细胞工程制药技术ppt课件.ppt

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1、1,第八章 细胞工程制药技术,第一节概述第二节动物细胞工程制药第三节 抗体制药第四节植物细胞工程制药,2,细胞工程的主要内容,动植物组织、细胞培养技术细胞融合（细胞杂交）细胞拆合与核移植细胞器移植染色体工程胚胎工程细胞与基因治疗,3,第一节 概述,细胞工程：指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论和方法，按照需要和设计，在细胞水平上进行操作，重组细胞结构，改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养新物种的生物工程技术。,4,核移植技术,动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移如入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重

2、组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.,5,黑面绵羊去核卵细胞,白面绵羊乳腺细胞核,细胞核移植,重组细胞,早期胚胎,另一头绵羊的子宫,克隆羊多利,1.克隆羊培育过程,1997年多利,6,7,体细胞核移植技术用于治疗人类疾病,8,核移植,核移植：将一个细胞中的核转移到另一去核的细胞中就是核移植，这是一项相当精细的技术。,细胞核移植的三个工作：（a）去掉原有的受精卵细胞核，（b）取得另一个细胞的细胞核，（c）重新植入新的细胞核。,9,细胞器移植,即将细胞器从一个细胞中分离出来移入另一细胞中。,目前已对叶绿体和线粒体进行了移植实验。人们已将叶绿体移入鸡卵中，能成活27天，还有10%

3、的光合能力。,10,染色体片段重组“手术”与分离,是指利用物理技术对基因的载体染色体进行“手术”，使它断裂与片段重组，以至对特定染色体的分离，为生物遗传性状的转移与改造、植物新品种开辟了新途径。 用X射线处理，断裂染色体，将染色体上有用的与无用的部分分开，形成片段，再通过易位、重组与选择，获得具有新染色体片断的重组类型。,11,细胞培养,是把这些细胞从体内取出，然后接种在特制的培养容器中，给予必要的生长条件，使它们在体外继续生长与增殖。 细胞在体外培养成功的关键取决于两个因素：一是营养，包括糖、氨基酸和维生素等。培养不同的细胞需要不同成分的培养基。二是生长环境，如特定的温度、培养液的酸碱度和无

4、菌条件等。,12,组织培养,是将取自动物或植物体的小块组织转移到该组织能在其中继续生存并发挥功能的人工环境中。被培养的组织可为单个细胞、一群细胞或器官的一部分或整个器官。培养中的细胞可以繁殖，可以改变大小、形态和功能，显示特化的活动或与其他细胞相互作用。,13,组织培养首先将外植体分离出来，然后在无菌及适当条件下培养以诱导出愈伤组织，另外在愈伤组织随外植体生长一段时间后还需要进行继代培养，以避免代谢产物积累及水分散失等因素的影响。细胞培养可分为悬浮细胞培养、平板培养、饲养层培养和双层滤纸植板等几类方式。,14,组织培养技术在鉴定感染、酶缺陷、染色体异常，分类脑肿瘤和设计及测验药物和疫苗方面已起

5、了很大作用。将取自孕妇的细胞进行培养，可判定其体内的胎儿是否存在与唐氏综合症有关的染色体缺陷。,15,细胞融合技术,16,细胞融合的发展,细胞融合是60年代发展起来的一门细胞工程技术，它不仅在基础研究中有重要的作用，而且在植物、微生物的改良，基因治疗、疾病诊治等应用领域中展现着美好的前景。通过细胞融合得到淋巴细胞杂交瘤制备单克隆抗体被誉为免疫学上的一次技术性革命。细胞融合已成为细胞工程中的核心技术。,17,细胞融合是指指人为地使两种不同的生物细胞在同一培养器中，用无性的人工方法进行直接接触，产生能同时具有两个亲本细胞有益性状的杂交细胞技术。人工方法使两个不同的细胞融合，发生体细胞杂交，形成新的

