第六章实验方法的选择与检测系统的评价验证ppt课件.ppt

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1、,生物化学检验,第五章 实验方法的选择与检测系统的评价验证,乐山市中医医院吴林军,2,3,3,4,2,3,4,实验方法的选择,检测系统性能验证和确认,检测系统性能的评价方法,试剂盒的选择,5,检测系统的持续有效性,主要内容,临床实验室的核心工作是为临床提供准确及时的检验信息，而实验方法的改进与选择和检测系统的性能评价即是此项工作的基础。为确保所选择的实验方法或检测系统的检测结果符合临床要求并具备可比性，能客观地反映被检测者的生理和病理状况，实验室工作人员应对实验方法进行严格的评估和选择，并对所组成的检测系统通过实验途径进行系统的性能评价，保证检测系统的持续有效性,第一节 实验方法的选择,2,3

2、,3,4,2,3,4,实验方法的分级,实验方法选择的步骤,实验方法选择的原则,实验方法选择的目的,一、实验方法的分级,国际临床化学协会（international federation of clinical chemistry，IFCC）将临床检验的诸多方法根据其准确度与精密度的不同分为三级 决定性方法 参考方法 常规方法,一、实验方法的分级,（一) 常规方法 常规方法（routine method）指性能指标符合临床需要，有足够的精密度、准确度、特异性和适当的分析范围，经济实用的检验方法 目前临床实验室开展的检验项目的检测方法大多属于常规方法。常规方法在作出评定以后，经有关学术组织认可，可

3、以作为推荐方法,一、实验方法的分级,(二) 参考方法 参考方法（reference method）是指准确度与精密度已经被充分 证实，且经公认的权威机构（国家主管部门、相关学术团体和国 际性组织等）颁布的方法。这类方法干扰因素少，系统误差与重复测定中的随机误差相比可以忽略不计，有适当的灵敏度和特异度、较宽的分析范围并且线性良好 参考方法可以在生产厂家和临床实验室使用，条件许可的临床实验室也可用参考方法进行常规分析，主要用于鉴定常规方法，评价其误差大小、干扰因素并决定是否可以被接受；用于鉴定二级标准品、对质控血清定值和对商品试剂盒的质量评价等,一、实验方法的分级,(三) 决定性方法 决定性方法（

4、definitive method）是准确度最高、系统误差最小、经过研究证明尚未发现其不准确度或不精密度的方法，其测定结果与“真值”最为接近。属于这类方法的主要有重量分析法、中子活化法、同位素稀释-质谱分析法(ID-MS)等 由于技术要求太高，费用昂贵，这类方法并不直接用于临床检验，也不用于鉴定常规方法的准确性，主要用于评价参考方法和对一级标准品定值，具有权威性,一、实验方法的分级,二、实验方法选择的目的,实验方法选择的根本目的：1.各实验室按照方法选择的原则、结合自身条件，确定合适某项目的的检测方法2.保证拟使用的检测方法在正式应用于临床分析病人标本之前，对方法分析性能及可能引入的误差进行了

5、解，作出初步评估,三、实验方法选择的原则,选择实验方法要根据临床需求，结合实验室的条件和检测要求确定适当的方法。常规方法应具有实用性和可靠性两方面的性能指标，至于某一项具体分析方法所应具有的性能标准，可由临床实验室根据采用这一试验的目的决定 1.实用性 2.可靠性,临床实验室对所选择的新的实验方法，在用于检测病人标本前必须对其分析性能进行验证或评价，证实其能满足临床和实验室要求的性能后方可用于临床检测。 1.提出要求 2.收集资料 3.选择候选方法,四、实验方法选择的步骤,4.确定质量目标 实验室采取的质量目标应根据其服务的群体、实验的特定应用、以及临床需求的不同而有所不同。质量目标应参照中华

6、人民共和国卫生行业标准（WS/T403-2012临床生物化学检验常规项目分析质量指标）。未有标准的项目可参照美国实验室改进法案（CLIA88 ）中推荐的总允许误差、国际专业团体、国家、或专家推荐性指南文件的要求5.进行初步评价,四、实验方法选择的步骤,第二节 试剂盒的选择,2,3,3,4,2,3,试剂盒的类型,试剂盒的使用,试剂盒的选购,试剂盒是用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等化学试剂的成套试剂 生化试剂盒按剂型分类可分为液体试剂、干粉试剂、干片试剂、一次性试剂包等，液体试剂在临床实验室中应用最为广泛 1.液体单试剂 2.液体双试剂,一、试剂盒的类型,选购试剂盒时一般应考虑以下原则：

