PCR发展、原理 简版ppt课件.ppt

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1、PCR的发展及原理,刘洋,分子生物在生活及医学中的应用DNA分子的结构PCR的发展史PCR的原理、试剂检测原理常见实时荧光PCR仪器,日常生活中,转基因食品亲自鉴定酱油、醋、酒的酿造,医学领域,疾病基因检测 / 遗传病的产前诊断致病病原体的检测 肿瘤治疗中癌基因的检测DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证 其他: 动、植物检疫（转基因动植物检测）,分子生物在生活及医学中的应用DNA分子的结构PCR的发展史PCR的原理、试剂检测原理常见实时荧光PCR仪器,中关村DNA双螺旋结构“生命”雕塑，如今已被看做中关村的标志，收到各界好评。,A,G,C,T,一. DNA脱氧核糖核酸,1,2,3,4,

2、5,2、化学元素组成：,C H O N P,脱氧核糖核苷酸,1、基本单位：,3、脱氧核糖核苷酸：,一分子五碳糖、一分子磷酸基团和一分子含N碱基,腺嘌呤脱氧核苷酸,鸟嘌呤脱氧核苷酸,胞嘧啶脱氧核苷酸,胸腺嘧啶脱氧核苷酸,脱氧核苷酸的种类（四种）,氢键,平面结构,立体结构,DNA分子的空间结构模型,碱基对,另一碱基对,嘌呤和嘧啶之间通过氢键配对，形成碱基对，且A只和T配对、C只和G配对，这种碱基之间的一一对应的关系就叫做碱基互补配对原则。,A,T,G,C,氢键,碱基与氢键的关系,A,A,T,T,G,G,G,G,C,C,C,A,T,C,（1）DNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘旋成双螺旋结构

3、。,DNA分子的结构特点,A,A,T,T,G,G,G,G,C,C,C,A,T,C,（1）DNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘旋成双螺旋结构。,（2）DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排列在外侧，构成基本骨架；碱基在内侧。,DNA分子的结构特点,A,A,T,T,G,G,G,G,C,C,C,A,T,C,（1）DNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘旋成双螺旋结构。,（2）DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排列在外侧，构成基本骨架；碱基在内侧。,（3）两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对，且遵循碱基互补配对原则。,DNA分子的结构特点,分子生物在生活及医学中的应用DNA分子

4、的结构PCR的发展史PCR的原理、试剂检测原理常见实时荧光PCR仪器,PCR技术简史,PCR技术简史,很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖， Mullis是其中之一,Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法.,Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ,1983年春，Mulli

5、s发展出PCR的概念；1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环；1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒；1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），这回Mullis是第一发明人。1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法；1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是85年春天Mullis建议做的；19

6、88年，第一台PCR仪问世；1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖,PCR的发展史,分子生物在生活及医学中的应用DNA分子的结构PCR的发展史PCR的原理、试剂检测原理常见实时荧光PCR仪器,什么是PCR？,PCR：又叫做聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。,PCR的基本原理,PCR循环第一步：经过前期处理的样本核酸，在加热的条件下，双链DNA被解开螺旋结构和双链结构，成为两条独立的直链。这一过程也称作“变性”。,PCR循环第二步：环境温度逐渐降低到一定程度，环境中的“引

7、物”同单链DNA杂交，这一过程也称作“退火”。,PCR的基本原理,PCR的基本原理,PCR循环第三步：在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下搬运对应核苷酸延伸引物，这一过程叫做“延伸”。,PCR的基本原理,一个PCR 循环完成后 ，我们从一条双链的DNA复制得到两条双链DNA,PCR的基本原理,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,试剂检测原理,实时荧光PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始

8、模板进行定量分析。,如何检测荧光强度呢, 我们先来了解一下荧光探针。,TaqMan-水解型探针,5端标记有荧光报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 ，即供体。 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 （荧光共振能量转移原理，FRET） Taq酶可水解探针,试剂检测原理,在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶以引物为起点沿模板53方向延伸，合成一条新的DNA互补链。每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中检测荧光.,最后通过实时荧光PCR仪，将各种荧光信号转化为各种曲线，再经过电脑一系列的计算就可以得到起始模板量。,试剂检测原理,分子生物在生活及医学中的应用DNA分子的结构PCR的发展史PCR的原理、试剂 检测原理常见实时荧光PCR仪器,实时荧光PCR仪,ABI 7500荧光定量PCR仪96孔、4通道,实时荧光PCR仪,BIO-Rad CFX 9696孔、4通道,实时荧光PCR仪,实时荧光PCR仪,罗氏LC 48096孔、4通道,实时荧光PCR仪,宏石 SLAN 9696孔、4通道,实时荧光PCR仪,天隆 TL9882通道、48孔,达安 DA76002通道、48孔,谢谢观赏,