高效液相色谱讲义课件.ppt
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1、第七章 高效液相色谱法,第一节 概述,一、史程、专用术语,二、色谱分离过程和类型,液固吸附色谱,液液分配色谱,离子交换色谱,离子对色谱,空间排阻色谱,第七章 高效液相色谱法第一节 概述一、史程、专用术语二、色谱,三、色谱流程和仪器,三、色谱流程和仪器,四、HPLC的特点,速度快,分辨率高,灵敏度高、柱子可反复使用,四、HPLC的特点速度快,分辨率高,灵敏度高、柱子可反复使用,第二节 基本理论,一、色谱分离过程,(一)液-固吸附色谱,流动相为液体,固定相为固体吸附剂,根据物质吸附作用的不同来分离物质。,第二节 基本理论一、色谱分离过程(一)液-固吸附色谱流动相为,流动相和固定相都是液体的色谱法即
2、为液-液色谱,是利用样品组分在两种不相溶的液相间的分配来进行分离。一种液相为流动相,另一种是涂渍于载体上的固定相。,(二)液-液分配色谱,流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相分配色谱法,流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相分配色谱法,流动相和固定相都是液体的色谱法即为液-液(二)液-液分配色谱,(三)离子交换色谱,(四)离子对色谱法,(五)分子排阻色谱法,(三)离子交换色谱(四)离子对色谱法(五)分子排阻色谱法,二、色谱流出曲线和保留值,(一)色谱流出曲线及相关术语,(二)保留值,二、色谱流出曲线和保留值(一)色谱流出曲线及相关术语(二)保,高效液相色谱讲义课件,三、分离度
3、,三、分离度,第三节 定性和定量分析,一、定性分析,(一)利用已知物对照法定性,1、利用保留特性,2、利用不同柱比较,第三节 定性和定量分析一、定性分析(一)利用已知物对照法定性,(二)色谱法和其他方法结合定性,1、利用化学反应定性,2、利用二极管陈列检测器,3、收集峰的流出物,4、HPLC-MS,(二)色谱法和其他方法结合定性1、利用化学反应定性2、利用二,二、定量分析,(一)峰面积或峰高的测量方法,1、手测峰高,2、峰高乘半峰宽,3、剪纸称重,4、积分仪测定,5、微处理机测定,二、定量分析(一)峰面积或峰高的测量方法1、手测峰高2、峰高,(二)定量方法,1、峰面积归一法,2、外标法,3、内
4、标法,4、内加法(或追加法),(二)定量方法1、峰面积归一法2、外标法3、内标法4、内加法,第四节 高效液相色谱的分离模式,一、基本原理,二、分类,1、吸附色谱,2、分配色谱,3、离子交换色谱,第四节 高效液相色谱的分离模式一、基本原理二、分类1、吸附,4、分子排阻色谱,5、亲和色谱,三、HPLC在生物大分子中的应用,在生物大分子中的HPLC中,体积排阻色谱,离子交换、反相液相和亲和色谱是最常用的分离模式。,4、分子排阻色谱5、亲和色谱三、HPLC在生物大分子中的应用,第五节 液-固色谱法,液-固色谱法通常称为吸附色谱,1、载体:硅胶,2、吸附剂吸附试样的能力,3、原理,第五节 液-固色谱法液
5、-固色谱法通常称为吸附色谱1、载体:硅,第六节 键合相色谱法,一、正相色谱法,1、在正相色谱法中共价结合到载体上的基团都是极性基团。,2、分离机制属于分配色谱,3、主要用于分离极性不同的化合物,特别是用来分离不同类型的化合物。,第六节 键合相色谱法一、正相色谱法1、在正相色谱法中共价结合,二、反相色谱,1、分离机理,2、固定相,3、流动相,二、反相色谱1、分离机理2、固定相3、流动相,第七节 离子交换色谱,离子交换色谱是以离子交换树脂作为固定相,树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团,当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时,组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换,根据组分离子对树脂
