食品农药残留快速检测ppt课件.ppt

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1、农药残留快速检测技术,学习目标,掌握速测卡法和分光光度法快速检测食品中有机磷及氨基甲酸酯类农药的基本原理及基本技能；熟悉有机磷及氨基甲酸酯类农药的免疫分析检测方法；了解熏蒸剂的检测意义及方法。,农药概况：,农药是指用于农业、林业中各种药剂的统称。特点：高效、快速和使用简便 危害：本身的毒性危害 农药残留所引起的食品安全问题 农药残留所引起的抗药性问题 农药残留所引起的环境污染 按化学结构分类：有机氯类 有机磷类 氨基甲酸酯类 拟除虫菊酯类,农药检测现状：,随着食品中农药残留最高限量标准不断降低，检测难度越来越大，对检测技术的要求也越来越高。这就需要有相应的检测技术与之相匹配，尤其是快速检测技术

2、。与日本严格的农药残留标准相比，中国的标准相对较少。农残检查超标前5名农药，中国都未作农残限量规定；与欧、美等都相差甚远，欧盟农残限量指标28689个，美国农残限量指标7400个。因此，必须适应国际新形势，制定合理的残留新标准。,常用农药的分类及性质,有机磷农药特点：药效高、毒性大、易降解、广谱，成为目前农药生产中吨位最大，也是世界上生产和使用最多的农药品种。,图3-1 有机磷农药结构通式,有机磷农药是典型的酶毒剂，可以通过消化道、皮肤、粘膜、呼吸道吸收。,毒理：对神经突触后膜上的乙酰胆碱酯酶活性的抑制，使酶不能催化乙酰胆碱水解，导致组织中乙酰胆碱过量蓄积。乙酰胆碱传导介质代谢紊乱，可导致迟发

3、性神经毒性，引起运动失调、昏迷、呼吸中枢麻痹、瘫痪甚至死亡。,常用农药的分类及性质,氨基甲酸酯类农药(NMCs)是继有机磷之后出现的一类农药。NMCs的结构特性是含有一个N-甲基基团，为白色晶体，难溶于水，易溶于丙酮、二氯甲烷、氯仿、乙腈等，碱性和高温条件下很易被水解。,具有杀虫效力强、作用迅速等特点。它的最大优点是在植物中只短暂停留，施用后很短的时间内就可被降解成相应的代谢产物，这些代谢产物通常具有与母体化合物相同或更强的活性。,20世纪70年代以来，由于有机氯农药受到禁用或限用，以及抗有机磷杀虫剂的昆虫品种日益增多，因而NMCs的用量逐年增加，这就使得NMCs的残留情况倍受关注。,食品安全

4、快速检测,超临界萃取（SCFE）,常用农残快检方法,1、酶抑制法,2、免疫分析法,3、生物传感器法,要求：快速、灵敏、便捷,意义：作为实验室检测的辅助方法，对大量样品加以定性筛选，以减少送实验室定量检测的压力。,农药残留快速检测方法：,1、酶抑制法：利用农药对胆碱酯酶的抑制作用，加入特定的显色剂，通过颜色深浅的变化确定是否有农药残留或农药残留相对量的快速检测方法。特点：造价不高，试剂生产已成规模，稳定性好，操作简便、速度快，特别适宜现场检测或对大批量样品的筛查，目前普遍使用。,关键：如何选择酶源酶源： 来自动物的胆碱酯酶 从植物中提取的植物酯酶,动物酶原：,超临界萃取（SCFE）,胆碱酯酶广泛

5、存在于动物的组织中。目前主要集中在动物肝脏和血液，如猪肝，鸡血等,也有利用蚯蚓以及海洋鱼类，甲壳类动物的神经组织、脑组织分离乙酰胆碱酯酶。,1953年stedman等首先从马血清中分离出乙酰胆碱酯酶,动物酶原：,从昆虫提取，如：家蝇、麦二叉蚜、黄猩猩果蝇、烟草天蛾、光叶库蚊、黄粉甲、美洲淤夜蛾、豆荚草盲蝽、马铃薯叶甲、骚扰角蝇及棉铃虫等。,超临界萃取（SCFE）,以从敏感家蝇中提取的乙酰胆碱酯酶效果最佳，研究表明，家蝇羽化后2-3天时其头部的乙酰胆碱酯酶敏感性最高。,不足：保持期短，需冷冻低温保存。,动物酶原：,超临界萃取（SCFE）,原理： 乙酰胆碱酯酶 乙酰胆碱 乙酸 + 胆碱 5，5-二