7、1.方法特异性好、灵敏度高、准确度和精密度质量标准2.对试剂盒的包装、理学性能、方法学性能充分了解，确认性能 参数符合试剂说明书承诺和本实验室的要求3.国家食品与药品监督管理局(CFDA)的批准文号4.配套使用的校准品，校准物质符合标准和要求，最好能提供溯源性的材料和说明5.试剂盒的有效期至少一年6.试剂对环境的污染小，对工作人员无明显毒害作用，无强烈腐蚀性,二、试剂盒的选购,试剂盒在使用前和使用过程中应关注以下内容：1.查阅说明书2.理学检查3.稳定性4.均一性5.性能评价,三、试剂盒的使用,1. 适用性,（1）微量快速 适用于急诊和成批分析。 （2）方法简便 无需特殊培训，试剂种类少，易于

8、自动化分析。 （3）安全可靠 试剂无毒害，保存简便。 （4）成本低廉 试剂、仪器和辅助设备成本。,2 可靠性,具有较高的精密度、准确度和特异性，以及较大的检测范围。精密度：不精密度一般应小于3%。准确度：不准确度一般应小于5%。特异性：尽可能只对待测物特异。检测范围：能适合正常和大多数病理标本。,性能评价是保证检测系统完整性、有效性的重要手段。检测系统（包括检测仪器、配套校准品、试剂、运行环境等）的性能评价是方法学评价的具体实施。当实验室建立新的检测系统或完整检测系统中任一组合发生改变或运行中的检测系统在新项目应用之前、仪器重要参数发生变化、更换新的试剂盒等时，都应对系统性能进行评价 性能评价

9、的主要内容一般包括：精密度、正确度、线性范围、检测限、抗干扰能力、生物参考区间等,第三节 检测系统性能的评价方法,第三节 检测系统性能的评价方法,2,3,3,4,2,3,4,精密度的评价,检出限的验证,可报告范围评价,正确度的评价,5,生物参考区间的验证,精密度(precision)是指测量程序在相同条件下，对同一样本进行连续多次测量时所得结果之间的一致性，是表示测定结果中随机误差大小程度的指标通常用标准差(standard deviation，s)和/或变异系数 (coefficient of variation，CV)的大小来描述不精密度，从而度量精密度的大小。标准差或变异系数愈小，表明精

10、密度越好，检测结果重复性越好。重复性试验是评价精密度的常用方法，包括批内精密度试验和日间精密度试验,一、精密度的评价 重复性试验,(一) 基本方法1.批内精密度试验 是指在相同条件下，对同一样本在尽可能短时间内进行多次重复测定。将实验样本随机插入常规患者样本 中进行检测，一批内重复测定20次，计算均值、标准差、变异系数2.日间精密度试验 是将同一样本分成数份，随机插入常规患者 样本中，每天测定一次，最少连续测定20天，计算均值、标准差、变异系数,一、精密度的评价,基本方法 对同一材料分成数份试验样品，进行多次分析测定，一般为20次。 批内重复性： 20次测定，计算x、s、cv%。批间重复性：一

11、天内分数批重复20次测定，计算x、s、cv%。一般分5批每批作4次测定。cv%比批内大。日间重复性：每天1次，重复20天，计算x、s、cv。其cv反映实际工作情况。cv比批间大。,(二) 注意事项试验条件要稳定 要尽量保证在相同条件下，即在同一检测系统 下（包括测量程序、人员、仪器、环境等）以及在测量条件保持不变的条件下规定时间内完成，每次实验过程均应有质量控制2. 实验样本应与真实标本有同样的基质 可使用稳定的冷冻血清或血浆，也可选用稳定性好、以血清为基质的质控品或校准品3. 检测系统应处于良好状态 进行重复性试验的样本浓度宜选择在医学上具有决定性意义的浓度水平，通常选择23个不同浓度水平的

12、试验样本医学决定水平，就是临床上按照不同病情给予不同处理的指标阈值。,一、精密度的评价,(三) 性能可接受性判断 将计算得到的标准差参比国家行业标准（WS/T403-2012临床生物化学检验常规项目分析质量指标）或与美国CLIA88规定的总允许误差进行比较。批内不精密度CV应小于CLIA88允许误差的1/4，日间不精密度CV应小于CLIA88允许误差的1/3作为评价标准,一、精密度的评价,(四) CLSI的EP5-A2精密度评价方案介绍 美国临床和实验室标准化协会（CLSI）制定了一系列标准和指南。其中，EP5-A2文件定量测量方法的精密度性能评价，是目前精密度评价实验方案中最全面和最具统计学

