蛋白质与蛋白组学ppt课件.ppt

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1、第三章,Protein，proteome and proteomics,蛋白质、蛋白质组与蛋白质组学,Protein是执行生命功能的大分子 结构蛋白、运输蛋白、信号蛋白、调节蛋白、马达蛋白一、蛋白质的化学组成二、蛋白质分子结构三、蛋白质结构与功能的关系四、蛋白质的分离纯化五、蛋白质的理化性质六、蛋白质分子序列及空间结构分析,第一节 蛋白质的结构与功能,一、蛋白质分子的化学组成,C、H、O、N、S等普遍存在，部分蛋白质含有P、Se或其他金属元素。 蛋白质的N元素含量较为稳定，平均含氮量约为16 N克数/每克样品6.25100=蛋白质含量（g%）,(一)组成蛋白质的氨基酸种类,体内Pr由20种-氨

2、基酸（amino acid AA）构成。除Gly外，均为L-AA,根据 R 不同将20种AA分为四类：非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸,非极性疏水性AA,AA的R侧链是脂肪烃或芳香烃-疏水基团。 烃链越长疏水性越大。存在部位：常因相互疏水作用而处于球状蛋 白内部或生物膜的跨膜双脂层中。,极性、中性AA（不解离极性AA）AA的R侧链是带有极性的烃基、巯基和酰胺基团，故有 亲水性，但不解离.,(二)氨基酸的理化性质,1.氨基酸是两性电解质,AA等电点（isoelectric pH, pI） 当溶液的pH值达到某一特定值时，AA所带正负电荷相等，AA分子净电荷为零，对外不显电性时

3、溶液的pH值称之。,2.AA分子的水溶性 AA由于侧链极性不同而导致在亲水环境中溶解度不同，据此将AA分为： 亲水类：Arg/Asp/Asn/Glu/Gln/Cys/Gly/His/Lys/Thr/Ser 疏水类： Ala/Ile/Leu/Met/Phe/Pro/Trp/Tyr/Val,AA的侧链可以直接影响Pr或者多肽链的空间折叠方式。胞质蛋白中富含疏水氨基酸的构成肽段大多折叠于蛋白质分子的内部，而亲水氨基酸构成肽段则排列于蛋白质表面。,3. 部分AA有紫外吸收峰 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸都有芳香环侧链，其中的共轭双键可以在280nm的紫外线形成吸收峰 ，可作为分析样品中Pr含量的方法。,4

4、.茚三酮反应 茚三酮和-AA共热，AA脱去其氨基和羧基，茚三酮被还原，产物可以和脱下的氨基再结合一分子茚三酮形成蓝紫色化合物，在570nm具吸收峰，由于吸光度与AA脱氨量有关，可据此测定AA含量.,5.成肽反应 AA之间可以通过氨基和羧基脱水缩合形成酰胺结构，连接的化学键叫做肽键（peptide bond）,二、蛋白质分子的结构,蛋白质或多肽是AA的聚合体，氨基酸通过肽键连接形成肽（peptide）。肽平面: 肽中AA之间肽键的六个原子在同一平面，连接羧基的1碳原子和连接氨基的2碳原子在对角位置 。,Motif 模体,结构域,Pr的二级结构（secondary structure）： Pr分子

5、中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链的主链骨架原子的相对空间位置，不涉及AA侧链的构象 化学键： H 键,螺旋（ helix）折叠（ sheet） 转角（ turn）无规卷曲（random coil）,蛋白质的一级结构（primary structure）： 肽链中AA残基（residue）的排列次序。 化学键： 肽键、二硫键,空间结构的折叠需要分子伴侣的参与,螺旋结构,折叠,转角,转角,1与3氨基酸残基之间形成氢键。,17,蛋白质的超二级结构和结构域超二级结构(supersecondary structure） * ： 由相邻的几个二级结构相互作用形成有规则的组合体。是特殊的序列或结构的基

6、本组成单元，又称基序或模序（motif)*.可进一步组建成结构域。超二级结构包括： 、 、 组合。,钙结合蛋白中结合钙离子的模序,锌指结构,蛋白质的三级结构tertiary structure 一条完整多肽链全部氨基酸的相对空间位置 化学键：氢键、疏水作用、离子键、范德华力,结构域(domain)：在超二级结构的基础上进一步组合折叠形成半独立较紧密的球状结构，具有简单的生物学功能。 结构域是多肽链的一个部分,它们可用限制性蛋白酶从多肽链上切割下来而不改变其性质。 结构域的组合就形成了Pr的完整三级结构。,催化结构域,NAD+结合结构域,19,结构域有两个重要的功能*：第一，像亚基那样，能作为一