6、硫代-双-2-硝基苯甲酸 5，5-二硫代-双-2-硝基苯甲酸（黄色）,在410 nm处有最大吸收，测定其在单位时间内的生成量，即可测得乙酰胆碱酯酶的活性。通过测定乙酰胆碱酯酶(AChE)受抑制的程度来检测有机磷或氨基甲酸酯类农药。,植物酶原：,超临界萃取（SCFE）,植物酯酶特点：酶源丰富，提取和保存较为方便，只需以一定比例的水或缓冲液混合离心获得的上清液即可作为粗酶液，并在-4保存即可。测量准确度和精密度均不逊色 。,原理： 植物酯酶乙酸萘酯 乙酸 + 萘酚 显色剂固蓝B 偶氮化合物（紫红色）,酶抑制法,肉眼观察法,目视比色法,速测卡法,酸碱指示剂法,酶片法,试剂盒法,检测箱法,H计测量法,

7、分光光度法,农药残留快检方法：,2、免疫分析法 ：高等动物都有免疫功能，当细菌、病毒和有害物等病原入侵时，能产生抵御外来物的抗体，这就是动物的免疫反应。,致病的外来物被称为抗原。免疫是机体识别和排除进入体内的抗原性异物的保护性反应。免疫反应，即抗原抗体反应，不仅发生在生物体内，在体外亦能进行，而且反应是高度特异(即对特定结构的农药具选择性)，高度灵敏(可达pg/kg-mg/kg水平)。,超临界萃取（SCFE）,农药免疫分析始于1968年，Centeno E.R等人制备了抗滴滴涕和马拉硫磷抗体，应用放射免疫法测定。随后Sernberger. L.等人先后开发出狄氏剂、艾氏剂、苯菌灵、百草枯等农药

8、的免疫分析法。1981年，Ercegovich.R.等研制出对硫磷及2,4滴和2,4,5涕的放射免疫分析法(RIA)分析方法，检测限可达0.1g/kg。,方法溯源：,超临界萃取（SCFE）,局限性：大部分农药的残留量都可以使用气相色谱法等测定，该法并未比气相法更优越人工合成抗原以及制备抗体的困难免疫分析技术未被普遍重视。,方法溯源：,免疫分析中的酶免疫分析法以其高度特异性和灵敏度，特别适合农药残留分析，故在80年代得到了快速发展。,超临界萃取（SCFE）,酶联免疫具有专一性强、灵敏度高、快速、操作简单等优点，试剂盒可广泛用于现场样品和大量样品的快速检测，可准确定性、定量。,方法溯源：,但由于受

9、到农药种类多，抗体制备难度大、在不能肯定样本中的农药残留种类时检测有一定的盲目性以及抗体依赖国外进口等影响，酶联免疫法的应用范围受到较大的限制 。,超临界萃取（SCFE）,目前国外已研制出几十种农药的酶联免疫试剂盒，对于免疫分析技术在农药快速检测中的应用研究十分活跃，包括有机磷类、拟除虫菊酯类、有机氯类、三嗪类、氨基甲酸酯类等。某些有机磷农药的检测限可达到ng甚至pg级，一些试剂盒已经商品化，广泛用于现场样品和大量样品的快速监测。,农药的酶联免疫试剂盒介绍：,目前用于现场快速筛选的有酶联免疫吸附测定法(ELISA试剂盒) 和有机磷农药免疫胶体金快速检测试剂板。,3 生物传感器法,原理：对特定种

