ELISA操作技术问题及解答ppt课件.ppt

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1、问题与解答,北京望尔生物技术有限公司,药残离心管最理想的洗涤方法，我们发现每次作完回收实验时，离心管就会出现不同程度的污染现象？,建议实验完成后,先用流动自来水冲洗干净,再加入洗涤剂, 然后立即清洗干净，再用流动自来水冲洗，最后用去离子水冲洗，烘干。超高阳性样本所使用的离心管或玻璃试管建议不再使用。,实验中对水质的要求：三蒸水、蒸馏水、纯净水还是去离子水？,最好用去离子水,蒸馏水略逊,其余效果差异不大; 理论来说这几种水都可以满足分析要求,但对于某些项目来说还是有一定的区别。,器具污染所造成的途径有几种？,一: 检样过程中出现含量较高的阳性样品; 二: 实验器具没有清洗干净;三：高浓度标品贮备

2、液保存不当造成污染。 容易被污染的实验器具, 使用周期较长, 建议方便更新的实验器具, 定期(3-5个月)更新一次。,药品的隐含违禁成份用ELISA方法检测是否可行？,针对不同成分的样品, 通过对应的样品前处理方法,消除干扰后, 可以用ELISA方法进行检测，但应防止与药残实验交叉污染。,同样一个样品，称取两个样检测两次，两次值差别较大，是取样原因还是板间的差异？,检测中常遇到的问题。正常情况下,板孔间的变异不会对样本的检测结果造成绝对的影响样品的取样, 前处理过程和分析过程中的操作误差是影响结果差异较大的主要因素。,前处理样品所用的氮气是不是可换用压缩空气？空气中的氧气是否会对样品产生氧化作

3、用，进而影响试验结果？,可以用压缩空气替换氮气, 药物的氧化在此不会产生，一般情况下需要检测的目标物是非常稳定的药物，如果药物容易产生氧化，那么则没有检测的必要性了。,将肉中药物残留成份转移到提取液中，最佳的离心力、离心时间是多少（不同的试剂盒离心时间不一样）？,组份区别，4500r/min, 离心5min,离心力一般是3000g。,呋喃唑酮检测孵育时间多长为最佳？,14到16h（参考仪器方法）,有实验证明过最低可以缩短至12小时,但对于高阳性样本来说可能会出现差异,建议使用14-16h。,回收率的测定方法？每个盒子是否有一个推荐的回收率测定方法?,不同的试剂盒的不同种类的样本, 按照说明书中

4、样本的前处理方法, 回收率的测定方法也有不同，如硝基呋喃类与喹诺酮类的添加方式等。添加回收的体积公式:V=C*1000M/P。其中:V为添加的高标准体积（ul）,C为添加的浓度,P为高标准的浓度(ppb),M为样本的质量(g)。,脂肪存在为什么会造成试验的假阳性率比较高？,在提取过程中, 容易造成乳化, 对样本进行不正常的浓缩，易与杂质混合难以分离。乳化后一般利用60水浴加热半小时,最好是先把上层有机相去除后再利用水浴加热较好.第二种解乳化的方法是把整个乳化后的样本全部放入冰箱-20急冻室急冻30min或更长，回温后去除上层有机相再次离心后去上清液，取下层进行下一步操作分析。如氯霉素或其他在加

5、入正已烷再加入复溶液进行操作时，可在加入正已烷后充分涡动1-2分钟，然后加入复溶液后涡动5-10s，即可在一定程度上防止乳化造成。如硝基呋喃类代谢物的前处理中加入乙酸乙酯后形成乳化层，不易取到相应的量，可以在加入乙酸乙酯时，放大加入的量，然后取液相应增加，保证稀释倍数不变，也可在一定程度上防止乳化形成。,样品OD值落在药残标准曲线的那一区间值精确度最高？,一般在第三和第四标准之间精确度较高, 但是不同的试剂盒曲线的局部差异, 精确区间会稍有变化。一般在IC50左右曲线上的直线段较为准确。,整板值偏低反应温度偏低,反应时间偏少,洗板时间过长或次数过多,点板时间过长,酶标仪故障,(波长错误；钨光灯

6、寿命将近,导致光强变弱；)试剂盒有效期已过或将过，某些试剂盒需要稀释才使用的试剂稀释倍数错误，试剂变质或污染，不同批次的试剂盒混用，试剂盒的回温时间太短，试剂盒保存环境过于复杂，试剂盒处于极端条件下，比如放在贴着冰箱壁，试剂冻伤。,OD值偏低由什么因素引起的?,样本的值偏低样本的阳性太高，某些试剂盒的样本需要调节p的没有调节到需要的p范围，某些试剂盒的复溶液需要稀释后才能使用的没有经过稀释，样本前处理时没有去掉上层有机相，加样吸取到上层有机相，样本被污染，样本与标准品的温度相差太多，样本前处理时使用的去离子水质量不合格。,OD值偏低由什么因素引起的?,样本的吸光度值为什么会超出曲线上最大值？,

