细胞培养基本方法：从体内到体外ppt课件.ppt

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1、体外培养（in vitro culture）的概念,将活体结构成分取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。,细胞培养（cell culture） 组织培养（tissue culture）器官培养（organ culture）,体外培养技术的应用,在组织学与胚胎学领域的应用 在细胞生物学领域的应用 在肿瘤学方面的应用 在微生物学领域的应用 在免疫学方面的应用 在药理学领域的应用,体外培养的优点,简化细胞的生长环境 方便施加实验因素 容易观测实验结果 便于获得均一细胞群 能够进行大规模生物制品的生产,体外培养的基本原理与技术,一、从体内生存环境到体外生长条件,二、体外培养的

2、基本方法和过程,三、体外培养物的生长生物学,四、细胞分离与纯化,五、细胞系（株）、细胞克隆,六、培养物的观察检测方法,一、从体内生存环境到体外生长条件,体外（in vitro）培养技术就其实质而言，就是模拟体内（in vivo）的生理环境，在无菌、适当的温度、湿度和一定营养条件下，使活体的结构成分在体外环境中生存和生长，并维持其结构和功能。,一、从体内生存环境到体外生长条件,（一）体内细胞生存的营养条件,（二）体内细胞生存的其它条件,（三）体外生长大环境,（四）培养用液,（五）细胞在体外生长的其它条件,（六）清洗和消毒,、水（water）、无机盐（inorganic salt）、葡萄糖（glu

3、cose）、维生素（vitamin）、氨基酸（amino acid）,（一）体内细胞生存的营养条件,、温度（temperature）、氧和酸碱度 （oxygen and power of hydrogen）、体液渗透压 （osmotic pressure of humor）、细胞之间的相互联系,（二）体内细胞生存的其它条件,温度对细胞生存的影响,高热(hyperthermy)对细胞生存的影响：,高热,导致酶的变性而失活破坏细胞膜的类脂质细胞核分裂异常破坏纺锤体细胞浆外层的钙释放,代谢停止细胞膜渗透性变化多极分裂出现停止在中期凝固酶使细胞凝固,低温(hypothermy),大多数细胞在接近冰点的

4、温度下仍能存活，当温度达到冰点时细胞活动就要相对停止。,温度下降到冰点以下时，细胞外的水要发生结冰，因而使细胞周围的溶液浓缩。结果，水分从细胞扩散到周围的溶液中，使细胞中的溶质浓度升高。细胞中的溶质浓度升高对细胞是有害的。,慢速冷冻：当细胞慢慢冷冻至-40时，细胞外 的冰晶会通过细胞的孔隙进入细胞内 引起冰晶。,快速冷冻：使细胞内外都形成小的冰晶，不仅使细胞内的溶质浓度增高到有害的程度，而且细胞器也会遭到细胞内冰晶的破坏。,所以：在冷冻状态下，要减少细胞的损伤，应逐渐降温，而不宜迅速降温。,低温(hypothermy),、温度（temperature）、氧和酸碱度 （oxygen and po

5、wer of hydrogen）、体液渗透压 （osmotic pressure of humor）、细胞之间的相互联系,（二）体内细胞生存的其它条件,、氧和酸碱度（oxygen and power of hydrogen）,氧,酸碱度,酸度和碱度的度量采用pH表示， pH即氢离子浓度的负对数值。各种组织细胞的正常功能及一切生物化学反应，都是在适当的和稳定的氢离子浓度下进行的。大多数有机体的细胞所耐受的pH范围为6.08.0。人类血液的pH值一般维持在7.367.44。,是细胞生存必不可少的条件之一。尽管一些细胞如骨骼肌细胞、红细胞可通过糖酵解而获得能量，但大多数细胞缺氧不能生存。,、温度（t

6、emperature）、氧和酸碱度 （oxygen and power of hydrogen）、体液渗透压 （osmotic pressure of humor）、细胞之间的相互联系,（二）体内细胞生存的其它条件,、体液渗透压（osmotic pressure of humor）,体液渗透压主要来自体液中不能自由透过细胞膜的颗粒。,血浆晶体渗透压： 由Na+、K+、 Cl、 HCO 3 等构成；,血浆胶体渗透压：由血浆蛋白质等构成；,正常血浆渗透压范围为：280310 mOsm/kg 主要由晶体渗透压组成。,等渗溶液(isosmotic solution)：在正常血浆渗透压范围内的溶液；高渗

