蛋白质组双向电泳原理及实验步骤ppt课件.ppt

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1、,中南大学湘雅医学院 精神卫生1201班 吴所谓 方 圆,蛋白质组双向电泳,蛋白质组（Proteome）： 在一种细胞内存在的全部蛋白质。蛋白质组研究中主要应用的技术包括： 双向电泳(2-DE)、 新型质谱(MS)技术、 数据库设置与检索系统等。,第一向：等电聚焦,charge,size,第二向：SDS-PAGE电泳,样品制备（Sample preparation）固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration）第一向等电聚焦（IEF）胶条的平衡（IPG strip equilibration）第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis）凝胶的染

2、色及检测（Detection/Staining）PDQuest软件分析（Software analysis）质谱鉴定（Protein identification）,双向电泳实验流程,样品制备基本原则：,使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态，制备方法应具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。,可溶性样品,固体组织样品,细胞,不同样品的基本处理方法,样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可

3、降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。,双向电泳样品的溶解,是成功进行双向电泳的最关键因素之一溶解的目标：样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液；必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；保证样品在电泳过程中保持溶解状态。溶解的手段： 离液剂、去垢剂、还原剂、两性载体电解质,More Data with Narrow Range IEF,pH 3-10,pH 3- 6,pH 5- 8,pH 7-10,Broad Range Separations,聚焦时间的优化,要获得高质量的图

4、谱以及很好的试验重复性，所需的最佳时间即为等电聚焦达到稳定态所需的时间。聚焦最佳时间由不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。,两维间的平衡,等电聚焦电泳结束后可马上进行第二向电泳，也可于80保存数月。但在第二向电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而使SDS-PAGE电泳能顺利进行。,二维SDS-PAGE,同普通SDS-PAGE类似。但一般在垂直电泳系统中

5、无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。,样品制备（Sample preparation）固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration）第一向等电聚焦（IEF）胶条的平衡（IPG strip equilibration）第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis）凝胶的染色及检测（Detection/Staining）PDQuest软件分析（Software analysis）质谱鉴定（Protein identification）,双向电泳实验流程,最高电压10,000 V

6、1025C 温度控制7, 11, 17, 18, 和 24 cm的聚焦盘，可以各放12根胶条可以储存10个程序，每个程序有10步程序可进行时时编辑可供选配的打印机,等电聚焦程序的设置,7cm胶条水化12小时（17）被动水化S1250V慢速30分钟除盐S21000V快速60分钟除盐S34000V线性3小时升压S44000V快速24,000伏小时聚焦28,000伏小时S5500V快速任意时间保持l选择所放置的胶条数。l设置每根胶条的极限电流。（30-50A/根）l设置等电聚焦时的温度。（17）,配制SDS-PAGE凝胶,配制12%的丙烯酰胺凝胶，直接用双向电泳专用梳子；或在上部留0.5cm的空间，

7、用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封胶。聚合30分钟。待凝胶凝固后，拔去梳子，用MilliQ水冲洗；或倒去分离胶表面的乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗，备用。,胶条的平衡,冰箱中取出的胶条，于室温放置10分钟。配制胶条平衡缓冲液 I 。吸去胶条上的矿物油及多余的样品。第一次平衡。振荡15分钟。 配制胶条平衡缓冲液 II 。第二次平衡 ，振荡15分钟。吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1电泳缓冲液。,SDS-PAGE电泳,在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/7cm

8、），待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（15-20mA/gel/7cm），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。,考马斯亮兰染色Bio-Safe染色,水洗3次，5min/次。Bio-Safe染色1小时。水洗30min.,双向电泳技术在病原微生物蛋白质组学研究中挥着重要作用，可用于研究样品总蛋白、不同样品蛋白质表达差异、蛋白质间相互作用、蛋白质修饰等。病原微生物的蛋白质组学研究，可以了解其毒性因子、致病机理以及药物抗性等方面，对疾病的诊断、治疗和预防非常重要。 目前病原微生物蛋白质组学和肿瘤蛋白质组学的研究正在兴起，而双向电泳技术是研究蛋白质组学最关键的技术之一，广泛应用于生物医学领域的研究工作，如通过寻找差异蛋白质，发现疾病相关的蛋白质，寻找用于诊断的疾病相关标记分子，寻找疾病相关的蛋白质药靶，以用于药物设计，研究疾病的致病机理等。随着蛋白质组学相关技术的发展，如液相，蛋白质芯片结合技术的应用，蛋白质组学必将得到进一步的发展，并在疾病的发病机制、诊断和治疗方面发挥重要的作用。蛋白质组双向电泳技术为人类疾病，特别是恶性肿瘤的早期诊断和治疗方面已显示出了广阔的前景，必将造福于人类。,