7、样本在离心以后没有充分回温到室温或未与标准品温度一致，标准品回温时间不够，样本中含有非样本基质的物质，如有机溶剂，样本复溶液稀释错误或直接利用去离子水作为复溶液，标准被污染，边缘效应，反应时间错误，导致标准品的值不上升而样本的值继续上升，常规操作中超过.2的吸光度值为正常现象，可能由于变异系数引起。附：此种情况一般可以说明样本为阴性样本。,氮吹仪为什么需要水浴？,水浴加热是为了使样本挥发的速度更快一些。,样本检测结果在曲线之外如何判定?,把样本利用复溶液进行稀释后才进行检测.使之在曲线之中最佳.最好是稀释到IC50左右后再次进行检测。,氮吹仪步骤为什么要50-60进行水浴?,一般有机溶剂的沸点

8、在60-90不等,而水浴的温度一般较溶剂的沸点略低为佳,故对于大众溶剂,可以选用50-60的水浴进行加热.但对于某些沸点较高的试剂,比如乙腈等沸点在80以上的有机溶剂吹干的时候可选用65-70水浴进行加热.但是温度不宜过高.注：对于混合有机溶剂一般来说沸点会有所降低.相应的水浴温度也应稍微降低。,所有试剂盒的洗板液是否可以通用？,同批试试剂盒的洗板液成份基本一致，可以通用。相隔时间太长的试剂盒内的洗液成份可能会有少许的变更，建议不通用，如遇到此种情况，可利用较新批次的试剂盒洗液进行操作。,样本吹干后保存问题。,样本吹干后建议立即进行复溶后点板，尽量不进行保存，如果确实需要进行保存的，最好是选择

9、吹干后放置于2-8冰箱进行保存，如果是已经复溶好的样本，需要用封口膜进行封口后方可放置于2-8冰箱保存。另外有些样本是不能放置在玻璃里面进行保存的，如喹诺酮类药物吹干后不能进行保存，如果需要保存，则要复溶后转移到塑料瓶中方可放置于2-8冰箱进行保存。 一般说来，复溶后的样本保存时间不超过12小时。,试剂盒在保质期内颜色变浅，但有梯度，可否继续使用？,试剂盒在保质期内颜色变浅可能是保存环境影响所致，在有梯度的情况下可以继续使用，但是检测结果只可做为相对判定依据，而不能做为定量检测结果。,回收率长期偏高或偏低，是否正常？,国家对试剂盒的回收率范围要求较宽（40%-130%），如果在稳定的前提下出现

10、试剂盒的回收率长期偏高或偏低是正常的，也可以做为判定依据。需要在检测结果的检测值除上回收率即是该样本的相对准确检测结果。如果有阳性样本的情况下，最好是使用确证后的阳性样本进行复核实验为佳。,ELISA方法在方法及操作无问题的情况下，能否出现假阳性或假阴性？,ELISA方法本身的特点具有半定量的性质，一般允许有一定比例的假阳性（国家要求在10%以下），在实验室研发工作中是不允许出现如此大的假阳性率的，一般控制在5%以下。但是不能出现假阴性检测结果。,样本处理过程中出现稀释倍数问题时，如何计算？,样本处理过程中出现的稀释均为在无损失的情况下每ml样本液中溶解的样本体积，如2g样本在无损失的情况下处

11、理完成后溶解于1ml样本液中，则表示该方法的稀释倍数为0.5倍，如0.5g样本在无损失的情况下处理完成后溶解于1ml样本液中，则表示该方法的稀释倍数为2倍，如2g样本在无损失的情况下处理完成后溶解于0.5ml样本液中，则表示该方法的稀释倍数为0.25倍。,没有结晶水的试剂在配置溶液时，该如何换算？,没有结晶水的试剂在配置溶液时，应该取该试剂需要的物质的量乘上分子量后才是需要的试剂的重量。如说明书上需要ng分子量为M1的物质，如果在没有的情况下，需要用分子量为M2的没有结晶水的物质代替时，则需要的分子量为M2的物质重量为n*M2/M1。,配置好的试剂保存问题。,配置好的无机试剂一般可以保存2-3