13、效能的。主要用于厂商新开发的检测方法或仪器精密度的评价；临床实验室用于对所用自建检测系统或更改了FDA批准的检测系统的精密度性能进行评价。该方案采用2220的实验方法，即每天检测2批，每批检测2次，共进行20天，获得80个有效数据。方案同时提供了直观实用的记录表格，通过计算可得到批内、批间、天间及总不精密度。如果大于厂家声明要求，仍可通过检验来判断是否具有显著性差异，如无显著性差异仍是可以接受的,一、精密度的评价,(五) CLSI的EP15-A2文件简易评价方案 EP5-A2精密度评价的实验方案对于临床实验室来说实验过程繁琐，统计较为复杂。EP15-A2文件用户对精密度和正确度性能的验证方案，

14、可以使临床实验室通过最小的努力即可验证厂家声明的精密度性能,一、精密度的评价,EP5-A 精密度评价方案介绍,1. 实验标本每天测定2次（2次测定间隔不得少于2小时），每次测定均作双份，共测定20天，收集80个数据（见表3-5）。2.统计处理 每双份的差值（批内差）反映了批内精密度 每天2次均值的差值反映了天内的精密度 20天有20个批间差，减去批内差，反映了批间精密度 ,正确度（trueness）是大批检测结果的均值与真值的一致程度。正确度通常用偏倚（bias）表示，已经消除了不精密度的影响准确度 (accuracy) 是检测结果与被测量真值之间一致的程度。测量准确度与测量正确度和精密度有关

15、。准确度量化为不准确度，实际反映的是分析总误差 在临床实验室工作中，由于检测的样品是源自人体的标本，成分和结构复杂，对正确度的评价，可以采用多种方法，从不同角度进行评价。常用的方法有回收试验、干扰试验和方法比对试验,二、正确度的评价,准确度的评价,（一）准确度评价指标有：方法比较试验、回收试验和干扰试验。（二）方法比较试验 实验方案：EP9-A2 1. 基本方法：用两种方法同时对一组新鲜标本进行测定，根据测定结果的差异，得到恒定或比例系统误差。 2. 实验要点： （1）比较方法的选择：尽可能选择性能高的方法，如参考方法。 （2）实验标本与测定（见定量检测的方法学比对） 标本例数、浓度分布、测定

16、时间、测定顺序,比例系统误差,恒定系统误差,比较方法结果,试验方法结果,3. 结果分析,理想情况,4. 临床可接受判断：SE TEa 为可接受水平。,(一) 回收试验 回收试验是指在己知浓度的样本中加入不同浓度的已知被测物质，然后用被评价方法或被评价的检测系统测定被测物质的浓度，最后计算实测浓度与加入浓度之比，以回收率评价检验方法或检测系统的比例系统误差,二、正确度的评价,1. 基本步骤,将被分析的纯品标准液加入样品中，成为分析样品。原样品加入同量的无分析物的溶液作基础样品。然后用实验方法分析，两者测定结果的差值为回收量。,3,2. 回收率计算,加入浓度= 标准液浓度 回收浓度 = 分析样品测

17、得浓度 基础样品测得浓度回收率（%）= 一般要求回收率95-105% 比例系统误差 = 100% - 平均回收率%,3,回收率接近100 分析不受基质影响。 无论在纯溶液还是复杂的基质环境中，分析方法的反应能力是一样的。（准确度不受影响）回收率明显偏离100 分析明显受不同的基质影响。 在不同的基质环境下，分析方法的反应能力有明显差异。（准确度受影响）,回收率的理解：,基质：分析样品中，除了被测物质之外的，都称为,3. 试验要点,（1）加入标准液的体积在整个样品中要少于等于10% 。（2）要准确吸量。一般每样品重复测定2-3次取均值。（3）分析样品浓度必须在测定方法的分析范围内。一般需做高中低

18、三个浓度的回收试验，计算平均回收率。（4）分析样品浓度最好在医学决定水平上。,可接受判断 一般：SE + RE TEa,(二) 干扰试验 干扰试验是通过定量检测样本中物质所引起试验方法的系统误差，以评价方法的正确度。干扰物质引起的误差通常是恒定系统误差，与分析物浓度无关 由于干扰物质的种类很多，影响因素非常复杂，到目前为止，实验室只能对极少数的干扰物做出评价,二、正确度的评价,(二) 干扰试验 干扰物对检测结果的影响是临床实验室的一种常见现象，消除干扰的最常用方法是空白实验和采用双波长或多波长检测排除干扰。当误差较大又无法消除时，应对检测方法进行改进或更换新的检测方法,二、正确度的评价,2.