7、溶液(hyperosmotic solution)：高于310 mOsm/kg的溶液；低渗溶液(hyposmotic solution;)：低于280 mOsm/kg的溶液。,、温度（temperature）、氧和酸碱度 （oxygen and power of hydrogen）、体液渗透压 （osmotic pressure of humor）、细胞之间的相互联系,（二）体内细胞生存的其它条件,、细胞之间的相互联系,细胞间相互联系的基础是胞间通讯。胞间通讯有三种类型：直接接触型：特点是通过胞膜表面分子的结合直接联系；直接联系型：通过相邻的缝隙连接，直接完成信息传递；间接联系型：是细胞间通讯

8、的最主要的途径。通过激素、 神经递质、局部化学介导因子等化学信号 的传播。,细胞增生的接触性抑制,细胞增生接触性抑制是指当细胞数量增多时，细胞相互接触而导致细胞运动停止。或者细胞增殖到一定密度后，细胞增殖停止。这些现象就是细胞之间相互沟通信息的表现。,、体外培养实验室、体外培养实验室的设备和器具,（三）体外生长大环境,、体外培养实验室,由于组织培养是无菌操作，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其他有害因素的影响。组织培养室的设计原则是防止微生物的污染和有害因素的影响，要求工作环境清洁、空气清新，位置远离产生发生烟尘、污物的工厂区；环境应是较干燥、无烟尘和空气清新区。实验室设计应根据研

9、究任务、目的和规模（小组、研究室或更大），以及经费等条件而定。可有两种考虑，从空间要求，最小不应小于50m2。如接近50m2上下，以一大一小为好。,、体外培养实验室,准备室 培养室 缓冲室 其它实验室,实验台,实验仪器台,水池,冰箱,衣柜,载物台,离心机,橱柜 载物台,显微镜,净化台,培养箱,冰箱,递物小窗,试剂柜,准备室,培养室,缓冲室,专用培养实验室布局示意图,、体外培养实验室、体外培养实验室的设备和器具,（三）体外生长大环境,、体外培养实验室的设备和器具,（）大型设备 和仪器,（）培养器具,超净工作台(superclean bench)培养箱(incubator)倒置显微镜(invert

10、ed microscope)冰箱(refrigerator)冷冻保存(cryopreservation)装置细胞计数板和电子细胞计数仪离心机(centrifugal machine)PH计天平(equi-arm balance)水纯化(water purification)装置高压蒸汽消毒(vapor sterilization)装置电热干燥箱(drying oven),美国SHELLAB CO2培养箱,（）大型设备和仪器,（）培养器具,过滤除菌(filtration sterilization)装置手术器械(surgical instruments)培养器皿(ware for culture

11、)移液器(transferpettor)特殊用具杂用品,、体外培养实验室的设备和器具,真空式过滤器,正压式不锈钢滤器,抽滤式玻璃简易型滤器,针头式滤器,（）大型设备和仪器,（）培养器具,过滤除菌装置手术器械培养器皿移液器特殊用具杂用品,、体外培养实验室的设备和器具,细胞过滤器,细胞冻存管,微量移液枪吸头,、水与平衡盐溶液(balanced salt solution，BSS)、培养液(culture solution)、其它常用液,进行体外培养离不开适应细胞在体外生存和生长的各种溶液，此即培养用液。培养用液主要包括培养液、缓冲液、平衡盐溶液、血清以及消化液、pH调整液和抗生素液等其它常用液。,

12、（四）培养用液,、水与平衡盐溶液,水与缓冲液,生理盐水与平衡盐溶液,培养用水缓冲溶液,生理盐水平衡盐溶液,、培养液,、其它常用液,（四）培养用液,、水与平衡盐溶液,水是培养用液最主要的溶剂。培养用液中的其它成分只有溶解于水中才有利于细胞吸收摄取。用金属蒸馏器制备的蒸馏水（distilled water，DW），可能会含有某些金属离子，一般不作为培养用水。配制培养用液应用经石英玻璃蒸馏器三次蒸馏的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水。二次蒸馏水或外购的纯水只能用于清洗。,（）水与缓冲液（buffer solution）培养用水：,（四）培养用液,蒸馏水的贮存也很重要，蒸馏水应贮存于密封的清洗干净的

13、玻璃瓶内，最好用龙头瓶贮存，用时由瓶下端的玻璃龙头放水。尽量少开启瓶口或从瓶口倒水，以防周围不洁的环境和空气污染水。制备的水存放时间不宜太长，一般不超过2周，最好现制现用。若将所制备的蒸馏水经高压蒸汽消毒，可密封存放较长时间。,（四）培养用液,、水与平衡盐溶液,（）水与缓冲液（buffer solution）培养用水：,由缓冲剂配制成的溶液，在加入一定量的酸或碱时其氢离子浓度改变甚微或几乎不变，此种溶液称为缓冲（溶）液(buffer solution)。,缓冲剂的组成，多为弱酸及这种弱酸与强碱所组成的盐，或弱碱及这种弱碱与强酸所组成的盐。如碳酸氢钠碳酸（NaHCO3H2CO3 ）、磷酸二氢钠磷