7、个模式结构来有效地参与 蛋白质分子的装配。 独立结构域的存在可以把蛋白质肽链的折叠、盘 曲过程简化为个别的简单步骤。 这对于分子量很大的蛋白质来说更显得特别重要。第二，结构域能够活动。对底物的结合、变构控制以及 巨大结构的装配具有决定作用。,蛋白质的四级结构 蛋白质四级结构（quaternary structure）指的具有几条肽链的蛋白质各条肽链的空间布局 化学键：各亚基之间主要靠疏水作用相互结合，氢键、离子键和范得华力也参与四级结构的维持。,亚基（subunit）： 蛋白质四级结构中独立结构的肽链,四级结构的蛋白质，单独的亚基没有生物活性,三、蛋白质分子结构和功能的关系,蛋白质一级结构是空

8、间结构的基础 特定的空间构象主要是由蛋白质分子中肽链和侧链R基团形成的次级键来维持一级结构相似的蛋白质，其构象及功能也相似 促肾上腺皮质激素(ACTH)和促黑激素(MSH)均 为垂体分泌的多肽激素。ACTH 410位的氨基酸结构与MSH的1117位一样，故ACTH有较弱的MSH的生理作用 Pr一级结构中参与功能活性的残基(关键部位)，发生异常改变其功能 镰状RBC贫血( GluVal),22,镰刀型红细胞性贫血：,*,仅发生在一级结构中： 6Glu换成6Val 由此引起： 三级结构多一疏水键， 四级结构发生线性缔合结果：导致红细胞发生溶血,蛋白质的功能与其空间构象密切相关 构象发生变化，其功能

9、活性也随之改变： 在生物体内，当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合，触发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其功能活性的变化，这种现象称为蛋白质的别构效应(allosteric effect)。,如：寡聚蛋白质的一个亚基和配体结合后改变了构象，这种构象的变化传递可影响其他的亚基构象，进而改变了分子的生物学活性。,协同作用-各亚基之间的相互作用 是通过亚基间构象改变的传递作用产生的。 正协同效应：如果1个亚基和配体结合，使另1个亚 基与配体的结合更容易了 负协同效应：若亚基结合的配体相同，为同种协同 效应，如配体不同则为异种协同效应,蛋白质的结构与功能之间的关系主要表现在两方面：1.蛋白质

10、的高级结构是由一级结构氨基酸顺序决定的。2.蛋白质的高级结构是蛋白质分子发挥其生物功能的重 要保证。,四、蛋白质的理化性质,(一)蛋白质的两性解离 蛋白质除了N端的氨基和C端的羧基可以解离外，侧链中的某些基团在一定pH环境下也可以解离 蛋白质分子所带电荷状况决定于特定pH环境下所有氨基酸残基可解离集团的的荷电情况。蛋白质的等电点（pI）： 当蛋白质分子在某一pH值的溶液中解离成正、负离子的趋势相等，成为兼性离子，净电荷为零时溶液的pH值,(二)蛋白质的胶体性质 蛋白质分子具有胶粒(0.0010.1m)的特性。 其溶液稳定原因： 1.表面常是亲水AA，可以结合水分子在蛋白 质表面形成一层水化膜，

11、从而阻断蛋白质分 子相互靠近聚集，防止蛋白质析出。 2.由于蛋白质带有电荷，同种电荷相互排斥 使得蛋白质不能聚集。,(三)蛋白质的变性、沉淀和凝固 变性：在某些理化因素作用下，Pr空间构象被破坏从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失-蛋白质的变性（denaturation）。 主要破坏二硫键和次级键，不涉及肽键。,加热、乙醇等有机溶剂、强酸强碱、重金属等可以使蛋白质发生变性。 复性：蛋白质变性如果程度较轻，在去除变性因素后恢复或者部分恢复其原有的构象和功能-复性 （renaturation）,蛋白质经强酸强碱变性后仍可以溶解于强酸强碱溶液中，将pH值调至等电点时，变性蛋白质立即变成絮状物，此

12、絮状物仍可以溶解于强酸强碱溶液中，再加热时絮状物变为坚固的凝块，此凝块不再溶于强酸强碱，称为蛋白质的凝固（coagulation）,蛋白质的沉淀、凝固 变性的蛋白质肽链之间相互缠绕聚集从溶液中析出的现象-蛋白质的沉淀。,(四)蛋白质的紫外吸收 蛋白质含有芳香族氨基酸，在280nm处有吸收峰。 在一定范围内, 蛋白质溶液浓度与A280nm成正比。,(五)蛋白质的呈色反应 Pr水解产生AA也可发生茚三酮显色反应 Pr在稀碱溶液中和硫酸铜共热时可以呈现紫色或 者红色，称为双缩脲反应。,(一)透析(dialysis)及超滤,原理：利用Pr不能透过半透膜而将Pr与小分子物质分开,截留分子量的超滤膜（正压