6、亲和力不同而得到分离。按结合的基团不同,离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。,第七节 离子交换色谱离子交换色谱是以离子交换树脂作为固定相,,种类,阳离子交换树脂,强酸性,弱酸性,阴离子交换树脂,强碱性,弱碱性,种类阳离子交换树脂强酸性弱酸性阴离子交换树脂强碱性弱碱性,离子交换层析适用性,能在水溶液或含水极性溶剂中产生游离离子基团的酸、碱及两性成分。可用于氨基酸、肽类、生物碱、有机酸、酚类等水溶性成分的分离。,离子交换层析适用性 能在水溶液或含水极性溶剂中产,使用离子交换剂使物质分离表 样品 强酸型(磺酸型) 稀NH4OH洗脱 通过液 酸性、中性化合物 解离型、两性化合物 稀NaO
7、H洗脱 强碱型(季铵型) 强碱型 稀HCl洗脱 通过液 通过液 酸性化合物 中性化合物 解离型物质 两性化合物 (盐、生物碱),使用离子交换剂使物质分离表,一、离子交换色谱的分离机理,1、,不足之处:忽略了在填料表面上形成复合物时溶质被流动相中小分子饱和并不断进行计量置换反应的重要因素。,一、离子交换色谱的分离机理1、不足之处:忽略了在填料表面上形,2、,P0:流动相中溶质的浓度,Pb:填料表面上被吸附的溶质浓度,D0:流动相中洗脱剂的浓度,Db:填料表面上洗脱剂的浓度,Z:是蛋白质在吸附过程中从填料表面上被置换的洗脱剂的数目。,2、P0:流动相中溶质的浓度Pb:填料表面上被吸附的溶质浓度,
8、Z可以小到忽略不计,反应常数变为分配系数, 在Z值不能忽略时, Z可以小到忽略不计,反应常数变为分配系数 在Z值不能忽,在等度洗脱蛋白质的过程中,容量因子K与保留体积成比例,同时洗脱过程中,Kd, Db是常数,用Kz表示。,在等度洗脱蛋白质的过程中,容量因子K与保留,3 结论,二、离子交换色谱的固定相,1、高分子类型填料, 优点,a填料的使用寿命长,b具有较高的色谱容量,c 很少有非特异性吸附,对于保持样品生物活性有利。,3 结论二、离子交换色谱的固定相1、高分子类型填料 优点a, 结构,以交联共聚的苯乙烯-二乙烯苯为基质,同时也出现了许多其他交联高聚物基质的固定相。, 类型,Mono Bea
9、ds,TSK-gel DEAE-5PW,SP-5PW,CM-5PW, 结构以交联共聚的苯乙烯-二乙烯苯为基质,同时 类型Mo,2、无机基质型,三、离子交换色谱的流动相,1、流动相的PH值, 离子交换容量受流动相的PH值影响,2、无机基质型三、离子交换色谱的流动相1、流动相的PH值, 改变流动相PH值,也会影响弱电离的酸性或碱性组分的电离情况,因而改变组分的保留值。,流动相PH值的变化也能改变分离的选择性, 对流动相PH值的控制,通常采用缓冲溶液来实现。, 改变流动相PH值,也会影响弱电离的酸流动相PH值的变化,2、流动相的离子强度,四、离子交换色谱的影响因素,1、填料孔径的影响,2、柱长的影响
10、,3、流速的影响,4、PH值的影响,2、流动相的离子强度四、离子交换色谱的影响因素1、填料孔径的,无论在强的还是弱的阴离子交换柱上,蛋白质均显示不同PH值影响结果,因此决定了它的保留选择性、分离度和回收率等因素。,无论在强的还是弱的阴离子交换柱上,蛋白质,5、离子强度的影响,第八节 体积排阻色谱法,一、分离机理,1、体积排阻色谱法(SEC) 或空间排阻色谱法(SEC) 或凝胶色谱法,2、凝胶过滤色谱法(GFC),5、离子强度的影响第八节 体积排阻色谱法一、分离机理1、体,Sephadex 葡聚糖凝胶,Sephadex 葡聚糖凝胶,3、凝胶渗透色谱法(GPC),4、空间排斥理论,3、凝胶渗透色谱
11、法(GPC)4、空间排斥理论,V0 死体积,相当于凝胶的粒间体积,Vs 色谱柱中凝胶的孔穴总体积,V0 死体积,相当于凝胶的粒间体积Vs 色谱柱中凝胶的孔穴,二、体积排阻色谱法的特点,二、体积排阻色谱法的特点,三、体积排阻色谱法的固定相,(一)固定相的分类,1、按固定相基质分类,2、按固定相机械强度分类,三、体积排阻色谱法的固定相(一)固定相的分类1、按固定相基质,(二)凝胶固定相的特性参数,1、渗透极限,2、分离范围,(二)凝胶固定相的特性参数1、渗透极限2、分离范围,3、固流相比,在SEC中常将柱中凝胶孔体积中的溶剂称为固定相,而将柱中凝胶颗粒间空隙体积中称为流动相,而凝胶孔体积与凝胶颗粒
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