19、方法 基本与回收试验一样，但是加入的是疑有干扰或非特异性反应的物质。,4,干扰物,测定物,3. 可疑干扰物的浓度 应达到病理标本的最高浓度值，在确证有影响后，还应确定使分析结果影响临床应用价值的最低干扰物质浓度值。,4. 被试验的物质： 可根据该方法的反应原理，提示出可能的干扰物，一般应考虑的是用高胆红素、溶血（血红蛋白）、脂浊、防腐剂、抗凝剂等进行试验。但干扰试验有一定的局限性，因为人们只能试验某些物质的影响，还有许多药物和食物成分可能有干扰。,(三) 方法比对试验 方法比对试验是指把试验方法（待评价方法）与比对方法（参考方法）进行比较，从测定结果间的差异了解待评价方法的检测结果的偏倚。如果

20、偏倚在允许误差范围内，说明待评价方法替代原有检测方法不会给病人的检测结果带来明显偏倚。这样的试验叫比对试验。方法比对试验是评价系统误差的性质（恒定或/和比例误差）,二、正确度的评价,1.基本方法 CLSI的 EP9-A2文件用患者样本进行方法学比对及偏倚评估，是目前最重要、也是最常用的正确度评价方案。该方案主要用于新的检测系统或测定方法，或更换新的试剂盒或新仪器在进行病人样本检验前，以了解新的检测系统或方法与原有的检测系统或方法之间的检验结果是否一致，即确定两个检测系统或方法测定结果的偏倚是否在可接受的范围内,二、正确度的评价,2.简易方法 CLSI的EP15-A2文件用户对精密度和正确度性能

21、的验证方案，可以使临床实验室通过最小的努力即可验证厂家声明的正确度性能。(1)样本制备：选择20份病人的新鲜样本，所含分析物浓度分布于实验方法的整个线性范围，不使用分析物浓度超出检测范围的样本(2)样本检测：在34天内用试验方法和比对方法分别检测这20份样本。 每天测定57份样本，应在同一天的4h内检测完毕，并都有质量控制程序保障(3)统计学处理(4)估计的偏倚与厂家声明的偏倚比较,二、正确度的评价,(四) 定值参考物检测 CLSI的EP15-A2文件提供了另一种通过检测定值参考物质来计算回收率，判断是否与厂家声明或其他规定的性能要求一致来验证正确度。 1.定值参考物质来源 (1)已用参考方法

22、或决定性方法定值的新鲜冰冻人血清或其他一些未掺入成分的材料和有证参考物质 (2)从能力验证试验（PT）中获得的参考物 (3)厂商提供的正确度确认物或质控物 (4)室间质量评价计划中使用的质控物 (5)由第三方提供的已用一些不同方法定值的物质,二、正确度的评价,2.评价程序：选择适合评价的检验方法最易获得的定值材料，至少要求测定2个水平，选择的水平应能代表该方法的最低和最高测量范围。试验前充分混匀分析物，用试验方法重复测定2次，将检测结果与说明书标示值或靶值进行比对，计算偏倚，使用参考物质核实正确度的可接受性区间判断或以CLIA88允许误差的1/2作为评价标准，如果偏倚小于CLIA88允许误差的

23、1/2，就可以认为临床可接受，新检测系统或新方法可应用于临床,二、正确度的评价,定量测定的方法学比对,ISO15189规定：当同样的检验应用于不同的程序或设备，或在不同地点进行，应有确切机制以验证在整个临床适用的区域内检验结果的可比性。 （简单地说：一个检验项目在不同仪器、方法、地点检测，应该得到相同的结果。） 比对方案：CLSI EP9-A2文件“用患者标本进行方法学比较和偏倚评估批准指南” （ CLSI 美国临床和实验室标准研究院 ）,进行EP9-A2的准备和步骤：1. 熟悉检测系统，熟悉评价方案。2. 对整个过程进行质量控制。3. 至少应有40份患者新鲜标本，这些标本应涵盖线性范围，不要

