《血红蛋白的提取和分离》ppt课件.ppt
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1、知识回顾-有关蛋白质的几个问题:,1、含量2、组成元素3、相对分子质量4、基本组成单位: 结构简式: 种类:5、氨基酸连接方式,占细胞干重的50以上,细胞中含量最多的有机物,C、H、O、N,高分子化合物,氨基酸,脱水缩合,知识回顾-有关蛋白质的几个问题:,6、肽键7、分子结构8、蛋白质多样性的原因: (多样性的根本原因) 9 、蛋白质的鉴定方法,氨基酸的种类不同;数目成百上千;排列顺序变化多端;多肽链的空间结构千差万别,10、生理功能,细胞和生物体的结构物质,是人体发育和组织更新的主要原料,具有运输、调节、免疫、催化等作用,是一切生命活动的主要承担者,双缩脲试剂,血红蛋白含有四条肽链,每条肽链
2、环绕一个亚铁血红素基团,此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳,血红蛋白因含有血红素而呈红色。,本课题的主要内容如下:,血红蛋白的提取和分离,一、基础知识:,样品处理及粗分离的原理:,1 、分离生物大分子的基本思路是什么?,2 、不同蛋白质的特性在哪些方面存在差异?,3 、为什么不用鸡的血红细胞而用猪的血红细胞作为实验材料?,4 、用什么方法分离相对分子质量不同的蛋白质?,一、基础知识-蛋白质提取和分离原理,1、选用一定的物理或者化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,2、形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别。,阅读并回答(P64) 1、凝胶色谱法另一个名称是
3、什么? 2、凝胶色谱法分离蛋白质的依据是什么? 3、凝胶的实质是什么? 4、凝胶色谱法的原理是什么?,基础知识(一) 凝胶色谱法,1、凝胶色谱法的别名:分配色谱法 是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。,3、凝胶实质 性质:一些微小的多孔球体,球内含许多贯穿的通道; 化学本质:多糖类化合物: 实例:葡聚糖、琼脂糖:,基础知识(一) 凝胶色谱法,2、依据的特性蛋白质分子量的大小。,4、原理,原理:当不同的蛋白质通过凝胶时,相对( )的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程( ),移动速度( ),而( )的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在( )移动,路程( ),移动速度( ),相对分子质量
4、不同的蛋白质因此得以分离。,分子质量较小,较长,较慢,相对分子质量较大,凝胶外部,较短,较快,基础知识(一) 凝胶色谱法,用凝胶色谱法分离蛋白质时,分子量大的蛋白质A路程较长,移动速度较慢 B路程较长,移动速度较快C路程较短,移动速度较慢 D路程较短,移动速度较快,D,相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个,B,1、 之前在什么地方遇见过缓冲物质?,2、 缓冲物质有哪些?作用是什么?,3、 本实验加的是什么缓冲液?为何要加缓冲液?,(二)、缓冲溶液,由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如H2CO3/NaHCO3,醋酸/醋酸钠,NaH2PO4/Na2HPO4等,缓冲溶液洗脱剂组成
5、:作用:,抵制外界酸碱对溶液pH的干扰,保持 pH与体内环境基本一致。,(二)、缓冲溶液,基础知识(三)电泳,阅读第65页的相关内容,回答以下问题: 1、电泳的概念; 2、电泳的原理; 3、电泳的种类; 4、SDS的作用。,基础知识(三)电泳,2凝胶电泳法:,(三)电泳,1.电泳的概念,指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程.,(1)原理:,许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解离的基团,在一定的PH下,这些基团会带上正电或负电。,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。,电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小,形状的不同使带电分子产生不同
6、的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。,(三)电泳,(2)类型:,琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS),(3)SDS作用,为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDS。,使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中,不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少 B 分子的大小C 肽链的多少 D 分子形状的差异,血红蛋白的提取和分离,跳转,血液组成成分,阅读思考:血液由_和_两部分组成。血细胞中_细胞数量最多,红细胞的含量最高的有机化合物是_。该化合物是由 _和_构成的,其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的_基团。,返回,1.洗 涤 红 细 胞,阅读思考:洗涤的目的是什么?洗涤
7、过程:,血液100mL,重复洗涤3次,直至上清液没有黄色,采集得到猪血,初次离心后的结果,3次洗涤后的结果,返回,2.释放血红蛋白,阅读思考:释放血红蛋白过程中,在洗涤好的红细胞加入了哪些物质?为了加速释放过程,采取了什么措施?,目的分析:蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,(2)血红蛋白的释放:,加蒸馏水到原血液体积,再加40体积的甲苯,置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟(加速细胞破裂),细胞破裂释放出血红蛋白。,磁力搅拌器,返回,2、粗分离血红蛋白溶液:,过程:将搅拌好混合液转移到离心管内,以2000r/mi
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