13、或离心）,半透膜,五、蛋白质的分离纯化,（二）常用沉淀方法,1.盐析(salt precipitation)原理- 将（NH）2SO4、Na2SO4、NaCl等加入蛋白质溶液，破 坏蛋白质在水溶液中的稳定性因素而沉淀。2、丙酮、乙醇等有机溶剂沉淀（1）原理：极性较大有机溶剂破坏pr水化层导致Pr沉淀析出；（2）04，丙酮10倍于Pr溶液体积，尽快操作，防止变性。3. 免疫沉淀 Pr具有抗原性，用特异抗体形成免疫复合物，沉淀分离,（三) 电泳（electrophoresis)：,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。电泳：通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种

14、蛋白质的技术。分类： 纸电泳 凝胶电泳 等,（四）应用相分配或亲和原理-层析 分离 (chromatography),层析也叫色谱是分离蛋白质常用的方法： 当蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，待分离蛋白质颗粒大小、电荷多少、亲和力差异等不断将蛋白质在固定相中重新分配，并且以不同速度流经固定相。 层析法分离、纯化：Pr、多肽和AA,蛋白质溶液流经固定相的阴离子交换树脂时带负电荷的蛋白质成分就与固定相结合，而带正电荷的成分则完全通过固定相，进一步用带负电荷的溶液（如Cl-）洗脱固定相就可以得到蛋白质。,离子交换层析-阳离子交换层析 （阴离子交换层析） 依据：Pr和AA一样，是两性电

15、解质，在某一 特定pH时，各蛋白质的电荷量及性质不同。,35,固定相：1.纤维素- DEAE纤维素、 CM纤维素2.葡聚糖,凝胶过滤(gel filtration)（分子筛）,原理： 层析柱中填满带有小孔的颗粒（一般由葡聚糖制成）。Pr溶液加于柱的顶部，任其往下渗漏，小分子蛋白质进入孔内，因而在柱中滞留时间较长，大分子Pr不能进入孔内而径直流出，因而不同大小的Pr得以分离。,37,38,39,亲和层析法1.原理：利用生物高分子具有能和某些相对应的专一 分子可逆结合的特性。 如，酶的活性部位能和底物抑制剂辅助因子专 一性地结合,改变条件又能使这种结合解除. 酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之

16、 间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结 合蛋白与结合物之间。 这些被作用的对象物质称之为配基（ligand) 。,40,固定相-配基固定在固相载体上,(五)利用蛋白质颗粒沉降行为- 超速离心 （ultracentrifugation),原理： Pr在高速离心时，在溶液中逐渐下降，直至其浮力与离心所产生的力相等，此时沉降停止。 不同Pr其密度与形态不同，沉降停止的位置就不同，从而达到分离Pr的目的。,密度梯度离心,六、蛋白质分子序列及空间结构分析,蛋白质序列测定： Sanger逐级降解、末端分析、再结合Edman降解法测定肽段的AA序列 基因着手-先找到编码特定蛋白质的DNA序列及 mRNA序

17、列，推出AA序列。空间结构测定： 物理方法 X衍射，核磁共振等， 计算机辅助生物信息学,43,第二节 蛋白质组与蛋白质组学,1994年9月在意大利Marc Wilkins正式提出了蛋白质组（proteome）的概念。用于指代特定时间一个基因组或者一种组织产生并利用的所有蛋白质。,差异蛋白质组学的研究方法和应用,(一)差异蛋白质组学的研究内容 比较蛋白质组学 寻找不同生理或者病理状态下组织或细胞的蛋白质组变化，鉴定并研究这些差异蛋白在生命过程中的作用。,1.蛋白质鉴定 2.蛋白质的修饰 3.蛋白质功能确定,1.蛋白质鉴定 用电泳结果分析差异蛋白分子量、pI等,结合蛋白杂交、免疫学检测初步鉴定蛋白

18、质种类。 2.蛋白质的修饰 确定蛋白质的化学修饰类型 3.蛋白质功能确定 酵母杂交技术、噬菌体展示技术、RNA干扰技术,(二)差异蛋白质组学研究方法及技术路线 1. 研究方法 激光俘获显微切割技术（laser capture microdissection，LCM） 新型原位技术 特异的从组织中分离出某一种细胞，可以高通量、高 精度、迅速的得到组织来源的某一种细胞。 酵母杂交技术（yeast hybridization） 适用于研究生物大分子之间的相互作用 噬菌体表面展示技术(phage surface display) 用于研究蛋白质相互作用的技术。,2. 技术路线 细胞分离和蛋白质的提取