10、类化学物质或生物活性物质具有选择性和可反应的分析装置。 传感器中 复杂样品中 + 识别反应 如：酶与底物、 如：光热、 抗体与抗原、 声音、 （如：光敏管压电装置） 外源凝集素与糖、 颜色、 光极光敏电阻、 核酸与互补片段、 电化学 离子选择性电极,显示或记录,特定的目标分析物,物理化学信号,生物敏感层,转化器,转换成第二信号(通常为电信号),放大,生物传感器分类：,优点：测定方法多样化、提高测量灵敏度、缩短反应时间、提高仪器自动化程度和适应现场检测,超临界萃取（SCFE）,生物传感器（根据信号转换器不同）分为：,光学传感器,电化学传感器,测热型传感器,半导体传感器,电化学生物传感器,以电化学

11、电极为信号转换器，和酶、微生物、动植物组织等其他生物识别元件结合组成。 传感器中 复杂样品中 + 酶促反应,显示或记录,特定的目标分析物,电活性物质（化学信号）,酶电极,电极,电信号,放大,光学生物传感器,主要由光纤和生物敏感膜组成。 传感器中 复杂样品中 + 分子识别,显示或记录,待测组分,生物量（生物学信号）,敏感膜中生物活性成分,换能反应,光信号（荧光、磷光等）,放大,其他生物传感器,超临界萃取（SCFE）,农药残留检测的还有电晶体、半导体生物传感器等。,压电石英晶体传感器利用石英晶体对质量变化的敏感性，结合生物识别系统(抗原抗体特异性结合)而形成一种自动化分析检测系统。具有灵敏度高、特

12、异性好、响应快、小型简便等特点，可对多种抗原或抗体进行实时快速、在线连续的定量测定及反应动力学研究，克服了ELISA、RIA、荧光免疫分析法(FIA)等免疫检测方法费时、昂贵、标记及操作繁琐的缺点，具有极广泛的发展前景,石英晶体微量天平(QCM)半导体生物传感器，检测到低于1mg/L的西维因和敌敌畏。,实验室快速检测方法,色谱法,荧光光谱法,气相色谱法（GC),紫外-可见分光光度法,红外光谱法,毛细管电泳（CE）,光谱法,实验室快速检测,高效液相色谱法（HPLC),薄层色谱法（TLC）,色谱-质谱联用法,农药快速检测技术的现状：,超临界萃取（SCFE）,各种不同仪器技术的应用，大大提高了农药残

13、留检测能力和检测的灵敏度、检测限和检测覆盖范围,采用现场快速初筛检测和实验室验证性检测结合，对结果阳性的样品用准确、可靠的方法进行验证，可大大减少分析工作量，提高分析效率，有利于加强农药残留监控的力度。,农药快速检测技术现状：,快速检测方法在应用过程中仍存在不少问题：如：1、酶抑制法容易出现假阳性、假阴性，2、植物内含物对酶反应干扰严重，3、不同批次酶的质量、反应温度、处理时间等对检测结果影响较大，导致检测的专一性、可比性等下降；4、酶联免疫法在分析过程中出现交叉反应，导致检测的可靠性和灵敏度降低，方法难以标准化；5、生物传感测定存在选择性不高,超临界萃取（SCFE）,3-1-1、酶抑制法1、

14、速测卡法可单独使用也可与便携式农药残留速测仪配套使用。原理：利用速测卡中的胆碱酯酶(白色药片)可催化靛酚乙酸酯（红色药片）水解为乙酸和靛酚(蓝色），由于有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的活性有强烈的抑制作用，因此，根据显色的不同，即可判断样品中含有机磷或氨基甲酸酯类农药的残留情况。样品处理分为整体测定法（浸提法）和表面测定法（粗筛法）,超临界萃取（SCFE）,模块3-1 有机磷、氨基甲酸酯类农药快检,便携式农药残留速测仪,目的要求 对照仪器操作说明书，能够熟练操作， 并能举一反三应用类似的快速检测仪。检测原理 便携式农药残留速测仪是根据国家标准方法GB/T5009.199-2003速测卡法（

15、纸片法）而专门设计的仪器。农药速测仪是利用速测卡中的胆碱酯酶（白色药片）催化靛酚乙酸酯（红色药片）水解为乙酸和靛酚（蓝色），由于有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的活性有强烈的抑制作用，因此，根据显色的不同，即可判断样品中含有机磷或氨基甲酸酯类农药的残留情况。器材： 便携式农药残留速测仪、配套农药残留速测卡,操作步骤（P22-23),1、开机 2、装片 3、取样 4、测试,结果判定,与空白对照卡比较阳性结果：白色药片不变色或略有浅蓝色不变蓝为强阳性结果农药残留量较高浅蓝色为弱阳性结果农药残留量相对较低阴性结果：白色药片变为天蓝色或与空白对照卡相同,3-1-1、酶抑制法2、分光光度法原理：在一定