14、酸氢二钠（NaH2P04Na2HP04），调节二者的比例便可以配成各种缓冲液。,（四）培养用液,、水与平衡盐溶液,（）水与缓冲液（buffer solution）培养用水：,、水与平衡盐溶液,（）生理盐水与平衡盐溶液 （normal sodium，NS and balanced salt solution;BSS）,生理盐水:,生理盐水是培养用液中的一种重要类型和培养基的主要成分，在体外培养中应用非常广泛。它可以供给细胞水分和各种离子，维持一定的渗透压。同时，它也是一种良好的溶媒，用以溶解培养用的试剂或药物等。,（四）培养用液,平衡盐溶液:,平衡盐溶液（简称盐溶液）集缓冲液的缓冲能力、生理盐水

15、的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体，兼具维持渗透压、缓冲和调节溶液的酸碱度、同时供给细胞生存所需的能量和无机离子成分的作用。,（四）培养用液,、水与平衡盐溶液,（）生理盐水与平衡盐溶液 （normal sodium，NS and balanced salt solution;BSS）,平衡盐溶液:,几种常用的平衡盐溶液配方(g/L),（四）培养用液,、水与平衡盐溶液,（）生理盐水与平衡盐溶液 （normal sodium，NS and balanced salt solution;BSS）,、水与平衡盐溶液,天然培养基,合成培养基,血清胚胎浸出液水解乳蛋白,合成培养基的种类合成培养基的主要

16、成分合成培养液的配制,、培养液,、其它常用液,无血清培养基,基础培养液生长附加成分,（四）培养用液,、培养液(culture solution),天然培养基(natural medium)：,血清（serum）：,血清（serum）是体外培养中用得最多最广的天然培养基，绝大部分动物细胞的体外培养都要使用血清。血清在动物细胞生长培养基中起着多方面十分重要的作用：能提供细胞生存、生长和增生所必需的生长调节因子；能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分；含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分；,（四）培养用液,、培养液,天然培养基：,血清（serum）：,提供载体蛋白，可结

17、合维生素、脂质、金属离子等。载体蛋白还可使被结合的物质稳定或改变性质；在一些情况下，血清有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用；给培养液提供良好的缓冲系统；提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受死细胞释放的蛋白酶的损害。,（四）培养用液,、培养液,天然培养基：,血清（serum）：,使用有血清的培养液进行培养，也有难以解决的问题：血清中也存在不少有害于细胞生长和繁殖的物质。例如补体、免疫球蛋白和一些生长抑制因子等；血清的成分不明确，影响对结果的分析；不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定。,（四）培养用液,胚胎浸出液：（略）,、培养液,天然培养基：,水解乳蛋白： （略）,（四）培

18、养用液,、水与平衡盐溶液,天然培养基,合成培养基,血清胚胎浸出液水解乳蛋白,合成培养基的种类合成培养基的主要成分合成培养液的配制,、培养液,、其它常用液,无血清培养基,基础培养液生长附加成分,（四）培养用液,、培养液,合成培养基(deffined medium)：,根据培养细胞的类型选择适合其生长的培养基是非常重要的。培养基的选择有一定的原则性，也有一定的灵活性。对于已建成的细胞系常选用建系过程中最初使用的培养基，这是选择培养基时必须考虑的原则。对于开展新的培养工作，尤其是建立新的细胞系/株，则可参考有关文献，选择和尝试使用几种培养基进行培养和比较，摸索各种培养条件。一旦成功，即可按同样的培养

19、基、血清和培养条件继续培养。,（四）培养用液,、培养液,合成培养基：,1合成培养基的种类： （略）2合成培养基的主要成分： （略）3合成培养液的配制：,现在有各种各样的商品化的培养基可供选用：液体培养基（liquid medium），购回后直接或稀释后即可使用。粉制培养基（powdered medium），按照说明书，简单配制后即可使用，十分便利快捷。,（四）培养用液,、培养液,合成培养基：,3合成培养液的配制：,一般的配制过程是：1) 取清洗干净的大烧杯1个，加入新鲜制备的三蒸水，加热至1530。2) 加1小袋培养基干粉入水中，并用少量三蒸水涮洗装粉剂培养基的袋，涮洗的水倒入大烧杯中，搅拌使