24、收集对实验有干扰的标本。4. 按标本号1、2、3、4、5、6、7、8测定一次，然后8、7、6、5、4、3、2、1测定一次，不同检测系统同时进行。5. 剔除离群值，绘制散点图，建立线性回归方程。6. 判断是否可接受。,定性试验的方法学评价,（一）评价准备 熟悉实验方法，选择合适的试剂，使用质量控制，使用阴阳性对照（二）定性试验重复性评价 1. 确定方法的临界值（cut-off），是判定阴性阳性的分界点。 2. 准备 临界值20%浓度标本。 3. 分别测定以上标本20次，记录阴性阳性结果。 4. 测定结果阴性和阳性结果应该各占一半。 5. 结论：测定结果阴性和阳性结果应分别大于95%,了解,定性试

25、验方法学比较样本种类和数量 患者新鲜标本，稳定。阴性和阳性标本应分别在50例以上。2. 实验过程 在常规条件下，10-20天完成。3. 以符合率进行结果描述。,了解,可报告范围（reportable range）指实验室可建立或验证检测系统测量响应准确度范围内得到检验结果的量值范围，相当于分析测量范围分析测量范围（Analytical measurement range, AMR）指患者样本没有进行任何预处理(稀释或浓缩等)，检测方法能够直接测定出待测物的范围，在此范围内一系列样本分析物的测量值与其实际浓度呈线性比例关系,三、可报告范围评价,线性范围(linear range)是指覆盖检测系统

26、的可接受线性关系的范 围。可报告范围、分析测量范围和线性范围是不同组织或专业团体对检测系统在一定范围内给出可靠检验结果能力的描述，表达方式不一，但其内在含义是相同的临床可报告范围（Clinical reportable range, CRR）是指定量检 测项目向临床能报告的检测范围，患者样本可经过稀释、浓缩或其他预处理，结果乘以稀释或浓缩倍数，是分析测量范围的延伸,三、可报告范围评价,线性范围评价试验 线性范围评价是观察一种检测方法或一个检测系统的检测范围。通过该实验可以了解其最高的检测值(上限)和最低检测值(下限)，是对病人检测结果可报告范围的一种评价,三、可报告范围评价,线性试验基本步骤（

27、一）实验前准备1.试验样本 (1)混合患者血清(2)在血清中加入一定量的待测物，得到高浓度的线性样本，高浓度样 本应接近或稍高于检测范围上限(3)经特殊处理的混合人血清，用透析、热处理、层析等方法制备低值样本使其接近检测范围下限(4)标准品、商品化质控物或能力验证材料,三、可报告范围评价,2.确定浓度范围，在相同条件下，对以上样本作多次重复测定，最 后分别求出其均值作为这两个样本浓度。按比例混合，使之成为一系列不同的分析物浓度。一般要求56个即可（二）样品检测 以上样本用被评价的方法分别进行检测，并在一天内完成，检测序列应为随机排列，每个样本重复测定34次，计算其平均值,三、可报告范围评价,(

28、三) 实验数据统计分析图形初步分析以预期值(X)为横坐标，以实测均值(Y )为纵坐标，手工绘制通过整个分析范围点与点之间的连线，可目测观察是否具有直线关系2.平均斜率法 若所有实验点呈明显直线关系，用直线回归统计对数据处理，求出直线回归方程,理想状态下，该直线为一条斜率b1为1，截距b0为0，即通过原点0的直线。一般要求实测值与理论值偏倚小于10%，b110.03，b0接近于0，相关系数r0.975，则可直接判断该评价方法或被评价检测系统可报告范围在实验已涉及浓度范围内呈线性，即可报告范围为所检测低值与检测高值之间。若b1不接近1，b0不接近0，应进行显著性检验,三、可报告范围评价,基本步骤,

29、（1）样品准备 ：评价标本的基质应与实际测定的标本相一致，理想的标本是病人的低值或高值标本。这往往不易收集到，亦可用病人的混合标本加入分析物作为高值标本，用正常人标本作为低值标本（必要时可作处理如分析物为酶可以加热，小分子化合物可以透析，脂类可用超离心或多价阴离子沉淀）。,浓度范围应以分析项目的线性要求为准。 线性评价应有5个不同浓度，可选择低值和高值标本各一个，低值标本为1号，高值标本为5号，二者3:1混匀为2号，等份混匀为3号，1:3混匀为4号，2-4号标本的浓度按下式计算： C2 = 1/5C1*3 +1/5C5*1 C3 = 1/5C1*2 +1/5C5*2 C4 = 1/5C1*1

