第十二章实验动物胚胎工程技术ppt课件.ppt
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1、第十二章 实验动物胚胎工程技术,第一节 概 述,胚胎工程又称胚胎技术,是指利用生物工程学的原理对动物的胚胎进行某种技术操作或改造,使之获得人们所需要动物的一系列生物技术的总称。胚胎工程主要分为四大体系:第一类:胚胎操作基本技术,包括超数排卵、精子和卵母细胞的采集、体外受精、胚胎培养、胚胎的冷冻保存、胚胎性别鉴定和胚胎移植技术;第二类:动物克隆技术,包括胚胎分割、细胞核移植技术; 第三类:胚胎干细胞技术;第四类:转基因技术。,胚胎工程是生物工程的一个分支,是动物细胞工程的拓展与延伸,胚胎工程技术除了作为研究胚胎的分化和发育的方法和手段外,当前更多地作为一种先进技术应用于以下几个方面:1.在畜牧业
2、方面 通过建立超数排卵、受精卵/卵母细胞的采集、体外受精、胚胎切割、胚胎性别控制、体细胞克隆以及胚胎移植技术,加快良种家畜的繁殖和家畜品种的改良。2.在医学方面 通过建立卵母细胞的采集、体外受精、显微受精以及胚胎移植技术,用于不孕症的治疗;通过对胚胎培养和检测,剔除具有遗传性疾病的胚胎,达到优生优育目的。,3.在生命科学研究方面 阐明哺乳动物早期胚胎发生及其发育机制等基础理论。4.在生物制药方面 通过转基因技术将具有药用价值的生物活性蛋白的基因整合到宿主的染色体上,使其在乳汁、血液、尿液等体液中表达。通过收集、纯化这些体液中的生物活性蛋白,用于预防和治疗某些人类的疾病。5.在拯救濒危野生动物方
3、面 通过野生动物生殖细胞和组织的冷冻保存、体细胞克隆和胚胎移植技术,扩大野生动物的种群。,6,第二节 胚胎操作基本技术,胚胎操作基本技术:一、精子、卵母细胞、早期胚胎的采集和超数排卵二、体外受精三、胚胎性别控制四、胚胎培养五、胚胎移植 六、胚胎冷冻保存,一、精子、卵母细胞、早期胚胎的采集和超数排卵 是胚胎工程最基本的技术。胚胎工程的其他技术均需从卵母细胞和受精卵的采集技术开始。1.精子的采集 啮齿类小动物,如大、小鼠,可将动物处死后,分离附睾尾部,用眼科剪子在顶端剪一小口,用手指轻柔挤出浓稠的液滴,置培养液中培养。 大动物,如犬的精液采集可采用生物电刺激方法促进雄性射精,收集精液。,解剖取附睾
4、尾部,精子的获取和培养,10,2.卵母细胞的采集 从哺乳动物获得成熟的卵母细胞,主要途径有两条:获取体内成熟并排到输卵管中的卵母细胞,需处死动物或通过外科手术;如果已交配,获取的是受精卵或早期胚胎。从刚死亡的雌性动物卵巢中分离卵母细胞,体外培养。,小鼠解剖取输卵管,从输卵管壶腹部取卵母细胞/受精卵的方法,11,3.超数排卵: 在正常情况下,哺乳动物一次排卵数极其有限,单胎动物一次排卵一枚,多胎动物如小鼠一次平均排卵810枚,家兔一次平均排卵9枚。为了获得大量的胚胎,可通过注射激素刺激卵巢大量排卵,常用激素有促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和孕马血清促性腺激素(PMSG)、孕酮
5、和前列腺素(PG)等,最常用的是前三种。 经超数排卵处理,动物卵巢大量的卵泡同时成熟并排出,排卵数可增加几倍至十几倍,一次可获得大量的卵细胞、受精卵或早期胚胎。,以小鼠的超数排卵为例,成熟雌性小鼠,中午1213时用孕马妊娠血清(PMSG)腹腔注射5单位/只。48小时后用人绒毛膜促性腺激素(hCG)腹腔注射5单位/只,进行超数排卵。,二、体外受精 体外受精是指成熟的精子与卵母细胞在体外环境下完成受精的过程。以小鼠为例:1)进行超数排卵:PMSG和hCG注射 2)处死,取出输卵管壶腹部采集卵母细胞。将新鲜采集的精子在培养液中培养1小时后,以适当的浓度移入有卵母细胞的培养液滴中。如受精,45小时后受