12、个月，保存环境可以选择在室温，避光，阴凉处进行密封保存，洗液和复溶液等与抗原抗体直接接触的试剂选择在2-8冰箱里进行保存。有机混合溶液或有机和无机混合溶液保存的时间原则上不能超过1个星期，室温保存，建议现配现用。,标准曲线的线性要求达到多少为好？,标准曲线的线性直接反应该实验的优劣，理论上应该无限接近1。在实际操作中主要还是以标准曲线判定为主，相关系数判定为辅，在曲线较好的情况下，相关系数只要能达到0.98以上即可做为半定量检测结果判定依据。如果低于0.98，可以选择去除某一个点，以五个点作出曲线后再进行分析。,加样的量错误会导致结果如何？,由于该方法为生物法，其反应基理非常复杂，如果加样的量

13、错误，可能会导致不可预料的结果，不建议进行理论分析。,添加回收的添加浓度多少为好？,添加回收是验证该处理过程所反应的样本检测结果可信度，一般要求添加回收的浓度最好为检测判定值。如某些项目在检测时判定标准为0.5ppb，那么最好在做添加回收实验时添加浓度选在0.5ppb。,怎样降低实验器材对实验带来的干扰？,严格按照标准的器材清洗步骤进行实验器材清洗。,如何根据颜色深浅进行延时或缩短时间？,对于有经验的实验操作人员来说，颜色与OD值的关系很容易进行把握，如果颜色所示的OD值达到一定的程度即可进行终止。如果颜色过早达到一定的OD值范围，即可提前进行终止，反之则延长反应时间。如显色反应时间是30mi

14、n的，则需要达到15min以上方可结束，如果是显色15min的，则必须要到8min后方可进行终止。,多残与单残检测问题,一般来说，如果对方要求的是某类药物总残留检测结果不得超过某个值时，则可以使用多残留检测试剂盒，对于多残留检测试剂盒来说，交叉反应率越接近100%越好。如果对方要求的某药物检测结果不得超过某个值时，则要使用单残留检测试剂盒，且交叉反应率越低越好。对于不得检出的药物来说一般使用单残留检测试剂盒，避免出现过高的假阳性。,稀释好的抗体工作液或酶标二抗工作液能存放多长时间？,稀释好的抗体工作液或酶标二抗工作液不能保存，必须现配现用。,如何避免假阴性，如何提高回收率？,一般在试剂盒研发过

15、程中，前处理方法研究的时候即会在假阳性与回收率之前取一个平衡点，只要在实验操作过程中严格按照试剂盒说明书所提供的方法进行操作时不会出现假阴性现象。回收率与添加的药物的溶解度、药物的性质、移液器的精度、样本的种类、实验室条件、实验人员的操作熟练程度等有关，在各项均满足要求的情况下，回收率应该在说明书的规定范围内。,回收率为什么会超过100%？,在处理样本的过程中样本中的杂质会对检测药物或抗体产生干扰，因此才会出现回收率超过100%的现象。此种情况对检测结果的准确度不会造成本质的影响。,酶标仪中自带有曲线分析系统，还有必要用试剂盒专用处理软件吗？,酶标仪在生产过程中内部都会有自带的曲线分析系统，但

16、是一般酶标仪针对的对象为医院或医学上使用，曲线分析系统也是针对医学上进行研制和配备的。所有在试剂盒残留分析时不能使用酶标仪自带的曲线分析系统。而试剂盒专用的分析软件则是专门为该试剂盒配备的，分析的准确性高于于酶标仪自带的曲线分析系统。,如果检测样本在说明书上未出现，可否采用其他样本的方法代替？,如果检测的样本在说明书上未出现，则需要与技术部进行联系确证后方可进行答复，如果其他样本方法不可行且条件允许可以把样本邮寄到北京望尔技术有限公司，由北京望尔研发中心的技术人员进行对此样本的单独研发工作，我们将会在最短的时间内给您满意的答复。,回收率能否验证实验过程以及数据的准确性？,在没有确证样本对照的情

17、况下，样本的添加回收率是对操作人员及操作环境乃至试剂唯一的评判标准。因此回收率是一次实验成功与否除了曲线因素外的一个重要的判定标准。另：回收率只是一个参考标准，如果需要得到准确的衡量标准，建议使用已确证过的阳性样本进行复核实验。,呋喃类药物代谢物的前处理过程中，如果取上层2.5ml时上层不够取，如何解决？,呋喃类药物代谢物的前处理过程中，加入的有机溶剂的量比较有限，如果离心机效果不明显的话，很容易造成上层不够取的情况。遇到这种情况可以把加入的5ml乙酸乙酯的量加大到10ml，然后取上层5ml进行吹干。如果有乳化现象，请按照乳化处理方法进行操作。,酶标仪的检测校正只能由官方部门来进行检测吗？,所

