（Hela 2mol/L；CHO 7.5mol/L）。S期细胞被抑制，停在G1/S交界处。移去TDR，释放时间大于TS时，再次加入过量TDR。优点：同步化程度高缺点：产生非均衡生长，个别细胞体积增大。中期阻断法用秋水仙素等细胞分裂抑制剂将细胞阻断在中期。优点：无非均衡生长现象，缺点：可逆性较差。血清饥饿法,