DNA的琼脂糖凝胶电泳分析ppt课件.ppt
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1、DNA的琼脂糖凝胶电泳分析,制作小组:杜金红 王成强 汪强,实验目的,掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方法,实验原理:,琼脂糖凝胶电泳1、琼脂糖凝胶:天然琼脂是一种多聚糖,主要由琼脂糖及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质,不带电荷。琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖,由于这些集团带有点荷,在电场作用下能产生较强的电渗现象。,2、DNA的琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用与核酸的分子量、分子构型和凝胶浓度密切相关。(1)DNA的分子大小 实验证明,DNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比。通过比较标准物与未知片段的移动距离便可测出未知片段的大小。但当DNA分
2、子超过20kb时,普通琼脂糖凝胶就很难讲它们分开。,(2)核酸构型 不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。在分子量相当的情况下,不同构型的质粒DNA的移动速度次序为:共价闭环DNA直线DNA开环的双链环状DNA。这三种构型的相对迁移速率主要取决于凝胶浓度,同时也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。,(3)琼脂糖的浓度 一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的电泳迁移率不同。要有效地分离大小不同的DNA片段,需选用适当的琼脂糖凝胶浓度。不同浓度的琼脂糖凝胶适宜分离的DNA片段大小范围见表。,3、DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应,但主要是分子筛效应。在pH8.0
3、8.3时,核酸分子剪辑几乎不解离,磷酸解离,核酸分子带负电,在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物,在分子筛的作用下,使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异,从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料(如EB)后,在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。,4、溴化乙锭(EB)是一种吖啶类染料,它在紫外灯照射下能发射荧光,当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时,琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物,使DNA发射的荧光增强几十倍,电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。,跑出好看的电泳图:,凝胶一定要加热熔解完全,均匀,可以对着光亮的地方
4、看看清澈不清澈 ;一般情况下,梳子越薄而长,条带越好看 ;上样量不宜过多,会造成条带的相互挤压; 如果点样孔多余,将样点到中间,尽量避免边缘效应 ,中间电场比较均匀 ;做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致; 加样时不要太快,让其自然沉底,均匀分布在电泳孔内 ;电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后,再调高电压。,实验器材与试剂,(一)器材 : 电泳槽 电泳仪 微波炉(二)试剂1、 6上样缓冲液:0.25溴酚蓝;0.25二甲苯青;30甘油水溶液。( 由甘油、溴酚蓝指示剂以及DNA稳定剂按一定比例混合而成,经去核酸酶处理,适用于DNA样品的电泳检测,在自然光线下呈现暗红色,与核酸样品混合后,受样品
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