19、双向电泳: 第一相等电聚焦;第二相SDS-PAGE, 染色(考马斯亮蓝/银染/荧光染色) 扫描图像经过计算机处理发现差异点,手工或者自动切取蛋白斑点(差异点) 脱盐等处理以后可以进行质谱分析初步测定蛋白质的一级结构。或对蛋白质进行酶解以后采用高效液相色谱分析蛋白质的氨基酸序列。 此外可对蛋白质的化学修饰进行分析。,(三)差异蛋白质组学的应用进展,1.筛选诊断标志物 2.研究发病机制 3.研究药物作用机制 4.监测疾病进展和疗效观察,研究方法处于发展阶段，许多问题亟待解决,三、蛋白质组学的前景,第三节 蛋白质的生物合成及其干扰,蛋白质生物合成称为翻译（Translation），即把mRNA分子中

20、碱基排列顺序转变为蛋白质或多肽链中的氨基酸排列顺序过程。 参与蛋白质生物合成的成份至少有200种，主要由mRNA、tRNA、核糖核蛋白体以及有关的酶和蛋白质因子共同组成,一、参与蛋白质生物合成的物质,（二）氨基酸的“搬运工具”tRNA,（三）肽链合成的“装配机”核糖体,（一）mRNA合成多肽链模板,53,ATP+氨基酸+tRNA 氨酰-tRNA+ AMP+PPi 原核细胞中起始氨基酸活化后，还要甲酰化，形成甲酰蛋氨酰tRNA，由N10甲酰四氢叶酸提供甲酰基，而真核细胞没有此过程,二、蛋白质的生物合成过程,（一）氨基酸的活化 在进行合成多肽链之前,氨基酸必须与其特异的tRNA结合（氨基酰tRNA

21、合成酶催化）,（二）多肽链合成的起始,大肠杆菌细胞翻译起始复合物形成的过程 1. 核糖体30S小亚基附着于mRNA起始信号处 2. 30S前起始复合物的形成 3. 70S起始复合物的形成,真核细胞蛋白质合成的起始 起始复合物的形成需要更多的起始因子（eIF） 1.需要特异的起始tRNA，即tRNAfmet，并且不需要N端甲酰化。 2. 起始复合物形成在mRNA5端AUG上游的帽子结构；3. 真核细胞起始复合物的形成过程是： a. eIF-3结合在40S小亚基上促进60S大亚基解离； b. eIF-2与Met-tRNAfmet及GTP结合，先与40S小亚基结合； c.eIF-5使“Met-tRN

22、AfmetGTPmRNA-小亚基”与60S大亚基结合，形成80S复合物(eIF-5水解GTP供能) 。 d.经eIF-4D激活而成为具有活性的80S起始复合物。,（三）多肽链的延长,沿mRNA53方向 在多肽链上每增加一个AA都需经进位/转肽和移位三个步骤。 进位: 密码子所特定的AA-tRNA结合到核蛋白体的A位; 需三种延长因子-EF（EF-Tu）, EF(EF-Ts)和依赖GTP转位因子参与； 转肽：肽键的形成 P位和A位上两个AA之间在转肽酶作用下，P位-AA提供-COOH基，与A位AA-NH2形成肽键，使P位AA连接到A位AA的氨基上; 移位: 形成的肽位于A位，P位上游离tRNA脱

23、落，核蛋白体沿着mRNA向3端方向移动一组密码子，使得原来结合二肽酰tRNA的A位转变成了P位，而A位空出，可以接受下一个新的氨基酰tRNA进入，移位过程需要EF-2，GTP和Mg2+的参加,（四）翻译的终止及多肽链的释放,终止密码子：UAG，UAA，UGA （原核、真核生物同） 特殊的蛋白质因子促成终止作用-释放因子： 原核生物-RF1、RF2T 、RF3； 真核生物-eRF,RF作用于A位点，使转肽酶活性变为水解酶活性，将肽链从结合在核糖体上的tRNA的CCA末端水解下来，然后mRNA与核糖体分离，最后一个tRNA脱落，核糖体在IF-3作用下，解离出大、小亚基,核糖体循环ribosome

24、cycle ： 解离后的大小亚基又重新参加新的肽链的合成，循环往复，所以多肽链在核糖体上的合成过程又称。,多核糖体循环： 蛋白质开始合成时，第一个核糖体在mRNA的起始部位结合，当核糖体向mRNA的3端移动一定距离后； 第二个核糖体又在mRNA的起始部位结合，向前移动一定的距离后，在起始部位又结合第三个核糖体，依次下去，直至终止。,每个核糖体都独立完成一条多肽链的合成，所以这种多核糖体可以在一条mRNA链上同时合成多条相同的多肽链，这就大大提高了翻译的效率,(三）阮病毒（proteinaceous infectious agents, piron) 阮病毒它只有蛋白质而无核酸，但却既有感染性，