16、条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶有抑制作用，抑制率与农药的浓度呈正比。本法利用酶催化乙酰胆碱水解，水解产物与显色剂反应生生黄色物质，该物质在412nm处有吸收，测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以判断蔬菜中含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留量的情况。,超临界萃取（SCFE）,模块3-1 有机磷、氨基甲酸酯类农药快检,3-1-2、分光光度法仪器：农药残留快速检测仪， 电子天平， 移液枪及配套管嘴， 超声波提取仪， 冰箱， 恒温水浴。,超临界萃取（SCFE）,模块3-1 有机磷、氨基甲酸酯类农药快检,3-1-2、分光光度法试剂：pH8.0缓冲溶液(提取液)：分别称取11.9

17、g无水磷酸氢二钾和3.2g磷酸二氢钾，溶解于1000mL 蒸馏水中。显色剂：分别称取160mg 二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和15.6mg 碳酸氢钠，溶解于20mL缓冲溶液中，4冰箱中保存。底物：称取125mg 碘化硫代丁酰胆碱，溶解于15mL缓冲液中，摇匀后置4冰箱中保存备用。保存期不超过两周。丁(或乙)酰胆碱酯酶：根据酶的活性情况，用缓冲液溶解，3min内的吸光度变化控制在0.4-0.8。摇匀后置4冰箱中保存备用。,超临界萃取（SCFE）,模块3-1 有机磷、氨基甲酸酯类农药快检,步骤：样品处理样品擦去表面泥土剪成1cm见方碎片取样品1g，(非叶菜类取2g) 加入10mL缓冲溶液手摇振荡

18、1-2min（或超声波振荡30s）静置3-5min，待用。对照溶液测试试管中加入100L酶液100L显色剂加入2.5mL缓冲溶液摇匀于37放置10min加入100L底物摇匀（反应并显色）要立即放入比色池记录反应3min时的吸光值A0。,超临界萃取（SCFE）,模块3-1 有机磷、氨基甲酸酯类农药快检,样品溶液测试试管中加入100L酶液和100L显色剂，再加入2.5mL样品提取液，其它操作与对照溶液测试相同，记录反应3min的吸光度变化值At。结果计算及判定结果以酶被抑制的程度(抑制率)表示。抑制率(%)= (A0-At)/ A0100 当蔬菜样品提取液对酶的抑制率50%时，表示蔬菜中有高剂量有

19、机磷或氨基甲酸酯类农药存在，需要重复检验2次以上确定结果。同时可在实验室进一步确定具体农药品种和含量。,超临界萃取（SCFE）,模块3-1 有机磷、氨基甲酸酯类农药快检,注意事项：1、灵敏度高于速测卡法。现在市场上使用的该类仪器品种各式各样，有4通道、5通道、8通道、12通道的，大多是由分光光度计在结果计算功能上进行改进的专用农药残留快速检测仪。该类仪器使用简单方便，直接显现检测结果，配有数据管理软件，检测数据可上传，是目前省市一级对农药残留监督和县区一级日常检测的主要仪器。2、一个合格的试剂来说，它应适合于任意一款的检测仪器,超临界萃取（SCFE）,模块3-1 有机磷、氨基甲酸酯类农药快检,

20、3、试剂质量判别法：取玻璃试管，按试剂的加入顺序和加入量，加入底物，立刻观察溶液颜色变化情况。,超临界萃取（SCFE）,模块3-1 有机磷、氨基甲酸酯类农药快检,注意事项：具体是否能用，需待使用仪器测其空白样的活性才能确定。一般空白样3 min的变化值为0.4-0.8较为合适。如果空白差值小于0.2，最好不用。空白差值在0.20.4，说明酶的活性较低，应当适当加大酶的用量，加大到200L，将空白差值调到0.40.6之间。同时有条件的可使用酶标仪来测定酶的活性，结果更准确。,超临界萃取（SCFE）,模块3-1 有机磷、氨基甲酸酯类农药快检,注意事项：试剂的配制和保存：酶和底物的粉剂必须存放在冰箱