6、杂种细胞。故有人称融合细胞为杂种细胞。,18,细胞融合过程可分成两个阶段：异核体阶段(heterokaryon)：异核体是指在融合细胞内含有来自两个亲本的细胞核。异核体中细胞核尚未融合。杂种细胞形成：当异核体同步进入有丝分裂后，核膜崩溃，来自两个细胞核的染色体结合在一起。融合细胞内只含有一个细胞核，是由来自两个亲本细胞的基因组组合在一起所形成的。此时的细胞就称为杂种细胞。,19,发展史,1838年Muller第一个描述了脊椎动物肿瘤细胞融合成多核细胞的现象。 1907年，体外组织培养技术成功之后，人们观察到体外培养的细胞也能融合而形成多核巨细胞。 1958年，日本冈田善雄(Okada)用高浓度

7、的仙台病毒(Sendai Virus)在体外成功地融合了小鼠艾氏腹水癌细胞后，细胞融合技术，得到迅速发展。,20,1960年，法国的Barski等首先发现不同类型的细胞在混合培养过程中自发融合的现象 1966年，Yerganian进一步用仙台病毒获得了能够增殖的杂种细胞。从此，人工诱导细胞融合的方法，即被广泛地用于种内、种间、属间、科间、乃至动、植物之间的杂种细胞的构建，而迅速发展成为一项无论在生物学的基础理论研究，或在工、农、医方面的应用，均具有广阔前景的细胞工程技术 。70年代，童第周在我国率先开展了这方面研究。,21,物理法：电融合,化学法：PEG融合,生物法：,灭活的病毒,仙台病毒,丧

8、失感染性,（不感染细胞）,保留融合活性,（诱导细胞融合）,三、细胞融合的方法,（常用范围浓度10%-60%，分子量 1000-6000）,22,电融合,电融合技术的原理：悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的细胞，在1100MHz和1001000V/cm的交流电场中，会沿电场方向排列成串，此时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲、即可使相邻细胞膜的接触区产生可逆电击穿，从而触发细胞融合。,23,化学融合,化学融合剂：它们主要包括聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、二价阳离子载体等。其中则以PEG的使用最为广泛。PEG 的作用：1、PEG可能使细胞膜（尤其是有丝分裂的骨髓瘤细胞）

9、的脂类分子的物理结构发生重排，容易被PEG作用打开细胞膜，使细胞融合。2、PEG可能会把细胞膜上的蛋白质分子排开，使脂质体扦入与膜结合。3、PEG可能作用于膜磷脂极性基团和细胞膜表面蛋白。使膜磷脂的表面电位下降，同时使膜糖蛋白的排阻体积减少，最终使膜出现缺口，进而融合。,24,病毒融合,最早被采用病毒融合剂有疱疹病毒、天花病毒和副粘液病毒等在内的病毒类融合剂。灭活仙台病毒介导细胞融合过程可以大大提高融合频率。它在病毒类融合剂中最为有效，使用最广。,25,实例,1978年，德国的梅罗帕斯博士向世界宣告，他们已经用细胞融合的方法培育出了薯番茄。所谓薯番茄就是马铃薯和番茄的杂交后代。,26,第二节动

10、物细胞工程制药,一、生产用动物细胞的来源原代细胞：直接来自动物体，如鸡胚细胞。二倍体细胞系：如WI-38，美国从人的正常胚肺中分离的成纤维细胞。可无限传代的转化细胞系：采用病毒如SV40或某些化学试剂如甲基胆蒽处理二倍体细胞；直接从动物的肿瘤组织中分离。如Namalwa, CHO, BHK-21等。经融合和重组的工程细胞系：融合细胞、工程细胞等。许多国家有专门细胞保存机构,27,二、细胞培养,培养条件器材洗清灭菌、水质、酸碱性、渗透压、温度、空气培养基天然培养基：血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水等。合成培养基：BME、MEM、DMEM、HAMF12和RPMI1640等。包含氨基酸、