25、又有遗传性，并且具有和一切已知传统病原体不同的异常特性。 是人和哺乳动物的亚急性海绵样脑病等中枢神经退行性病变的感染因子。 是一种蛋白质感染颗粒，不含核酸 1997年，诺贝尔生理医学奖授予了美国生物化学家斯坦利普鲁辛纳（Stanley B.P Prusiner），因为他发现了一种新型的生物朊病毒。,1.朊病毒性质与结构 其病毒大小3050nm，电镜下见不到病毒颗粒结构；可聚集。 其对多种灭活作用表现出惊人的抗性 生物学上： 慢性感染不表现免疫原性；不受干扰素作用。,Prion是一种与传统病原微生物完全不同的致病因子, 其化学本质是细胞表面糖蛋白朊蛋白(prion protein , prp)

26、三维构象变构而成 迄今尚未发现其具有核酸成分, 是一种具有致死性传染力的蛋白颗粒。,2.朊病毒的结构和PrP基因 PrP可分： 正常型(对蛋白酶敏感)-基因表达的正常产物为 3335KD的蛋白质称 PrPc 疾病型(抗蛋白酶水解) -是PrPc的异构体，27-30 KD， 称PrPsc,即朊病毒。,朊病毒蛋白有两种构象： 细胞型（正常型PrPc, Prion Protein cellular ） 搔痒型（致病型PrPsc, sc stands for scrapie, the prion disease of sheep ）,3.分子机制：,两者的主要区别在于其空间构象上的差异：PrPc二级结

27、构中主要以-螺旋结构为主，约占40%，仅存在少量 -片层结构。溶解于非变性剂溶液，对蛋白酶K敏感。PrPSc含有50%的-片层结构， 20%的-螺旋。不溶于非变 性剂溶液，当用蛋白酶作限制性消化时，只是在氨基端的序列被部分切割，形成对蛋白酶具有抗性的PrPsc。,人、哺乳动物、禽类、果蝇和线虫等无脊椎动物、酵母基因组中都有PrP基因( PrnP)。 PrP基因： 单一基因 在进化过程中表现出了高度的保守性。 5端是非编码外显子，3端是编码外显子，中 间被内含子分隔开。 编码序列仅限于一个外显子，这样就排除了转录 水平因拼接不同而造成PrP存在两种不同异构体的 可能。 启动子区域没有常规的“TA

28、TA”盒，而含有 “GCCCCGCCC3个重复序列，与管家基因结构相似,4.阮病毒的复制究竟这种具有异常构象的蛋白PrPSC在进入机体后如何复制自身从而产生更多的PrPsc，现在主要有两种学说： 模板依赖形式（template-directed model） 成核-聚合形式 （nucleation-polymerization formalism）,具有复制能力,转变为新生分子,5.阮病毒病-人和哺乳动物的多种神经系统疾病朊病毒病特点：潜伏期特别长- 一般为数月乃至数十年的时间病程进行缓慢朊病毒从一个物种传递到另一个物种往往伴随潜伏期 的延长，这种现象称为“物种屏障”。病理学特点：大脑皮质的神

29、经元细胞退化、空泡变性、死亡消失，被星状细胞取代，神经胶质增生，细胞外淀粉样变性蛋白质沉积，大脑皮质变薄而白质相对增加，造成海绵状态，故称为海绵脑病或白质脑病。,阮病毒病的共同特征：为致死性中枢神经系统的慢性退化性疾患临床可出现痴呆、共济失调、震颤等症状。 人类阮病毒病可分为传染型、遗传型和散发型3种形式传染型-指朊病毒在人群中水平传播而引起的一类朊病毒性疾病遗传型-它们是生殖细胞突变形成的。 散发型-可能与体细胞突变或朊病毒蛋白（prion protein, PrP） 的自发性构象改变有关。,朊病毒发现的意义： 从理论上讲，“中心法则”认为DNA复制是“自我复制”，即DNADNA，而朊病毒蛋

30、白是PrPPrP，是为“自他复制”。 这对遗传学理论有一定的补充作用。但也有矛盾，即”DNA蛋白质”与“蛋白质蛋白质”之间的矛盾。,朊病毒致病机制 朊病毒本身不能繁殖，它是通过胁迫正常蛋白畸变而进行自我复制。 其复制途径大致如下： 一个PrPsc分子击中一个PrPc分子，PrPc在PrPsc的胁迫下结构发生变化，形成PrPsc二聚体；接着2个PrPsc分子再分别击中2个PrPc产生4个PrPsc分子。如此循环，当PrPsc累积到一定浓度后就会损坏神经元 PrPc 部分-螺旋在PrPsc 类似区域为折叠结构。 解释模型： 催化模型；结晶模型,三、蛋白质生物合成的干扰 （参阅本科生化教材）,（一）