21、的冷冻室(约-18)溶解后的酶溶液如暂时不用，要放在冷冻室内保存，用后的酶液放在冷藏室(05内)，7d内用完酶液做好不要反复冷冻，最多不超过2次，否则会影响酶的活性显色剂和底物液均保存在冷藏室(05)内提取液在常温下保存。,超临界萃取（SCFE）,模块3-1 有机磷、氨基甲酸酯类农药快检,注意事项：叶菜类去烂叶、枯叶，并切成宽度为1cm左右的试样。块太大可能导致提取不完全，太小某些有颜色汁液会影响检测结果；豆类、块茎类取果皮至果肉1cm左右处的表皮试样；葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、蘑菇及番茄汁液中含有对酶有影响的植物次生物质，处理这类样品时，可采取整株(体)浸提，避免次生物质干扰；含叶绿素

22、较高的蔬菜也可采取整株蔬菜浸提的方法以减少色素的干扰。检测前的样品在称量前不能水洗，若沾有泥土或水，可用干净的毛巾擦干净。,超临界萃取（SCFE）,模块3-1 有机磷、氨基甲酸酯类农药快检,注意事项：测试用的样品浸泡液尽量澄清。 措施：静置几分钟再吸取 用中速(或低速)的滤纸过滤酶抑制的温度和时间对酶的活性影响较大。乙酰胆碱脂酶抑制温度2535，时间20min，丁酰胆碱脂酶抑制温度3738，时间30min。在气温高时可缩短培养时间、降低培养温度、快速检测仪预热的时间不要太长等方式来增加检测数据的准确性。,超临界萃取（SCFE）,模块3-1 有机磷、氨基甲酸酯类农药快检,注意事项：本实验用水均为

23、蒸馏水或去离子水。每批样品的控制时间、温度条件必须与对照溶液的条件完全一致。如果吸光度趋于无穷大时，说明测定液浑浊有干扰。,超临界萃取（SCFE）,模块3-1 有机磷、氨基甲酸酯类农药快检,注意事项：假阳性和假阴性。假阳性是由于酶活性降低或失活，导致其在底物中不起作用，底物不能被水解，无法与显色剂结合显色，造成提取液中的农药抑制了酶的活性的假象；假阴性是因为某种农药对某种酶抑制作用很小或无作用而产生的，表现出无农药的假象。除此，在反应过程中化学干扰都有可能导致假阳性、假阴性现象的发生。检测中只能通过选择有较好活性、较强敏感性的酶来尽量减少此类问题的出现。,超临界萃取（SCFE）,模块3-1 有

24、机磷、氨基甲酸酯类农药快检,注意事项：抑制率出现低于-10%的结果，主要是操作中存在系统误差、操作不熟练、加入底物后没有摇匀、水纯度不够等因素造成。同样，当检测结果与空白值接近时，只能说明样品中有机磷或氨基甲酸酯类农药残留低于方法检测限，不能判定为不含有机磷或氨基甲酸酯类农药；也不能判定该样品中其它种类农药残留不超标。,超临界萃取（SCFE）,模块3-1 有机磷、氨基甲酸酯类农药快检,超临界萃取（SCFE）,模块3-1 有机磷、氨基甲酸酯类农药快检,免疫胶体金检测法,结果判定阴性：T线比C线深或一样深，表示样品中有机磷农药浓度低于试剂板检出限或不含农药残留。阳性：T线比C线浅，或T线无显色，表

25、示样品中有机磷农药浓度高于试剂板检出限；T线相比C线越浅，表示有机磷农药浓度越高。无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试剂板已变质失效。判定为无效。在此情况下，应用新的试剂板重新测试。,超临界萃取（SCFE）,模块3-1 有机磷、氨基甲酸酯类农药快检,注意事项：尽量不要触摸试剂板中央的白色膜面。请勿使用过期的试剂板。原包装应储存于430，阴凉避光干燥处，切勿冷冻。,超临界萃取（SCFE）,模块3-1 有机磷、氨基甲酸酯类农药快检,溴甲烷的测定 适用范围：粮谷类中溴甲烷熏蒸剂残留量的测定。检测原理： 溴甲烷随水蒸气整出后被氢氧化钾-醇溶液吸收，经酸化后与过量硝酸银作用，剩余硝酸银与硫氰酸铵作