11、维生素、激素、脂肪酸、无机盐及其它成份培养方法悬浮培养、贴壁培养、悬浮-贴壁培养等,28,细胞培养过程,29,小型细胞培养反应器,30,三、动物细胞药物,细胞因子类药物：一组不同种类的调节糖蛋白。担任细胞间的化学传感器，通过与细胞表面特定受体结合来产生作用，从而触发细胞内信号传导活动。激素类药物：由机体的特殊腺体合成和释放，通过循环系统，作用于靶细胞的微量化学信息分子。酶类药物：来源动物细胞的治疗用酶,31,细胞因子的主要类型,32,细胞因子产生途径,33,干扰素,34,兽用与医用性腺激素,35,胰岛素,36,第三节 抗体制药,37,一、单克隆抗体,免疫,特异性免疫:细胞免疫和体液免疫,非特异

12、性免疫:宿主的屏障、吞噬细胞、 抗菌物质、炎症反应,38,抗体,抗体是能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。它是机体免疫系统受到抗原物质刺激后，B 淋巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。,39,抗体分子的结构是由二硫键连接起来的约 4 条多肽链。长的一对称为重链，短的一对称为轻链。氨基端轻链的一半与重链的四分之一的氨基酸组成及排列顺序多变，称为可变区，羧基端轻链的一半和重链的四分之三氨基酸的组成和排列顺序比较恒定，称为恒定区。可变区中，某些特定位置的氨基酸残基显示更大的变异性，是

13、抗体分子和抗原分子发生特异性结合的关键部位，称为互补决定区，决定了免疫球蛋白分子的异种抗原性。,40,抗体种类：第一代抗体 多克隆抗体（polyclonal antibody)第二代抗体 单克隆抗体（monoclonal antibody)第三代抗体 基因工程抗体（genetic engineering antibody),41,多克隆抗体,由于病原微生物是具有多种抗原决定簇的抗原物质，产生的抗体是多种抗体的混合物，称为多克隆抗体，即针对多种抗原决定簇的抗体。它们在应用过程中经常会出现非特异性交叉反应。,42,单克隆抗体,是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克

14、隆化使杂交瘤细胞成为纯的单克隆细胞系而产生的。由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。,43,全世界研制成的对病毒、细菌、寄生虫、肿瘤细胞及各种组织细胞、蛋白质、核酸的单克隆抗体有上万种，在医学、生命科学及医药工业的许多领域得到了广泛应用。单抗制品的销售量也不断增加，成为生物制品的主要来源之一。,单克隆抗体的应用,44,1、用于临床诊断 单克隆抗体检测法，具有特异性高、快速、简便、灵敏等多种优点，因此首先被用来作临床诊断试剂。在体外测定病人血、尿或分泌物中各种特殊蛋白质的含量，以判断机体是否有病、检测治疗效果等

15、。最早用于商品的单抗是妊娠诊断试剂。检测一些受细菌感染血清的诊断试剂、性病以及肿瘤表面抗原一些受细菌感染血清的诊断试剂、性病以及肿瘤表面抗原的诊断试剂，我国已研制出包括乙肝表面抗原、流行性出血热等在内的几十种单抗诊断试剂。,45,2、治疗试剂 1983年，美国首次报导一例化疗和放疗均证明无效的淋巴瘤患者在使用单抗治疗后得到痊愈，使单抗作为治疗试剂受到了瞩目的重视。所谓的“生物导弹”：以抗体或抗体分子中的抗原结合部分为载体，将毒素偶联在这种“载体”上，这种分子只与发生癌变的组织或细胞结合，因而它所携带的毒素集中在癌变组织，从而达到特异性杀伤肿瘤的作用。,46,鼠源性单克隆抗体的改造,目前制备的单