31、分子病（molecular diseases） DNA分子异常导致蛋白质合成异常的遗传病。 镰刀状RBC贫血(错义突变所致) （二）蛋白质生物合成的阻断剂 1.抗生素类阻断剂 链霉素、卡那霉素、新霉素等 四环素和土霉素 ； 氯霉素 ； 嘌呤霉素 2.作为蛋白质合成阻断剂的毒素 细菌毒素与植物毒蛋白 3.阻断蛋白质合成的其它蛋白质类物质 干扰素,翻译后加工（Posttranslational processing）,肽链从核蛋白体释放后，经过细胞内各种修饰处理，成为有活性的具有天然构象的成熟蛋白质的过程。,第四节 蛋白质合成后加工,包括：,多肽链折叠为天然的三维构象；肽链一级结构的修饰；空间结构

32、的修饰等； 靶向输送到特定细胞,一、多肽链折叠为天然功能构象的蛋白质多肽链合成后需要逐步折叠成天然空间构象才成为有功能的蛋白质。时间：新生肽链的折叠在肽链合成中、合成后完成， 新生肽链N端在核蛋白体上一出现，肽链的折叠 即开始。,细胞中大多数天然蛋白质折叠都不是自动完成，而需要其他酶、蛋白质辅助 ： 分子伴侣 蛋白二硫键异构酶 肽-脯氨酰顺反异构酶,1分子伴侣*（molecular chaperon） 是细胞中一大类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象（不稳定构象），促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠（稳定构象）。普遍特点-只与Pr分子的非天然构象结合，而不与已经折叠 成天然构象的Pr分子结合,

33、（1）功能-多种多样的 阻止新生肽链的不正常聚集起作用 同时也在阻止胁迫条件下的Pr分子聚集 帮助寡聚体Pr的组装 帮助Pr分子的跨膜转运 使聚集的Pr分子解散 使Pr分子维持一定的构象等等。 介导新复制的DNA和组蛋白装配成染色质； 蛋白质的降解、类固醇激素信号传递中类固醇受体的变构。,（2）作用特点：大多数蛋白质的折叠有一个紧密的暂时的“融解状态”（熔球状，molten globule-like),在这种状态下，可观察到某些二级结构（而不是三级或四级结构），其特征是暴露出一个疏水区域。在这种状态下蛋白质易于聚合。分子伴侣总的作用就是与这些暴露的疏水区域稳定结合。结果： 降低了局部未折叠蛋白

34、质的浓度并防止其非特异性的不可逆的聚合和错误折叠，同时保存了多肽链折叠的能力，当折叠不成功时，可以重新进行折叠。,（3）实质-分子伴侣本身并不包括控制正确折叠所需的构象信息，而只是阻止非天然态多肽内部的或相互间的非正确相互作用。或者说它们给处于折叠中间态的多肽链提供更多的正确折叠的机会。（并未加快折叠反应速度，而是通过消除不正确折叠，增加功能性蛋白折叠产率促进天然蛋白质折叠。）（4）分布： 广泛分布于原核和真核细胞中。 在真核细胞中目前发现它们存在于： 细胞液、内质网、线粒体、叶绿体以及细胞核中。 （存在胞内pr折叠、组装的各部位）,（5）典型分子伴侣介绍细胞至少有两种分子伴侣家族热休克蛋白（

35、heat shock protein, HSP )： 属于应激反应性蛋白，高温应激可诱导该蛋白 合成增加。 包括HSP70, HSP40和GrpE三族，为保守蛋白家族,HSP70：一类MW约70kD的高度保守的ATP酶，广泛 存在原核和真核细胞中（线粒体基质和胞液中）。由两个功能不同的结构域组成： N端的ATP酶结构域和C端的底物结合结构域。,HSP促进蛋白质折叠的基本作用： 结合保护待折叠多肽片段，再释放该片段进行折叠，形成HSP70和多肽片段依次结合、解离的循环。,伴侣素（chaperonins )： 是分子伴侣的另一家族 如E.coli的GroEL和GroES 真核细胞中同源物为HSP6

36、0和HSP10 等家族。主要作用 为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间 构象的微环境。,2蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase, PDI）,PDI是一种含有巯基的酶，能随机切断及催化蛋白质中的二硫键，使之正确重排，形成热力学上最稳定的构象。PDI通过催化巯基与二硫键的交换反应，从而催化蛋白质二硫键的形成、还原（断裂）或重排（异构化）。在蛋白质折叠过程中，主要催化含二硫键的膜蛋白和分泌蛋白的正确折叠。,3.肽一脯氨酰顺反异构酶（peptide prolyl cis-trans isomerase, PPI）脯氨酸为亚氨基酸，多肽链中肽酰一脯氨酸间形成的肽

