第一节沙门氏菌检验课件.ppt

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1、第一节 沙门氏菌检验,沙门氏菌是引起食物中毒的重要病原菌。在世界各国的各类细菌性食物中毒中,沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。在英国, 以沙门氏菌占首位。美国则为第2位,仅次于金色葡萄球菌。日本则以副溶血弧菌和金色葡萄球菌为最多,沙门氏菌占第3位。我国内陆地区也是以沙门氏菌为首位。世界上最大的一起沙门氏菌食物中毒是1953年于瑞典由吃猪肉而引起的鼠伤寒沙门氏菌中毒,7717人中毒,90人死亡。,第一节 沙门氏菌检验沙门氏菌是引起食物中毒的重要病原菌。在世,沙门氏菌属于肠杆菌科,至今已有2230种以上的血清型。,沙门氏菌属于肠杆菌科,至今已有2230种以上的血清型。,概 况,沙门氏菌引起人的伤寒、

2、副伤寒、感染性腹泻、食物中毒和医院内感染，并引起动物的沙门氏菌病，是重要的肠道致病菌。该菌属在医学、兽医和公共卫生上均十分重要：,概 况沙门氏菌引起人的伤寒、副伤寒、感染性腹泻、食物中毒,沙门氏菌的分类,根据新近的沙门氏菌的分类方案，本属菌现可分为两个种：肠道沙门氏菌（S.enterica）邦戈尔沙门氏菌（S.bongori）肠道沙门氏菌又分为6个亚种：肠道亚种（enterica）萨拉姆亚种（salamae）亚利桑那亚种（arizonae）双相亚利桑那沙门氏菌（diarizonae）豪顿沙门氏菌（houtenae）因迪卡沙门氏菌（indica）,沙门氏菌的分类根据新近的沙门氏菌的分类方案，本属

3、菌现可分为两,抗原结构,菌体(O)抗原分群鞭毛(H)抗原分型毒力(Vi)抗原微荚膜成分,抗原结构菌体(O)抗原分群,O抗原是细胞壁表面的耐热多糖抗原；根据O抗原（群因子）将沙门氏菌分为A、B、C1-C4、D1-D3、E1-E4、F、G1-G2、HZ和O51-O63以及O65-O67计51个O群，包括58种O抗原。,1、O抗原,O抗原是细胞壁表面的耐热多糖抗原；1、O抗原,H抗原是本属菌的蛋白质性鞭毛抗原，计有63种；第一相（特异相）：小写英文字母，特异性高第二相（非特异相）：阿拉伯数字，少数用英文字母，特异性低同一O群的沙门氏菌又根据它们的H抗原的不同再细分成许多不同的血清型。,2、H抗原,H

4、抗原是本属菌的蛋白质性鞭毛抗原，计有63种；2、H抗原,Vi抗原是微荚膜成分；相当于K抗原，与毒力（virulence）有关，故称为Vi抗原。新分离的菌株多有Vi抗原，在普通培养基上多次传代后易丢失此抗原，这种变异称为“V-W变异”。,3、Vi抗原,伤寒沙门氏菌丙型副伤寒沙门氏菌部分都柏林沙门氏菌,须鉴定Vi抗原,Vi抗原是微荚膜成分；3、Vi抗原伤寒沙门氏菌须鉴定Vi抗原,4、血清型,以O:H:Vi形式表示：用已知的沙门氏菌O和H单因子血清作玻板凝集试验便可确定一个沙门氏菌分离物的血清型或抗原式，对可能有Vi抗原的菌株还须用Vi 抗血清鉴定之。举例：1,4,5,12:i:1,2 9,12,V

5、i:d:目前本菌属至少已有2500个血清型。对人和温血动物致病的血清型绝大多数分属于AF群，在疾病中经常出现的不足50种。,4、血清型以O:H:Vi形式表示：,常用检验用培养基,DHL琼脂成分蛋白胨 20 g牛肉膏 3 g乳糖 10 g蔗糖 10 g去氧胆酸钠 1 g硫代硫酸钠 2.3 g柠檬酸钠 1 g柠檬酸铁铵 1 g中性红 0.03 g琼脂 1820 g蒸馏水 1000 mlpH 7.3,制法：将除中性红和琼脂以外的成分溶解于400 ml 蒸馏水中，校正pH，再将琼脂于600 ml蒸馏水中煮沸溶解，两液合并，并加入0.5%的中性红水溶液6 ml，待冷至55 ，倾注平板。,sal.为无色半