16、克隆抗体都是鼠源性的，大量应用与人体时可产生人抗鼠抗体，使其作用和效果都受到严重影响，甚至有毒副作用。 改造鼠源性单克隆抗体的目的有两个：一是降低免疫原性，二是降低相对分子量，增加组织穿透能力。人-鼠嵌合抗体、改形抗体、小分子抗体。,47,人-鼠嵌合抗体,抗体同抗原结合的功能取决于抗体分子的可变区，同种性免疫原性则决定于抗体分子的稳定区。人-鼠嵌合抗体：鼠源性单克隆抗体的可变区基因和人免疫球蛋白的稳定区基因连接起来，在共转染骨髓瘤细胞，就可表达出完整的人-鼠嵌合抗体。,48,嵌合抗体,49,改形抗体,用鼠源性单克隆抗体的互补决定区序列替换人免疫球蛋白分子中的互补决定区序列，可使人的免疫球蛋白分

17、子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。由于抗体分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。最大问题是抗体的亲和力下降，甚至丧失活性。,50,小分子抗体,基因工程的小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的可变区，其相对分子量仅为原抗体的八十分之一到三分之一。正在研制： 1、Fab片段抗体，由完整的轻链和重链的可变区加部分恒定区； 2、FV抗体，有重链和轻链的可变区组成； 3、单链抗体，由重链和轻链的可变区通过一段连接肽连接而成的重组蛋白； 4、单域抗体，由重链的或轻链的单个可变区组成；5、最小识别单位，由互补决定区构成。,51,二、杂交瘤技术,B淋巴细胞:分泌特异系性抗体，无法在体外进行繁殖和传

18、代骨髓瘤细胞：体外具有很强的繁殖能力杂交瘤细胞：寿命长，单克隆抗体,聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合HAT培养基的选择培养：免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤细胞系单克隆抗体生成：接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体,52,（一）杂交瘤技术的基本原理,1. B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性：B淋巴细胞(B lymphocytes)接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡短命细胞,53,骨髓瘤细胞 (myeloma cells):恶性

19、增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活长命细胞。经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株没有抗体分泌物。,54,长命不分泌抗体,分泌抗体短命,分泌抗体长命,Khler和Milstein, 1975,1984年Nobel医学奖,细胞融合,55,杂交瘤细胞的筛选,56,HAT培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA,57,H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶,A,(Hypoxanthine guznine ph

20、osphoribosyl transferase) 次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT ),胸腺嘧啶激酶 ( TK )(Thymidine kinase),外源性途径(旁路途径),HAT培养基筛选,58,HAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，57天死亡；骨髓瘤细胞：DNA合成的主要途径被A阻断，HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻。不能生长，57天死亡；,杂交瘤细胞：长期生长繁殖，利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力,59,筛选,（二）杂交瘤的制备,60,1.免疫动物免疫动物品系和骨髓瘤细

21、胞在种系发生上距离越远，产生的杂交瘤越不稳定，所以一般采用与骨髓瘤供体同一品系的动物进行免疫。常用的骨髓瘤品系来自 BALB/c小鼠和Lou大鼠。 免疫方法有体内和体外免疫法。,动 物：BALB/c小鼠712周龄20g25g体重,61,细胞性抗原：（12）107/只，不加佐剂，23周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，36周100200微克抗原，融合前3天，加强免疫,免疫方法,62,第1次免疫：抗原+福氏完全佐剂,(皮下注射或静脉注射),(皮下注射),(皮下注射),(静脉注射),常规免疫,63,体内免疫,体内免疫法适用于免疫原性强、抗原量较多的情况下，由静脉直接注入抗原，在

22、B淋巴细胞受到可靠的最大限度的刺激后，迅速增殖、分裂，当增殖率最高时收集B淋巴细胞。,64,体外免疫,体外免疫法适用与抗原的免疫原性弱、能引起免疫抑制时采用。优点。所需抗原少、免疫期短，干扰因素少，但融合后产生的杂交瘤不够稳定。方法用 4-8 周龄的 BALB/c小鼠脾脏制成单细胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达到0.5-5 微克每毫升，在 5%二氧化碳下，37培养4-5 天，再分离脾细胞进行细胞融合。,65,2.骨髓瘤细胞系,不产生Ig的重链和轻链；HGPRT-或TK-；与提供淋巴细胞的动物品系相同选择对数生长期的细胞进行传代培养细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：定期用8-AG