30、+1/5C5*3,（2） 测定方法,5个样品各测定3-4次，结果进行统计分析，检验有无稀释变异，线性是否良好。,Y-1.9+1.08x,Y=-0.5+1.02x,可报告范围上限是50,（ b1.03 ）,例,预期值,实测值,预期值,实测值,举例,与标准曲线制作方法相同。在专用的标准曲线纸上画出标准曲线，并进行统计处理得出回归方程 y=a+bx 和相关系数（r）。 线性好差没有很客观的判断指标，r接近1为好，0.99以上？ 一般认为，如果b在0.97-1.03范围，a接近0，则可以判断测定方法可报告范围在实验所涉及的范围。,3.多项式回归法 根据EP6-A定量测定方法的线性评价方法， 采用多项式

31、回归作为分析线性的评价方法，该文件采用二元一次直线回归，二次与三次的曲线回归统计处理，以统计估计值与实际检测值的差异来判断。此方法可借助统计软件完成4.国家卫生行业标准（WS/T 408-2012临床化学设备线性评价指南2013年8月1日实施）,三、可报告范围评价,检出限（limit of detection，LoD）是指检测系统可检测出分析 物的最小值，也被称为“检测下限”，有时也用于指示“灵敏度”空白限（limit of blank，LoB）是指在规定的可能条件下，空白样品被观察到的系列检测结果的最大值临床实验室应对所用的检测系统或方法的检出限进行验证, 确保检测方法能满足厂商给定的LoD

32、。如不能确保厂商声明的LoD，实验室应和厂商联系，或建立自己的LoDCLSI的EP17-A文件确定检出限和定量检出限的方案，对如何建 立检验方法的检出限，如何验证厂商声明的检出限，提出了建议。此方案适合于所有定量检测项目,四、检出限的验证,验证LoD的程序1.试验样品 (1)空白样品 不含有待分析物的样品，常使用系列校准品中的“零标准”作为空白，理想的空白样品应和所检测的患者样本具有相同的基质 (2)检测限样品 验证方法的检测限时，在空白样品中加入分析物配制成检测限样品，使其浓度达到预期或厂家推荐的检测限浓度2.测定次数 CLSI指南建议验证厂商声明时至少做20次重复测量。数据尽可能来自各样本

33、并在数天内进行检测,四、检出限的验证,3.如果厂商提供了LoB，实验室应对空白样品重复检测，结果没有3个测量值超出LoB，则可直接使用厂商的LoB；若厂商不提供LoB，则应先估计LoB4.结果判断 若对具有相当于厂商给定的LoD浓度的检测限样品进行重复测量，估计其结果超过LoB的比例数。若比例与预期值（默认为95%）在95%可信限内，则说明实验数据支持厂商声明的LoD。否则，不能确认厂商声明的LoD，实验室应和厂商联系，或建立自己的LoD,四、检出限的验证,检测限评价,可检测的最低分析物浓度为检测系统的分析灵敏度或称检测限。 分析灵敏度：具有定性含义的 检测低限 具有定量含义的 生物检测限 功

34、能灵敏度,如果空白吸光度的波动服从正态分布规律，则95空白吸光度：空白均值2s空白 待测样品吸光度只有超过空白均值2s空白才被认为样品中有分析物99.7空白吸光度：空白均值3s空白 待测样品吸光度只有超过空白均值3s空白才被认为样品中有分析物,(一) 检测低限,空白管的波动原因：试剂空白的稳定性，比色皿的一致性，比色计的稳定性，,如：某5g/L分析物的吸光度落在 检测低限 5g/L,（定性）,（低于5g/L时其吸光度与空白吸光度有重叠，无法分辨）,对于患者标本的检测，稍大于检测低限的吸光度说明样品内有分析物，但是，这时还不能正确报告定量结果。因为是单次测定。 对于这个接近检测低限的样品做多次重