6、透明菌落，产H2S者为黑色菌落。,常用检验用培养基DHL琼脂成分制法： sal.为无色半透明菌,SS琼脂(沙门氏-志贺氏琼脂)基础培养基牛肉膏 5g蛋白胨 5g三号胆盐 3.5g琼脂 17g蒸馏水 1000ml121,15min高压灭菌,完全培养基基础培养基 1000ml乳糖 10g柠檬酸钠 8.5g硫代硫酸钠 8.5g10%柠檬酸铁溶液 10ml1%中性红溶液 2.5ml0.1%煌绿溶液 0.33ml加热溶化基础培养基,按比例加入上述除染料以外之各成分,充分混合均匀,矫正至pH7.0,加入中性红和煌绿溶液,倾注平板.注1:制好的培养基宜当日使用，或保存于冰箱内于48h内使用注2:煌绿溶液配好

7、后应在10天以内使用注3:可以购用SS琼脂的干燥培养基,sal.为无色半透明菌落，产H2S者为中心带黑色，乳糖阳性者为粉红色，中心带黑色。,SS琼脂(沙门氏-志贺氏琼脂)完全培养基 sal.为无色半透,亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）,成分蛋白胨 5 g乳糖 4 g亚硒酸氢钠 4 g磷酸氢二钠 5.5 g磷酸二氢钾 4.5 gL-胱氨酸 0.01 g蒸馏水 1000 ml1% L-胱氨酸 氢氧化钠溶液的配制：称取L-胱氨酸 0.1 g，加1 mol/L氢氧化钠1.5 ml，使溶解，再加入蒸馏水8.5 ml即成。,制法将除亚硒酸氢钠 和L-胱氨酸 以外的各成分溶解于900 ml蒸馏水中，加热煮沸，待

8、冷备用。另将亚硒酸氢钠 溶解于100 ml 蒸馏水中，加热煮沸，待冷，以无菌操作与上液混合。再加入1% L-胱氨酸-氢氧化钠1 ml。分装于灭菌瓶中，每瓶100 ml，pH应为7.1,亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）成分制法,氯化镁孔雀绿增菌液（MM）,甲液胰蛋白胨 5 g氯化钠 8 g磷酸二氢钾 1.6 g蒸馏水 1000 ml乙液氯化镁 40 g蒸馏水 100 ml,丙液0.4 %孔雀绿水溶液制法分别按上述成分配好后，121，15min灭菌备用。临用前取甲液90 ml、乙液9 ml、丙液0.9 ml，以无菌操作混合即可。,氯化镁孔雀绿增菌液（MM）甲液丙液,四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）,基础

9、培养基蛋白胨 5 g胆盐 1 g碳酸钙 10 g硫代硫酸钠 30 g蒸馏水 1000 ml碘溶液碘 6 g 碘化钾 5 g蒸馏水 20 ml,制法将基础培养基的各成分加入蒸馏水中，加热溶解，分装每瓶100 ml。分装时应随时振摇，使其中的碳酸钙混匀。121 ，15 min，灭菌。临用时每100ml基础培养基中加入碘溶液2 ml、0.1%煌绿溶液1 ml。,四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）基础培养基制法,亚硫酸铋琼脂（BS）,成分蛋白胨 10 g牛肉膏 5 g葡萄糖 5 g硫酸亚铁 0.3 g磷酸氢二钠 4 g煌绿 0.025 g柠檬酸铋铵 2 g亚硫酸钠 6 g琼脂 1820 g蒸馏水 1000

10、 mlpH 7.5,制法将前五种成分溶解于300 ml蒸馏水中将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠另用50 ml蒸馏水溶解将琼脂于600 ml蒸馏水中煮沸溶解，冷至80 。将以上三液合并，补充蒸馏水至1000 ml，矫正pH，加0.5%煌绿水溶液5ml，摇匀，冷至55 时，倾注平板注：此培养基不需高压灭菌。制备过程中不宜过分加热，以免降低其选择性。应在临用前一天制备，贮存于室温暗处。超过48 h不宜使用。,产H2S者为黑色有金属光泽，不产H2S者为灰绿色的菌落。,亚硫酸铋琼脂（BS）成分制法产H2S者为黑色有金属光泽，不产,尿素琼脂,成分蛋白胨 1 g氯化钠 5 g葡萄糖 5 g磷酸二氢钾 2 g0.4%酚