6、精卵中可见明显的雄性原核,第二天受精卵发育成二细胞胚胎。,体外受精不仅是研究受精及早期胚胎发生的重要手段,而且广泛应用于人类生殖障碍、家畜品种改良等方面。试管婴儿:若夫妇两人,生殖细胞能正常产生,但就是生不出孩子怎么办? 把卵子和精子都拿到体外来,让它们在体外人工控制的环境中完成受精过程,然后把受精卵移植到女性的子宫中,在子宫中孕育成为胚胎。,世界上第一个试管婴儿路易斯-布朗,1992年我国首例三胞胎试管婴儿,广州8胞胎-试管婴儿 连中八元,三、胚胎性别控制 是畜牧业生物技术中一项重要的高新技术。这项技术的应用可以使畜牧上大动物的繁殖按照人们的意愿只生产同一性别动物,例如奶牛、奶羊等的生产按照
7、人们的意愿只生产母畜,可以显著提高奶牛的繁殖效率,获得可观的经济效益。,在医学上对人类性别控制的研究也具有积极的意义。有的遗传性疾病属于性连锁遗传,例如进行性肌营养不良,为X连锁隐性遗传,男性发病,女性携带异常基因但不发病。携带此致病基因的女性怀孕后如做胚胎性别鉴定,可避免男性患儿出生。 正常情况下,法律禁止对胎儿性别进行控制!,性别控制技术主要有3种不同的途径:1.分离X精子与Y精子:流式细胞光度法2.对胚胎进行鉴定以控制性别:在胚胎移植前对胚胎的部分组织用染色体检查、间接免疫荧光法和PCR法进行性别鉴定。其中PCR法具有高效、快速的特点。3. 改变酸碱度: 酸性环境下X型精子活力强,碱性环
8、境下Y型精子活力强,如雌性动物喂食酸性饲料,子代雌性动物可能性大,喂食偏碱性饲料,子代雄性动物可能性大。同样原理,交配前用酸性溶液冲洗阴道,子代雌性动物机会多;用碱性溶液冲洗阴道,子代雄性动物机会多。,四、胚胎培养: 胚胎培养是指将获得的未成熟的卵母细胞、受精卵、冷冻保存胚胎在体外人工创造的环境中培养成熟,并通过体外受精发育成各阶段的早期胚胎。 研究胚胎发育的环境和条件,揭示胚胎细胞的生长发育和分化的奥秘。 但体外胚胎培养只能发育到受精卵的囊胚期,然后必须移植到动物的子宫内。,五、胚胎移植 胚胎移植技术是胚胎工程技术的最后一步,体外受精、胚胎分割、转基因动物、克隆动物等任何一项生物技术所生产的
9、胚胎,最终都必须移植到受体动物的生殖管道一定部位,继续生长、发育、分娩出生仔代动物。 显然,在同一物种动物之间进行胚胎移植更易于成功。,在畜牧业方面: 牛奶营养丰富,但普通奶牛的产奶量低。现在如果从国外购进几头高产的荷斯坦奶牛,有什么技术可以让这些高产的奶牛短时间内快速繁殖成一个群体呢?胚胎移植技术(借腹怀胎)。,胚胎移植技术的应用,供体:只产生具有优良遗传特性的胚胎,受体:担任漫长繁重的妊娠和育仔任务,23,问题1: 将准备移植的荷斯坦奶牛胚胎,移植到另外一头普通母牛的子宫内,一定能发育吗? 供体母牛和受体母牛必须具备相同或相似的子宫内生理环境,供体的胚胎移入受体子宫后,才能存活和发育,这是
10、胚胎移植成功的生理学基础。因此,胚胎移植也可以看成是早期胚胎在相同子宫内环境条件下空间位置的转移。,问题2: 怎样才能使供体母牛和受体母牛具备相同或相似的子宫内生理环境? 同期发情处理,使胚胎移植中的供体和受体几乎同步性的出现卵泡期、排卵期和黄体生成期,这样才能使两者体内的子宫内膜的状态、各种激素水平都具有一致性,保证移植后的胚胎具有最合适的发育环境,是胚胎移植成功的基本条件。 注射孕激素等,延长黄体期,抑制卵泡发育; 前列腺素,溶解黄体,促使卵巢进入卵泡期。,供体母牛,超数排卵,配种,收集受精卵,受体母牛,质量检查、培养,同期发情处理,发情,胚胎移植,妊娠,有价值的后裔,受体公牛,奶牛胚胎移
11、植技术路线示意图,26,同一种属内的不同品种品系可互相进行胚胎移植。如近交系C57BL/6J小鼠的胚胎可移植到雌性封闭群ICR的生殖管道内;日本大耳白兔的胚胎可移植到雌性新西兰兔的生殖管道内。这一特点在畜牧业很有价值,如为了加快良种奶牛的繁殖,可将良种奶牛的胚胎移植到普通黄牛的生殖管道内,借腹怀胎。,胚胎移植技术的新进展:,六、胚胎冷冻保存 指在低温(-196)条件下利用低温保护剂保存生殖细胞及胚胎的一门技术。目前应用的低温保护剂有二甲基亚砜(DMSO)、聚乙烯砒咯烷酮(PVP)、甲醇、乙二醇、羟甲基淀粉(HES)等。 可以避免或减少结冰的程度与速度,降低细胞周围未冻结溶液中的电解质浓度,从而