37、键有顺反两种异构体，空间构象明显差别。可促进上述顺反两种异构体之间的转换。天然蛋白肽链中肽酰一脯氨酸间肽键绝大部分是反式构型，仅6为顺式构型。在肽链合成需形成顺式构型时，可使多肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠。,二、一级结构的修饰,场所：内质网、高尔基复合体 器官的管腔中（外分泌蛋白前体的活化）（一）去除N-甲酰基或N-甲硫氨酸酶：脱甲酰基酶，氨基肽酶 结果：切除N-甲酰基 切除N-末端Met或N-末端一段AA,（二）个别氨基酸的修饰 1.氨基末端乙酰化 6. Pro, Lys OH 2.甲基化 7. Ser, Thr, Tyr 磷酸化 3.氧化（-SH -S-S-） 4.羧基末端的酰胺化 5.

38、谷氨酸残基的羧基修饰,1.氨基末端乙酰化在N-乙酰转移酶的催化下将多肽链的氨基末端（或氨基酸残基侧链氨基）乙酰化。近年发现组蛋白的乙酰化在活化染色质，使它作为转录及复制的模板中起重要作用。核心组蛋白乙酰化后不仅正电荷减少而且由于变构使其与DNA的结合发生改变，包绕在外的DNA松懈，从而能与调控蛋白结合。,核小体中四种组蛋白各两分子构成的八聚体即核心组蛋白。（多富含Lys残基）它们的侧链氨基是乙酰化的位点。,2.甲基化酶：甲基转移酶 存在：胞液（主要）；细胞核（少量）底物：S-腺苷蛋氨酸(SAM, 是Met活化产物），SAM的甲基被高度活化，称为活性蛋氨酸，是体内最重要的甲基直接供给体甲基化位点

39、：Arg, His的侧链；Gln的N-甲基化和 Glu, Asp的O-甲基化.,3.氧化蛋白质多肽链中进行氧化修饰最普遍现象是- 二硫键的生成。酶：二硫键异构酶作用：肽链内或链间的Cys巯基氧化成二硫巯基。,4.羧基末端的酰胺化肽链羧基末端的AA可出现酰胺化，如C端是Gly的蛋白质常被酰胺化，保护它免受羧肽酶的降解。酰胺化分两步： 1）Gly羟基化； 2）脱去一分子乙醛酸并产生新的酰胺化的羧端。结果：缺失了原来作为羧基端的Gly.,5.谷氨酸残基的羧基修饰凝血酶原及其他涉及与钙离子相互作用的凝血因子如，和中均发现有羧基化修饰的羧化谷氨酸残基（Glu残基）。过程：在Glu残基的碳原子上添加羧基结

40、果：Glu的碳原子上有两个羧基作用：能螯合钙离子，在凝血过程中起重要作用。,羧化酶,6.脯氨酸和赖氨酸的羟基化修饰前胶原是成纤维细胞分泌的pr，在生物合成过程中新生的肽链进入内质网腔后，内质网中的脯氨酰-4-羟化酶和赖氨酰羟化酶能分别识别肽链中的GlyXPro和GlyXLys序列，羟化Pro及Lys残基。产物：4-羟基脯氨酸（Hyp)及 羟基赖氨酸（Hyl)残基。原胶原分子中的Lys残基可在赖氨酰氧化酶的催化下形成醛赖氨酸（aiiysine).,（三）水解修饰无活性的蛋白质前体活性的蛋白质或多肽 胰岛素原酶 胰岛素原 胰岛素真核细胞大分子多肽前体数种小分子活性肽类,鸦片促黑皮质素原（POMC）

41、的水解修饰,三、空间结构的修饰（一） 亚基聚合具有四级结构的蛋白质由两条以上肽链通过非共价键聚合，形成寡聚体。如：血红蛋白22,（二） 辅基连接结合蛋白中非蛋白质部分（辅基）通过共价键方式与蛋白质部分相连。各种主要的结合蛋白（如糖蛋白、脂蛋白等），合成后都需要结合相应辅基，成为天然功能蛋白质,（三）疏水脂链的共价连接 某些蛋白质（如Ras蛋白、G蛋白等），翻译后需要在肽链特定位点共价连接一个或多个疏水性强的脂链，包括脂肪酸链、多异戊二烯链等。这些蛋白通过脂链嵌入疏水膜脂双层，定位成为特殊质膜内在蛋白，才成为具有生物功能的蛋白质。,四、 蛋白质合成后的靶向输送,蛋白质合成后的去向：1、保留在胞浆