11、红溶液 3 ml琼脂 20 g蒸馏水 1000 ml20%尿素溶液 100 mlpH 7.2,制法将除尿素以外的成分配好，并高压灭菌后，冷至55，加入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%，最终pH 为7.2，分装于灭菌试管内，放成斜面备用。试验方法挑取琼脂培养物接种，在37，培养24h，观察结果，尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。,尿素琼脂成分制法,氨基酸脱羧酶试验培养基,成分蛋白胨 5 g酵母浸膏 3 g葡萄糖 1 g蒸馏水 1000 ml1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液 1 mlL-氨基酸或DL-氨基酸 0.5 g或1 g/100 mlpH 6.8,制法将除氨基酸以外的成分加热溶解后

12、，分装每瓶100 ml ，加入各种氨基酸、赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。 L-氨基酸按0.5%加入，DL-氨基酸按1%加入。再行校正pH至6.8。试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种，于37，培养18-24 h。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。,氨基酸脱羧酶试验培养基成分制法,ONPG培养基,成分邻硝基酚-D-半乳糖苷（ONPG） 60 mg0.01 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.5） 10 ml1%蛋白胨水（pH 7.5） 30 ml,制法将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于试管内，每管0.5

13、ml。用橡皮塞塞紧。试验方法将细菌接种于37 培养1-3 h和24 h观察结果。如果-半乳糖苷酶产生，则于1-3 h变黄色，如无此酶则24 h不变色。,ONPG培养基成分制法,氢化钾（KCN）培养基,成分蛋白胨 10 g氯化钠 5 g磷酸二氢钾 0.225 g磷酸氢二钠 5.64 g蒸馏水 1000 ml0.5%氢化钾溶液 20 mlpH 7.6,制法将除氰化钾以外的成分配好后分装烧瓶，121，15min。每100ml培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0ml。试验方法37，培养1-2天。如有细菌生长即为阳性（不抑制），经2天培养不生长为阴性（抑制）。,氢化钾（KCN）培养基成分制法,缓冲蛋白胨水

14、（BP）,成分蛋白胨 10 g氯化钠 5 g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O） 9 g磷酸二氢钾 1.5 g蒸馏水 1000 mlpH 7.2制法按上述成分配好后，121，15min灭菌。临用时无菌分装每瓶225ml。注：本培养基供沙门氏菌前增菌用,缓冲蛋白胨水（BP）成分,前增菌和增菌,冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。以无菌操作取25 g（ml），加在装有225 ml缓冲蛋白胨水的500 ml 广口瓶内。固体食品可先磨碎或乳化，于37 培养4 h（干蛋品1824 h）。移取10 ml，转种于100 ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42 培养1824 h。同

15、时，另取10 ml，转种于100 ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于37培养1824 h。,前增菌和增菌冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。以,为何要用两种不同的增菌液呢？,亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）,四硫磺酸酸盐增菌液（TTB）,+,对猪霍乱和羊流产sal有毒性,TTB 适于伤寒沙门氏菌增菌；MM 适于其它各种沙门氏菌；,为何要用两种不同的增菌液呢？亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）四硫,检样,前增菌法：冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品25g+BP 225ml,直接增菌法：鲜肉、鲜乳或其它未经加工的食品25g+灭菌生理盐水25ml，做成检样匀液,10ml+MM（或TTB）100ml,10ml

16、+SC100ml,检样匀液25ml+MM（或TTB）100ml,检样匀液25ml+SC100ml,BS,DHL（或SS、HE、WS）,挑取可疑菌落,TSI，靛基质试验、尿素（pH 7.2）、KCN、赖氨酸,H2S+；靛基质-；尿素-；KCN-；赖氨酸+；,H2S+；靛基质+；尿素-；KCN-；赖氨酸+；,H2S-；靛基质+；尿素-；KCN-；赖氨酸+/-；,非如左述的各种反应结果,沙门氏菌血清学试验,沙门氏菌血清学试验,非沙门氏菌,非沙门氏菌,甘露醇+、山梨醇+,ONPG +,报告,42,18-24h,37,42,37,检样前增菌法：冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品25g+BP 2,鲜肉、鲜蛋、