12、避免或减少胚胎冷冻过程中所发生的物理和化学损伤。 自1972年以来,世界各地已有小鼠、大鼠、田鼠、兔、山羊、绵羊、牛、马、狒狒等20多种动物的胚胎被成功地冷冻保存。,28,液氮罐,胚胎冷冻保存技术的应用 (1)应用于实验动物的保种和珍稀或濒危动物种质保存。(2)应用于实验动物的长途运输。(3)应用于实验动物的生物净化。 被病原体感染的实验动物的生物净化,一般采用子宫切开术,取出胎仔由无菌动物或SPF动物代乳。但是这种方法成功率并不高,而且较为麻烦。通过胚胎冷冻、胚胎移植等技术,可以使生物净化变得更简便和安全。,(4)应用于实验动物育种和野生动物实验动物化。 胚胎克隆技术、体细胞克隆技术结合胚胎
13、冷冻技术,已经应用于实验动物和其他动物的育种,可以缩短育种时间,可以克服野生动物进入实验室后因环境改变而交配困难,可以利用极少量的原种繁殖出大量的后代,可以克服杂交障碍而实现基因的种间转移(如转基因动物等)。,胚胎移植实现了优良性状个体的繁育,如果我们能确定某个胚胎将发育为非常理想的个体,那么有没有办法让这样的一个胚胎一次性地繁育更多的个体?,思考,第三节 动物体细胞克隆技术,一、克隆的定义,克隆(Clone)是指一个细胞或个体通过无性繁殖(不经过两性生殖细胞的结合)方式产生遗传物质完全相同的一群细胞或一群个体。 无性繁殖在植物中很常见,如孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖;植物的根、茎、叶等经过压
14、条、扦插或嫁接等方式产生新个体。,关于动物无性繁殖的设想,吴承恩在西游记中已有精彩的描述孙悟空经常在紧要关头拔一把猴毛变出一大群猴子,用今天的科学名词来说就是孙悟空能迅速将自己身体的一部分克隆成自己,用现在的理论来解释,就是通过对猴毛中含有的蛋白质基因逆转录来进行克隆。 动物的克隆技术,经历了由胚胎细胞克隆动物到由体细胞克隆动物的发展过程。,二、动物克隆技术:1.胚胎分割2.细胞核移植 2.1 胚胎细胞核移植 2.2 胚胎干细胞核移植 2.3 胎儿成纤维细胞核移植 2.4 体细胞核移植,胚胎分割: 受精卵在发育为胚胎的过程中,早期未分化的胚胎细胞具有全能性,能够分化成发育所需的所有细胞,如果对
15、其加以分割,再将分割的胚胎细胞分别加以培养,就能够发育出完整的新一代,由于这些后代来自同一胚胎,具有相同的遗传物质,因此胚胎分割可看成动物无性繁殖或克隆的方法之一。,胚胎分割的最佳时期是受精卵发育到囊胚期,用分割针将胚胎切开,吸出其中的半个胚胎,直接移植给受体。,对囊胚期的胚胎进行分割时,为什么要均等分割?,囊胚期的内细胞团将来要发育成胎儿的各种组织,是胚胎本身的基础细胞。如果分割时不能将内细胞团均等分割,会出现含内细胞团多的部分正常发育的能力强,少的部分发育受阻或发育不良,甚至不能发育等问题。所以要将内细胞团均等分割。,问题,分割的份数越多,操作的难度会越大,移植的成功率也越低。目前多采用2
16、分割与4分割技术。,胚胎移植胚胎分割?,思考,(后代少),(后代多,但不能无限分割),(更多),动物体细胞的形成不会像胚胎细胞那样受到时间和数量的限制;而且同一个个体所有体细胞都具有同样的遗传信息,因此,利用动物体细胞进行克隆,可以复制出比胚胎分割数量更多的优良个体。1.畜牧业育种;2.克隆能够生产特殊医药蛋白的转基因动物。3.利用个体克隆技术可以研究细胞发育过程中不同基因的表达规律和调节控制机理, 4.利用动物克隆技术可以获得足够量的动物器官,用于人类器官移植。5.延缓珍稀野生濒危动物的灭绝。,相对于通过胚胎分割克隆动物,通过细胞核移植来克隆动物,意义更大,因为生物的遗传信息DNA,主要存在
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