课题3血红蛋白的提取和分离(上课)ppt课件.ppt

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1、血红蛋白,本课题学习目标,体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1、主要概念：凝胶色谱法 电泳法 缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2、主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法4、课题难点： 样品的处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。,1、凝胶色谱法 凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一，又称分子筛层析 。 凝胶实际上是一些微小的多孔球体，例如：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等,一、基本

2、概念及原理,原理：,当不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小,相对分子质量较大,凝胶内部的通道,容易进入,无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较长移动速度较慢,路程较短移动速度较快,相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程,凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示,二、缓冲溶液,在一定范围内，能够抵制 对溶液PH值的影响，维持PH 不变。,1.作用:,2.配制:,通常由 溶解于水中配制而成。调节缓冲剂 的就可以制得在 使用的缓冲液。,3.提问：在本课题中使用的缓冲液是:_ ,其目的是:,利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证 血红蛋白的正常结构和功

3、能，便于观察(红色)和科 学研究(活性),磷酸缓冲液,外界的酸和碱,基本,12 种缓冲剂,使用比例,不同PH范围内,思考：说出人体血液中缓冲对。,NaH2PO4 / Na2HPO4,H2CO3 / NaHCO3,三、 电泳-血红蛋白的分离鉴定方法,1.概念：,带电粒子在 作用下发生 的过程。,2.原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有 的基团，在一定的PH下，这些基团会带上 或 。在电场的作用下，这些带电分子会向着的 的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。,3.类型:,琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺

4、凝胶电泳。,电场,迁移,可解离,正电,负电,与其所带电荷相反,带电性质的差异,大小,形状,迁移速度,最常用的电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。琼脂糖有一个相对较大的孔径，用来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物，聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶，适合于分离大多数蛋白和小片段核酸。,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动,琼脂糖凝胶电泳示意图,电泳检测PCR结果,（1）、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 等因素。,它所带静电荷的多少以及分子的大小,（2）、SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质

5、分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于（ ）。,分子的大小,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带电荷的性质和分子的大小、形状。,【典例1】有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是A.它们都是分离蛋白质的重要方法B.它们的原理相同C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要D.以上说法都正确 【解题关键】解答本题的关键应明确以下两点：(1)凝胶

6、色谱法的原理；(2)电泳法的原理。,A,二、实验步骤,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,样品处理粗分离纯化纯度鉴定（电泳）,实验操作,样品处理,（一）蛋白质提取和分离步骤,（二）操作过程,红细胞的洗涤,粗分离：,血红蛋白的释放,分离血红蛋白溶液,纯化：,纯度鉴定,透析去除样品中分子量较小的杂质,用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,2. 血液有哪些成分？,1. 用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。,血红蛋白,每

7、个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。,血红蛋白的特点：,采集得到血液（加入抗凝血剂柠檬酸钠）,1、样品的处理（1）红细胞的洗涤A、洗涤目的:B、分离时采用 离心，用 洗 涤，重复洗涤 ，直至 C、能否用蒸馏水代替生理盐水？,去除杂质血浆蛋白，以利于后续步骤的分离纯化,低速短时间,五倍体积的生理盐水,三次,上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净,不能，生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，若红细胞提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大分离难度。,初次离心后的结果,3次洗涤后的结果,（2）释放血红蛋白,思考：释放血红蛋白

8、过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？ （使用磁力搅拌器充分搅拌）,目的分析：蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,磁力搅拌器,搅拌器转子,搅拌器正在工作,（3）分离血红蛋白溶液：,用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,甲苯层（无色透明）,白色薄层固体,红色透明液体,杂质沉淀层（暗红色）,试管中溶液层次,柜式离心机,2.粗分离-透析（去除分子量较小的杂质）,（1）用 方法进行粗分离，透析袋由半透膜制 成，常用 。将透析袋放入 溶液中进行

9、透析。（2）透析的原理是（3）透析的目的是 。,透析,玻璃纸、肠衣、膀胱膜,透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内,去除样品中分子量较小的杂质,磷酸缓冲,透析过程动画演示,（1）凝胶色谱柱的制作,取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。,底塞的制作： 打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。,3、纯化（凝胶色谱）-去除相对分子量较大的杂质蛋白,凝胶色谱柱的制作,（2）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶色

10、谱柱的装填方法： A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱 内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,教材P70：为什么凝胶的装填要紧密、均匀？,如果装填不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，影响分离的效果。,思考,装配好的凝胶柱,(3）样品加入与洗脱,加样前,打开下端出口，使柱内凝胶面上的（ ）缓慢下降到与（ ）平齐，关闭出口

11、,缓冲液,凝胶面,注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,加透析样品,调整缓冲液面：与凝胶面平齐滴加透析样品：加到色谱柱的（ ）样品渗入凝胶床：（ ）再调整缓冲液面洗脱：收集：待（ ）接近色谱柱底端时收集,顶端,样品完全进凝胶层,红色的蛋白质,色谱柱制作成功的标志： 红色区带均匀一致的移动,记,4、纯度鉴定（电泳）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1、垂直板电泳装置2、稳流稳压电泳仪；3、微量进样器（可用微量移液器代替）,（5）装槽、点样：,拔出梳子 将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内） 在电泳槽中加入缓冲液 点样。,（6）电泳：,（7)、剥胶、染