18、有仪器的检测校正均只能由官方部门来进行检测，并贴上检验合格标志后，方可用来做检测实验。,呋喃四合一有必要做到用同一个试剂盒进行检测吗？,呋喃类药物代谢物四种药物在检测标准中均为不得检出的药物，单个检测要求都不得检出，如果做成四合一的形式，那么就无法判定检测出的单个药物是否超标。失去监控意义。,呋喃类药物在做添加回收实验时，可否利用通过已衍生化的标准曲线的标准品进行添加？,呋喃类药物代谢物在做添加回收实验时，必须经过一个衍生化的过程，使呋喃类药物代谢物变成代谢物的衍生物方可进行检测。而标准品中均都是已经衍生化后衍生物，如果直接用来添加，则在衍生过程无法体现。故不能拿标准品做添加回收实验。必须拿未

19、衍生的高标准进行添加。另：在做硝基呋喃类药物代谢物的试剂盒前处理操作时，应在把甲醇水溶液倒出后，加入去离子水、M盐酸和衍生化试剂步骤之前进行添加。,高阳性样本在点板反应时会不会因为反应时间过短而造成反应不完全的现象？,由于试剂盒的检测依据是利用标准曲线的对照从而得出样本中药物的含量的，因此，只要标准品和样本的反应环境和反应时间一致，则可以保证检测出来的样本不论含量高低均可达到一个比较真实的检测结果。,反应时间是否必须严格按照说明书所示？,ELISA实验是一个与标准品对照得出样本含量的检测过程，故在同一反应环境下，超过说明书反应时间不多的情况下不会对样本的检测造成影响。一般来说不得超过试剂盒说明

20、书所示反应时间10min。10min以下对样本的检测结果影响较小（针对除显色步骤以外的操作）。,如果在做呋喃类药物代谢物的实验时，离心管的体积不够，怎么办？,一般来说，如果遇到离心管的体积不够的实验时，可以在保持稀释倍数不变的情况下把样本以及加入的试剂的量进行减半操作。减半操作后不会对样本的检测造成本质性的影响。另一种方式，可以在比较大的试管中进行前处理操作步骤的离心前一部分，在加入乙酸乙酯振荡后，先静置一段时间，然后转移上层有机层相对较多的一层到另一离心管中进行离心，再取上层进行以下操作。,试剂盒分析的液体一般pH值要求多少？,试剂盒分析的液体一般要求为中性环境，pH值约在7.2-7.4之间

21、。,加入终止液后多久进行计数比较合适？,由于ELISA实验中所用到的都是生物试剂，而终止液为硫酸溶液，故在加入终止液后最好是在10min之内进行读数，如果放置时间过长，则会导致OD值呈不规则的降低现象。颜色深的孔内可能会出现黑色絮状物质，这是正常现象，是由于生物聚合体在硫酸的作用下碳化造成的（只针对本公司所有试剂盒）。,板孔在使用之前孔底部有小颗粒物质,这是正常现象，一般在板孔底部包被有抗原物质，可能会造成板孔底物有小颗粒物质，不影响正常检测。,喹诺酮类药物、磺胺类药物多长时间能代谢完？,一般来说，每种药物在每种动物体内都有一定的代谢周期，且代谢周期不尽相同，具体代谢周期可参阅相关文献。,出现

22、曲线问题时如何解决？,如果在检测过程中出现了曲线不好、拐点过多或本底偏高的解决手段可从环境因素、人为因素和试剂盒本身问题三个顺序入手，可以通过更换标准品进行再次实验进行验证。亦可以更改某个标准品的OD值或去除某个波动较大的坏点后使曲线变得平滑后，再予以分析。一般国际上要求做标准曲线的标准品个数在个到个之间，所以在做ELISA实验时最好能做6个标准品，以保证实验中出现的某个坏点可以去除，以个标准点进行曲线分析。,如果没有二氯甲烷时可否得用三氯甲烷进行代替？,一般来说，每个试剂盒的前处理方法得出都是经过大量的实验后方能确定的，在说明书中出现的所有试剂基本上在此方法中是最佳的，故不能简单的利用三氯甲烷代替二氯甲烷进行实验。,新旧说明书不一致的情况下，以哪个说明书为准？,对于ELISA试剂盒这种生物试剂来说，一般三个月到一年左右的时间会对产品进行更新，在平时实验室研发过程中会对产品进行升级，以更好的操作方法取代比较陈旧的操作方法，遇到此情况，应利用新版的说明书进行操作，以保证实验结果更加理想。比较重要的更新，望尔的技术工程师会在更新并售出试剂盒后对您进行回访，并通知您注意方法更改。,