23、处理细胞注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80或液氮及干冰中融合前两周，要对骨髓瘤细胞进行HAT培养基的敏感性筛选。,66,病毒介导的细胞融合PEG介导细胞融合电融合,动物细胞融合方法,67,用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程,灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面（诱导）,细胞膜被病毒颗粒穿通,细胞膜连接,细胞融合，形成杂种细胞（细胞膜具有一定的流动性）,68,3.融合,用于细胞融合的骨髓瘤细胞应具备：融合率高、自身不分泌抗体、所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定。 融合方法：最佳范围浓度40%-50%，分子量 4000。为提高融合率可加入二甲基亚砜，以提高细胞接触的紧密性。但由于

24、二者都对细胞有毒性，要严格控制作用时间和用量。,SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：251ml 50%的PEG（无菌，预温37）在1分钟内滴完,静置90秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入（2min）,停止PEG作用根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔细胞数为（0.51.5）105个。融合后7天，换用HT培养液,69,融合结果,产生了脾-脾、瘤-瘤、脾-瘤融合细胞。为获得目的细胞将融合后的细胞立即转入选择性培养基中，常用HAT 培养基。氨基喋呤能阻断 DNA合成的主要途径，瘤-瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成 DNA 而死亡。脾-脾融合细胞在培养几天后也会死亡，而杂交瘤细

25、胞则可以存活。,70,培养方法,将融合的细胞悬浮于 HAT 培养基中，加入到 96 孔板内，根据情况 2-3 天换液一次，每次吸去二分之一到三分之二培养液，再加入等量新鲜培养液。7-14天改用HT 培养液，14天以后用普通的RPMI1640完全培养液。因为杂交瘤数量很少，多半不易存活，所以通常要加入饲养细胞才能使其繁殖,71,饲养细胞：细胞密度过低不利于细胞生长繁殖常用腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞作饲养细胞其中MQ还有清除死亡细胞的作用饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞的纯化,72,要求： 简便、快速、敏感; 在短时间内能检测大量样品,常用方法,酶联免疫吸附法(enzyme-linke

26、d immunosorbent assay, ELISA)间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence, IFA)放射免疫法(radioimmunoassay, RIA),4.杂交瘤培养物的鉴定,73,筛选出来的阳性克隆可能含有不分泌抗体的细胞或有多株分泌抗体的细胞，刚融合的细胞不稳定，因此应尽早进行克隆化。克隆后的细胞群生物学特性完全相同。融合后的杂交瘤细胞要经过三次克隆化才能达到 100%的阳性克隆常用方法：有限稀释法和软琼脂法。,74,5.单克隆抗体的纯化,先明确单克隆抗体的免疫球蛋白的类和亚类，并根据用途综合选定纯化方法。用于体外诊断试剂，IgG采用沉淀处理结

27、合亲和层析。体内诊断试剂或治疗用药，应去除内毒素、核酸、病毒等微量的污染，必须经亲和层析和阴离子交换层析。,75,体内诱生的单克隆抗体的纯化,1、澄清和沉淀处理：先低速离心5min，去除沉淀；再高速离心 30min，去除残留的小颗粒物质；再用0.2 微米的微孔滤膜过滤，除去污染的细菌、支原体和脂质，用饱和硫酸铵沉淀抗体。 2、分离：凝胶过滤、阴离子交换层析、亲和层析。,76,6.出现的问题,1）.细菌污染常见的污染细菌有大肠杆菌、假单孢菌、葡萄球菌等。细菌污染大多数可以改变培养液 pH， 使培养液变浑浊、变色。用青霉素、链霉素可以预防细菌污染有效,77,2）真菌污染真菌生长迅速，能在短时间内抑