35、复测定，按照正态分布规律其响应值范围应该是X2s或X3s，即有50测定结果会“无分析物”，有50的测定结果“有分析物”。 那么多少检测吸光度时才能较好地报告定量结果呢？,XB-2sB XB,XB+2sB(检测低限）,50,50,(二) 生物检测限,对于多个接近检测低限的样品做多次重复测定，按照正态分布规律其吸光度值范围应该是X2s（或X3s），这些较均值小的值就有可能和检测低限（空白吸光度值的上限）交叉。 因此，这些样品检测吸光度的95（或99.7）单次检测吸光度的最低值也应该比检测低限大，从而保证样品在任何情况下，单次检测吸光度都不是空白吸光度，这些样品具有的分析物浓度才可以定量的报告。,空

36、白均值,XB+2sB,生物检测低限的定义： 某样品单次检测可能具有的最小吸光度刚大于检测低限吸光度，该样品内含有的分析物浓度为生物检测限。（可以定量报告结果的限值）,(三) 功能灵敏度,以日间重复测定的CV为20时，对应的检测限样品具有的平均浓度作为检测系统可定量报告的最低浓度。 需要多个检测限浓度的样品来做精密度试验，从中选择CV接近20的对应浓度，作为可定量报告的最低浓度值。,分析物浓度越低，精密度实验CV值越大。,2012年，卫生部发布了行业标准WS/T 404.1临床常用生化检验项目参考区间第1部分，并给出了参考区间应用的一般原则：临床实验室应首选本文件的参考区间；使用本文件的参考区间

37、前应按WS/T 402有关规定进行必要的验证和评估。首先对本实验室分析质量和服务人群进行评估，若有理由认为与参考区间研究的分析质量和参考人群有足够可比性，可直接使用本文件参考区间。若对分析质量和服务人群可比性不确定或实验室管理体系要求对引用的参考区间进行验证，可按如下进行：,五、生物参考区间的验证,（一） 实验前准备选择评价对象选择无任何已知疾病、近期内未用任何药物的健康 自愿者20名。必要时，可按不同的年龄段和性别进行分组，每组至少20名2. 采集标本 根据验证的检验项目和检验方法不同，采集标本时应排除影响检测结果的一些因素，如血液标本应禁食812h、采血前不能饮用任何饮品、不能服用任何药物

38、、禁烟、避免剧烈运动等。合理选择采血时间、采血方法、采血次序、加入抗凝剂的类别等,五、生物参考区间的验证,（二） 样本测定 根据实验室制定的标准操作规程检测（三）结果评价 按适当方法检查并剔除离群值（另选参考个体补足）后，若实验对象的测定值有95%以上在所选的参考值范围内，所选用的参考区间可以接受。即：若20例实验对象的所有测定值均在所选的参考范围以内，或超出所选参考区间的测定值不超过2例，所选用的参考区间通过验证。若有2例以上在参考区间以外，应另选20例观察对象重新进行验证，验证结果若符合要求，可直接使用参考区间，否则应查找原因,五、生物参考区间的验证,生物参考区间,（一）关于基本概念：参考

39、个体 根据临床的要求选择的检测个体；参考总体 所有参考个体的集合称；参考抽样组 一定数量的参考个体；参考值 对一个参考个体进行某项目的测定得到的一个测定值；,参考值范围 所有参考抽样组的各参考值合起来为；参考区间 所有参考值根据临床使用要求，经过统计归纳分析后，确定的是参考区间（是参考值范围的一部分）。,（二）参考区间的建立 1. 实验方案：建立新项目参考值范围和参考区间的计划 2. 选择参考个体怎样才算健康？各项目临床应用不同，对健康也有不同的规定。一般规定要排除的：饮酒、吸烟、高血压尽可能与使用该项目的患者分布组成相近的；除非有必要，不要选择门诊或住院患者。是否要分年龄组和性别组。 3.

40、做好参考个体分析前的准备尽量减少生物变异，避免引入干扰。,4、参考值数据的要求和分析,（1）建议至少每组要取120个参考值数据；（2）按照统计学要求舍取疑似离群点，如有离群点被剔除，应补足数据；（3）绘制分布图，了解数据的分布特性；（4）参考值数据分组要根据临床意义并作Z检验（p56）。,（三）参考区间的转移和验证,实验室引入外部实验室或厂家提供的参考区间的过程，称参考区间的转移。 实验室一般存在以下两种情况： （1）使用相同检测系统的参考区间的转移 （2）使用不同检测系统的参考区间的转移对于上述（1），可采用“用20个参考值数据进行验证”。对于上述（2），则采用EP9-A2进行方法比对和偏倚