26、用，生成红色混合物，颜色的深浅与样品中溴甲烷成比例，从而可以求出溴甲烷的含量。,超临界萃取（SCFE）,模块3-2 熏蒸剂的快速检测,主要仪器 水蒸汽蒸馏装置、比色管。试剂6moL/L硝酸5% 氢氧化钾-乙醇溶液0.010moL/L硝酸银溶液0.010moL/L硫氰酸铵标准溶液硫酸铁铵指示剂：称取8g 硫酸铁铵溶于100mL水中溴甲烷标准溶液：准确称取溴化钠0.1084g，溶于100mL水中。此溶液每毫升相当于1mg溴甲烷。,超临界萃取（SCFE）,模块3-2 熏蒸剂的快速检测,操作步骤样品预处理称取样品100g，置于圆底烧瓶中，接水蒸气蒸馏装置进行水蒸气蒸馏；馏出液用盛装20mL 5%氢氧化

27、钾-乙醇溶液的100mL容量瓶接收，馏出液体积达到90mL时停止蒸馏；加入6mol/L 硝酸5mL使溶液呈酸性，加水至刻度，摇匀。,超临界萃取（SCFE）,模块3-2 熏蒸剂的快速检测,标准曲线制作准确吸取溴甲烷标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，分别移入锥形瓶中，加入5mL 6mol/L 硝酸溶液，再加入水，使总体积达到50mL；分别准确加入0.010mol/L 硝酸银溶液1mL、0.010mol/L硫氰酸铵标准溶液1mL以及硫酸铁铵指示剂2mL，摇匀后通过干滤纸滤入50mL比色管中，备用。,超临界萃取（SCFE）,模块3-2 熏蒸剂的快速检测,测定准确吸取酸性溶液50m

28、L置于锥形瓶中，分别准确加入0.010mol/L 硝酸银溶液1mL和0.010 mol/L硫氰酸铵标准溶液1mL以及硫酸铁铵指示剂2mL，以下操作同标准曲线制作。与标准管比较定量，求出样品中溴甲烷的含量。结果计算X=m*1000/W式中：m为样品管中相当于标准管的溴甲烷量(mg) W为检测时实际样品质量(g),超临界萃取（SCFE）,模块3-2 熏蒸剂的快速检测,注意事项粮食及其制品或一些其他食品原料在贮藏过程中容易生虫或发霉，为了延长其保质期，在一定贮藏条件下，常使用一些熏蒸剂进行熏蒸保藏。通常使用的粮食熏蒸剂有溴甲烷、二硫化碳、环氧乙烷、四氯化碳、氯化苦、氰化物、砷化物和磷化物等。有些熏蒸

29、剂如氯化苦对人体是有害的，二溴乙烷也是一种强致癌剂，这两种以及氰化物、砷化物等在我国已停止使用，但进口粮食及其制品中时有检出，因此需要进行熏蒸剂残留量的测定。由于食品中的环氧乙烷与无机氯化物化合成相应的有害物质-氯乙醇，也需要对-氯乙醇进行测定。,超临界萃取（SCFE）,模块3-2 熏蒸剂的快速检测,微量的混合物采用GC进行分离测定，含量较高时可用常规比色法。目前食品中熏蒸剂残留量的检测还没有一种方便快捷的现场快速检测方法，大多是依据化学反应比色法或者利用气相色谱仪进行分析。目前市场上出现的MB-02 溴甲烷熏蒸气体检测仪则是针对熏蒸气体进行检测。比如在封闭的集装箱外检测溴甲烷的泄漏量；地窖和包装箱的溴甲烷的浓度。灵敏度高，一旦检测到溴甲烷，几秒钟内就会读数，声音报警，携带和存放都很方便。样品须粉碎过200目筛以提高准确度。,超临界萃取（SCFE）,模块3-2 熏蒸剂的快速检测,Thank You!,