28、制细胞生长、产生有毒物质杀死细胞，但是污染后易于发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，抗真菌制剂对预防和排除真菌污染有效。,78,3）支原体污染：培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞受到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响DNA合成，抑制细胞生长。 支原体是细胞培养中最常见的、干扰试验结果的一种污染。 用卡那霉素预防支原体污染有效。4）杂交细胞停止分泌抗体5）克隆化困难,79,三、杂交瘤细胞培养及单克隆抗体的生产,常用的大规模培养方法： 1.体外培养法：悬浮培养、包埋培养、滚瓶培养和微囊化培养。 单抗含量不高。 2.体内培养法： 采用BALB/c小鼠，在

29、接种前 1-2周，先给小鼠腹腔注射 0.5毫升的降植烷（或液体石蜡），然后接种1*106 杂交瘤细胞，待生成腹水后再抽取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。每毫升腹水单抗含量有1-25mg,80,第四节植物细胞工程制药,植物细胞的全能性：发育全能性、物质代谢全能性细胞与组织及其培养固体培养、液体培养利用组织培养技术快速繁殖药用植物试管苗利用离体细胞大量生产次生代谢物质反应器发酵技术,一、植物组织培养二、植物体细胞杂交（植物体细胞融合）,81,定义：在无菌条件下，利用人工培养基对植物组织、细胞所进行的培养，包括原生质体、悬浮细胞和植物器官等的培养。,一、植物组织培养,82,组织培养流程,组培设施的准

30、备,培养基的选择及配置,灭 菌,接种及培养,试管苗驯化移栽,组培设备,84,培养基,无机营养成分 就是人们平常所说的矿物质、无机盐或无机元素。它包括大量元素（N、P、K、Mg、S、Ca）及微量元素（Fe、Mn、Cu、Zn、Cl、B、Mo等。有机营养成分 它包括维生素、氨基酸、碳水化合物通常为蔗糖或葡萄糖。植物生长调节剂 生长素、细胞分裂素、赤霉素和乙烯等。琼脂或其他支持物 除液体悬浮培养外，所有的培养物都应生长在固定或半固定的培养基上以防止培养物沉入液体培养基，因缺氧而死亡。就目前情况而言，琼脂是一种极为理想的支持物。 其它添加剂 包括一些天然提取物、活性炭、抗生素等。,85,87,接种,接种

31、,切取,88,愈伤组织：在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞（细胞排列疏松、无规则）。,愈伤组织的形成,89,离体的植物器官、组织或细胞（外植体）,愈伤组织,根、芽,植物体,脱分化,再分化,90,植物组织培养和动物细胞培养的比较,91,植物组织培养的应用1, 植物的快速繁殖： 园艺、花卉植物的大规模快速繁殖；抢救濒危珍稀植物；进行某些植物的种质资源保存,植物组织培养技术的应用,92,植物组织培养的应用2, 培育无病毒的植物，如脱病毒草莓等； 用植物组织培养技术，诱导离体组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，称体细胞胚，再包裹上人造种皮制成人工种子以解决某些作用品种繁殖力弱、结子困

32、难或发芽率低等问题,93,二、植物体细胞杂交,是指两个来自于不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，并且把杂种细胞培育成新的植物体的方法。,概念：,过程（无菌条件下）：,94,操作过程,95,植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较,96,应用前景价值,克服了（两种不同物种的）植物远缘杂交不亲和性的障碍，对于培育植物新品种有重要意义。,白菜甘蓝图番茄马铃薯（薯茄，地上结番茄，地下结马铃薯）牛柿？,97,三、植物离体细胞培养,细胞系，外植体：生产用细胞培养基：碳源、氮源、维生素等培养器：反应器、三角瓶培养方式：固体培养、液体培养培养程序：二步法（生长、生产）产物分离,98,植物细胞培养器,99,Thank you,