41、评估。,2,3,3,4,2,3,检测系统及量值溯源,检测系统性能验证和确认的临床应用,检测系统性能的验证和确认,第四节 检测系统性能验证和确认,(一) 检测系统与量值溯源的概念 检测系统是指完成一个检验项目的测定所涉及的仪器、试剂、校准品、消耗品、操作程序、质量控制程序、设备维护程序等的组合。如果是手工操作，还应包括具体的操作人员 通过一条具有规定不确定度的不间断的传递链（或实验室间的比对等），使测定结果或标准值能够与规定的参考标准（通常是国家或国际标准）联系起来的特性，使得测定结果的准确性得到保证和验证，称为量值的溯源性,一、检测系统及量值溯源,(二) 量值溯源的基本原理,一、检测系统及量值

42、溯源,(三) 参考物量值溯源的意义 在临床实验室，用该参考物校准常规的检测系统，得到患者样本的分析物含量接近使用参考方法测定所获得的结果。因此，通过溯源的参考物校准常规方法，测定患者样本结果的准确性可溯源到参考方法。建立和保证检验结果的溯源性是实现检验结果准确性的有效手段，是实验室结果“互认”的前提,一、检测系统及量值溯源,新建立的检测系统必须进行验证、确认后才能应用于临床1.对检验系统的性能验证 验证（verification），即通过提供客观证据对规定要求已得到满足的认定。验证内容至少应包括正确度、精密度和可报告范围 适用范围：如果实验室采用的分析系统具有溯源性，即除仪器外与仪器配套的试剂

43、、校准品、质控品、消耗品等完全按照仪器生产厂商的要求建立，产品的分析性能已经过厂商详细评价，所有分析性能资料已被原产国有关监督机构认可并获得生产许可，且已获得SFDA的进口许可，实验室用该系统对患者的标本检测前，只需对该检测系统已被认可的性能进行验证,二、检测系统性能的验证和确认,2. 对检验系统的性能确认 确认(validation ) ，即通过提供客观证据对特定的预期用途或应用要求已得到满足的认定。确认内容主要包括正确度、精密度、检出限、可报告范围、生物参考区间等 适用范围：实验室如果要自建检测系统或对厂商完整的检测 系统中的任何一个组分做出改变(除非有充分证据证明这种改 变对该分析系统的

44、性能没有影响)都必须对该系统的性能进行全面确认,二、检测系统性能的验证和确认,1.对新建立的检测系统的性能进行确认或验证2.对检测系统在运行过程中的性能进行确认或验证,三、检测系统性能验证和确认的临床应用,2,3,3,4,2,检测系统运行环境的要求,检测系统各项指标的要求,第五节 检测系统的持续有效性,检验系统的运行环境要持续符合说明书要求： 仪器应安放在实验室的适当位置，周围有足够的工作空间，应避免灰尘、烟雾、电波、振动等的干扰；环境温度、湿度尽量保持恒定并符合说明书要求；应使用合适的不间断电源(UPS)；实验室应对仪器的运行环境实时监测并有有效的控制和纠正措施；临床实验用水能够得到满足供应

45、（CLSI,C3-A4文件）；生化分析仪的操作人员应有上岗证书并得到科主任授权后才可上岗操作 建立各种文件控制程序，并能根据这些程序文件具体实施,一、检测系统运行环境的要求,保证检测系统的各项指标持续符合要求。除在使用过程中定期或根据具体情况对检测系统的相应性能进行验证和确认，还应依据“中华人民共和国医药行业标准全自动生化分析仪”YY/T 0654-2008的要求。对全自动生化分析仪的硬件性能定期进行检定（每年至少一次或参照厂商说明），由临床实验室人员和生产厂家工作人员共同完成,二、检测系统各项指标的要求,实验室应根据自身条件确定合适的检验方法，并对检验方法的基 本性能进行评价，明确是否具有足够的性能来说明检测系统的可靠性及满足临床使用的要求测定结果的溯源性是指测定结果的可追溯性，临床实验室通过校准为检测系统确定标准值，也可通过实验室间的比对，实现一定 程度的可溯源性检测系统的性能评价是方法学评价的具体实施。检测系统用于临床检测前，应根据组成检测系统各要素的完整性对其性能做以验 证或确认,学习小结,验证即通过提供客观证据对规定要求已得到满足的认定。确认即通过提供客观证据对特定的预期用途或应用要求已得到满足的认定检测系统的运行环境和各项性能指标要保证持续符合要求,学习小结,