42、2、进入细胞核、线粒体等细胞器3、分泌到体液，再输送到靶器官、靶细胞 靶向输送*（protein targeting)： 蛋白质合成后经过复杂机制，定向到达其执 行功能的目标地点.蛋白质的修饰反应与靶向输送过程同步完成,蛋白质分子的靶向输送,所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号- 主要为N末端特异氨基酸序列可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这类序列称为信号序列*（signal seguence) .是决定蛋白靶向输送特性的最重要元件.这提示指导蛋白质靶向输送的信息存在于它的一级结构中。靶向不同的蛋白质各有特异的信号序列或成分.,(一）与分泌蛋白的合成、转运有关的组分1.信号肽*（signa

43、l peptide） 未成熟蛋白质的端序列，可被细胞转运系统识别的特征性氨基酸序列。存在：所有分泌pr、部分膜pr、溶酶体pr的N端共 同序列。结构：一般含15-30个AA残基。 N端或接近N端为亲水区、带正电，1-7个AA(亲水极性, 如Arg, Ser, Thr, Lys）； 疏水核心区含疏水中性AA C端-加工区（含极性、小侧链的AA；信号肽 酶裂解的部位）,信号肽作用把合成的蛋白质移向胞膜、与胞膜结合， 并送出胞外。未发现信号肽有保守序列；信号肽似乎没有严格的 专一性： 如将信号肽附加到正常存在细胞液中的球状蛋白 的N端，导致该球蛋白分泌到细胞外。,2.信号识别颗粒（signal re

44、congnition particle,SRP）,存在细胞溶质中，一个长形颗粒（25nm 5nm)由6条多肽链和一分子7S RNA共同构成（约含300个碱基）组成，RNA构成核蛋白的骨架,SRP作用： 1.识别、结合信号肽； 2.将核蛋白体复合体引导到内质网膜上并与受体结合； 3.暂时抑制肽链延长，避免长肽链折叠。,SRP抑制肽链延长，是由于SRP占据了核蛋白体的A位点，阻止了携带AA的tRNA进入核蛋白体，即切断了pr合成原料的进入。SRP在分泌pr的转运过程只起短暂作用，但可循环利用,3.对接蛋白（docking protein，）(SRP受体）存在内质网膜上，由（GTP酶活性）和两个亚基

45、组成。作用：与SRP复合体（SRP、核蛋白体、mRNA、信号肽）互相 识别结合; 结合后再将核蛋白体复合体移交给膜上的核蛋白体受 体（ER膜蛋白，结合大亚基），释放SRP; 恢复翻译。,ER膜上还存在：核蛋白体受体可结合核蛋白体大亚基使其与ER膜稳定结合肽转位复合物（peptide translocation complex)-多亚基跨膜蛋白可形成新生肽链跨膜的蛋白通道,（二）分泌蛋白的靶向输送过程,合成肽链先由信号序列引导进入内质网（endoplasmic reticulum, ER)，蛋白质再分别被包装进分泌小泡转移、融合到其他部位或分泌出细胞。（1）信号肽被识别（2）核蛋白体转移到内质

46、网膜（3）分泌肽进入内质网腔,（三）线粒体蛋白的靶向输送 90以上线粒体蛋白前体在胞液合成后输入线粒体其中：大部分定位基质N端都有相应其他定位内、外膜或膜间隙信号序列如：线粒体基质蛋白前体的N端有保守的2035残基信号序列，称为导肽，富含丝、苏及碱性残基。,（四）细胞核蛋白的靶向输送 多种细胞核蛋白在胞液合成后输入核内，各种大分子及核内组装的核蛋白体亚基都是通过核孔进出核膜。核定位序列（nuclear localization sequence, NLS )所有靶向输送的胞核蛋白多肽链内含有特异信号序列结构：为48残基的短序列，富含带正电的赖、精氨酸及脯氨酸肽链中位置：不只在N末端，可位于肽链

47、不同部位。特点：NLS在蛋白质进核定位后不被切除。不同NLS间未发现共有序列。,真核细胞有丝分裂完成后细胞核膜重建时，在胞液的各种具有NLS的胞核蛋白可被重新靶向导入核中。 新合成胞核蛋白靶向输送涉及几种蛋白质成分：核输入因子（nuclear importin) 和 杂二聚体可作为胞核蛋白受体，识别结合NLS序列。一种小GTP酶Ran蛋白,靶向输送蛋白的信号序列或成分,五、蛋白质在细胞内的降解 氮平衡（nitrogen balance） 半寿期 酶 溶酶体（lysosome）内降解 细胞外蛋白 膜相关蛋白 长半寿期蛋白3. 泛素（ubiquitin）ATP 依赖的蛋白质降解 异常蛋白 短半寿期蛋白,