12、色及脱色 凝胶板剥离：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加染色液染色，然后用脱色液脱色。,(8)、结果,思考下面的问题：,让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。,1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？,2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？,血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？,血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和

13、纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液（离心）等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。,【典例2】(2011扬州高二检测)如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：,(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有_功能。(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是_；乙装置中，C溶液的作用是_。(3)甲装置用于_ ，目的是_。用乙装置分离蛋白质的方法叫_，是根据_

14、分离蛋白质的有效方法。(4)用乙装置分离血红蛋白时，待_-_时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。,运输,磷酸缓冲液,洗脱血红蛋白,透析(粗分离),去除样品中相对分子质量较小的杂质,凝胶色谱法,相对分子质量的大小,红色的蛋白质接近色谱柱底端,观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,三、实验结果分析与评价,1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,2、你装填的凝胶色

15、谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,3、你能观察到蛋白质的分离过

16、程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,教学反馈,1凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。 A分子的大小 B相对分子质量的大小 C带电荷的多少 D溶解度2缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（ ）基本不变。 A温度 B pH C渗透压 D氧气浓度3电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。 A相同 B相反 C相对 D相向4. 哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（ ）与氧气的运输有关。 A血红蛋白 B肌红蛋白 C肌动蛋白 D肌球蛋白,B,B,B,A,5血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。 A白细胞 B血小板 C红细

17、胞 D淋巴细胞6为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）。 A. NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠7将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层， 其中第3层是（ ） A无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物,C,D,C,1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是A 弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种蛋白质的功能C 弄清各种蛋白质的合成过程D 获得高纯度的蛋白质,2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于

18、相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较,3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少 B 分子的大小C 肽链的多少 D 分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A 调节pH B 维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长 D 防止血液凝固,6、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是：有机溶剂-脂类物质-血红蛋白溶液-红细胞破碎物沉淀,1.答:凝胶色谱法也称为分配色谱法,它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一.

19、所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体,这些小球体大多数是由多糖类化合物构成,小球体内部有许多贯穿的通道,当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时,各分子在色谱柱内进行两种不同的运动,即垂直向下的运动和无规则的扩散运动. 相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部,只能分布在颗粒之间,通过的路程较短,移动速度较快;相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道,通过的路程较长,移动速度较慢.因此,样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出,相对分子质量中等的分子后流出,相对分子质量最小的分子最后流出,这种现象又叫分子筛现象.,1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的?,课后练习,答:在一定范

20、围内,能对抗外来少量强酸,强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用,具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液.缓冲溶液通常是由一或两种缓冲剂溶解于水中制得,调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液. 缓冲溶液的作用维持反应体系的pH不变.在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的,受到氢离子浓度的严格调控.为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境,就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH.,2.什么是缓冲溶液?它的作用是什么?,原理：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程.许多重要的生物大分子,如氨基酸,多肽,蛋白质,核苷酸,核酸等都具有可

21、解离基团,它们在某个特定的pH下会带上正电或负电;在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动.作用：电泳技术就是在电场的作用下,利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小,形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,从而达到对样品进行分离,鉴定或提纯的目的.,3.电泳的作用及其原理是什么?,答:血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步,包括:样品处理,粗分离,纯化和纯度鉴定.首先通过洗涤红细胞,血红蛋白的释放,离心等操作收集到血红蛋白溶液,即样品的处理;再经过透析去除分子量较小的杂质,即样品的粗分离;然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去,即样品的纯化;最

22、后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定. 答:血红蛋白是有色蛋白,因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液.这使血红蛋白的分离过程非常直观,大大简化了实验操作.,4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗?,5.与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点?这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义?,3、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：,2.试剂的配制：,鉴定血红蛋白纯度。,1.目的：,丙烯酰胺和N, N-亚甲基双丙烯酰胺: 用去离子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N, N-亚甲基双丙烯酰胺的贮存液。十二烷基硫酸钠（SDS）: 用去离子水配成10%的贮存液，于室温保

23、存。用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液。TEMED ：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。用去离子水配制10% 过硫酸铵：作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。Tris甘氨酸电泳缓冲液：25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%的SDS。样品处理液： 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。染色液： 0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。脱色液

24、：10%的甲醇和10%的冰醋酸。,1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。 2、TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。 3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。,注意事项：,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳, SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备：用去离子水4.6 mL，30%的丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8的Tris缓冲液2.5 mL，10%的SDS 0.1 mL，10%的过硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均匀，迅速灌注

25、在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5 cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高23 mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。配制SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液用去离子水2.7 mL，30%的丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8的Tris缓冲液0.5 mL，10%的SDS0.041 mL，10%的过硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满

26、梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。,（1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板,（2）SDS聚丙烯酰胺凝胶制备：,3、电泳方法步骤,（3）样品处理：在电泳样品中按11体积比加入样品处理液，在100 温度下加热3 min，以使蛋白质变性。（4）浓缩胶聚合完全后（30 min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。（5）加样：按顺序加样，加样量通常为1025 L。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品（6）电泳：将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm处，关闭电源。（7）剥胶：从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。（8）染色：将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1-2 h。（9）脱色：染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱色3-10 h，其间需多次更换脱色液至背景清楚。（10）观察结果：SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。,3、电泳方法步骤,