17、鲜乳或其它未经加工的食品不必经过前增菌。,各取25g（25ml）加入灭菌生理盐水225ml，按前法做成检样匀液；取25ml接种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42培养24h；另取25ml接种于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于37，培养1824h。,鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其它未经加工的食品不必经过前增菌。各取25,分离取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂（BS）和一个DHL琼脂平板（或SS琼脂平板）。两种增菌液可同时划线接种于同一个平板上。于37分别培养1824 h或4048 h（BS）观察各个平板上生长的菌落特征。,分离,沙门氏菌属各群在选择性琼脂平板上的菌落特征

18、,选择性琼脂平板沙门氏菌、沙门氏菌（即亚利桑,生化试验,自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂。在三糖铁琼脂上，只有斜面产酸并同时硫化氢（H2S）阴性的菌株可以排除，其他的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时也均有不是沙门氏菌的可能,生化试验自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖,肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果,斜面底层产气硫化氢可能的菌属和种-+/-+沙门氏菌属、费劳,在接种三糖铁的同时，再接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾培养基（KCN）和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管，于37培养18-24h，必要时可延长至48h。

19、,在接种三糖铁的同时，再接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼,肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表,肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢靛基质pH7.2,血清型分型鉴定,抗原的准备O抗原的鉴定用AF多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照，在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。H抗原的鉴定Vi抗原的鉴定,血清型分型鉴定抗原的准备,须强调的是，虽然对沙门氏菌有各种新的分类方案，但通常仍惯用简单的通用命名，即以该菌所致疾病或最初分离地名、或抗原式三种方式来命名。,须强调的是，虽然对沙门氏菌有各种新的分类方案，但通常仍惯用简,群 别菌 型抗 原OHA甲型副伤寒沙门氏菌1,2,1,沙门氏

20、菌的快速筛检方法,显色培养基法 在选择性培养基的基础上，经进一步改良，使目标菌在此培养基上的菌落显示出一定的颜色，便于识别。代表有法国生物梅里埃公司的“SMID”(沙门氏菌为粉红色) 法国科玛嘉的“沙门氏菌显色培养基”(沙门氏菌典型菌落为紫色)。免疫学方法酶联免疫吸附检测试验（ELISA）荧光抗体检测分子生物学技术DNA探针分析方法PCR技术,沙门氏菌的快速筛检方法显色培养基法 在选择性培养基的基础,沙门氏菌引起食物中毒的主要原因,食物受沙门氏菌污染的机会很多，易受污染的食品种类也很多，包括牲畜、禽、蛋、奶、鱼、虾、贝类制品等。在某些情况下，豆制品、水、糕点以及食品加工设施表面也可检出。兽医上

21、沙门氏菌最为引起高度重视，食品中沙门氏菌检验也显得非常重要。,沙门氏菌引起食物中毒的主要原因食物受沙门氏菌污染的机会很多，,沙门氏菌食物中毒的主要临床症状,胃肠炎 最为常见,引起轻型或爆发性腹泻,伴有低热,恶心和呕吐。菌血症或败血症 以猪霍乱沙门氏菌感染为多，无明显的胃肠炎症状，表现为高热、寒战等。常伴有局部病灶如胆囊炎、骨髓炎等。肠热症 即指伤寒和副伤寒。以伤寒为例，病人在临床上出现发热，不适等症状。随后，细菌随血流播散至肝、脾、胆囊、肾和骨髓等实质器官中，继续大量繁殖，再次进入血流，引起第二次菌血症。病人出现持续高热、肝脾肿大、皮疹和全身中毒症状。携带者 伤寒沙门氏菌感染过后约3%患者可成为携带者。,沙门氏菌食物中毒的主要临床症状胃肠炎 最为常见,引起轻型,肥达反应（Widal test）,用已知伤寒、副伤寒沙门氏菌的O、H抗原，检测受检血清中有无相应的抗体的半定量试管内凝集试验。本试验与细菌分离培养同时进行或在前者失败的情况下，能辅助诊断伤寒、副伤寒A，B和C引起的肠热症。,肥达反应（Widal test）用已知伤寒、副伤寒沙门氏菌的,