20、粉剂溶解。3) 按照说明书，加入所需量的NaHCO3以及其它可能需添加的成分。4) 加水至最终量。5) 用pH计测定培养液的pH值，必要时用1 mol/ L HCl或1 mol/L NaOH调节pH值，一般调至pH 7.0 7.2,因过滤除菌后，pH值会升高约0.20。6) 用孔径为0.22 m 的微孔滤膜过滤除菌。7) 分装，封瓶口。标记培养液名称和配制时间，置4冰箱中贮存。,（四）培养用液,、水与平衡盐溶液,天然培养基,合成培养基,血清胚胎浸出液水解乳蛋白,合成培养基的种类合成培养基的主要成分合成培养液的配制,、培养液,、其它常用液,无血清培养基,基础培养液生长附加成分,（四）培养用液,、

21、培养液,无血清培养基(serum-free medium，SFM),无血清培养基（serum free medium，SFM）有时亦称为化学限定性培养基或化学成分明确的培养基（chemically defined medium）。无血清培养基完全采用人工合成的化合物，是成分确定的培养液。在理论研究中应用无血清培养技术可以排除含血清培养时血清中许多未知因素的干扰，使实验结果更为可靠。无血清培养基也有不足之处，一是成本较高；二是无血清培养基的针对性很强，一种无血清培养基仅适用于某一类细胞的培养。,（四）培养用液,、培养液,无血清培养基,（1）基础培养液,不少合成培养液都可以作为无血清培养液的基础培

22、养基（basal medium）。最常用的是Ham F12和DMEM混合培养液。两者以1：1( V : V ）混合，再补加615 ml HEPES与1.2 g/L NaHCO3即可作为基础培养液。,（2）生长附加成分,补加何种营养成分主要由各实验室根据所培养细胞的种类而设定，没有完全统一的配方。,（四）培养用液,、水与平衡盐溶液、培养液,消化液消化酶抑制剂pH调整液抗生素液谷氨酰胺液,胰蛋白酶溶液EDTA溶液胶原酶溶液,、其它常用液,NaHCO3溶液HEPES溶液,（四）培养用液,、其它常用液,在动物细胞体外培养中，除以上介绍的两大类重要培养用液外，还有一些其它必不可少的常用液。主要包括分离细

23、胞的消化液，防止微生物污染的抗生素液，调整培养液酸碱度的pH调整液。此外，还有用于进行培养物组织细胞形态学观察的各种染液。,（四）培养用液,、其它常用液,在原代细胞培养和细胞传代时，都要使用消化液，最常用的消化液是胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二钠（EDTA）两种溶液，其次是一些特殊的组织细胞培养用的各型胶原酶。在原代细胞培养中，使用消化液从组织块中分离（散）出单个的细胞；在进行细胞传代时，消化液使细胞脱离生长表面并离散成单个细胞。,（四）培养用液,（1）消化液,、其它常用液,（1）消化液,1)胰蛋白酶溶液(trypsin solution)：,胰蛋白酶的主要作用是使细胞间的蛋白质水解而使细胞离散。不

24、同的组织或细胞系对胰蛋白酶的作用反应不一样，胰蛋白酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关。一般来说浓度大、温度高、作用时间越长，对细胞的分离能力越大。胰蛋白酶溶液在pH8.0,温度为37时，作用能力最强。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质可以降低胰蛋白酶的活性，所以配制胰蛋白酶溶掖应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS（ Ca2+-Mg2+ free BSS），如 D-Hanks 液。,（四）培养用液,2) EDTA溶液：,EDTA是一种化学螯合剂，其溶液又称Versene液，对细胞有一定的解离作用，且毒性少、价格便宜，使用方便。常与胰蛋白酶溶液按一定比例混合使用，亦可单独使用，这主要根

25、据培养细胞的种类进行选择。,3）胶原酶溶液（collagenase solution）：,有胶原酶I、II、III、IV型以及肝细胞专用胶原酶五种。,（四）培养用液,、其它常用液,（1）消化液,（2）消化酶抑制剂（enzyme inhibitor）,、其它常用液,贴壁生长的细胞传代时须使用消化酶使细胞脱离生长表面。在含血清培养时，血清中的某些成分可中止消化酶对细胞的作用。在无血清培养时，则必须使用消化酶抑制剂，以保护细胞免受残留的消化酶的损害。目前常用的酶抑制剂是大豆胰酶抑制剂。,（四）培养用液,、其它常用液,（3） pH调整液,1) NaHCO3溶液：,为了使培养液营养成分稳定和延长贮存时间

26、，一般不预先在培养液中或平衡盐溶液中直接加入NaHCO3，而是单独配制，消毒除菌后，在使用前加入。,2) HEPES溶液：,HEPES的化学名全称为：羟乙基哌嗪乙硫磺酸。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围，尤其是在开瓶通气培养或观察时能维持正常pH。,（四）培养用液,、其它常用液,（4）抗生素液,为了预防因无菌操作不严而发生污染，培养液内一般需加入适量的抗生素。用于体外培养的抗生素以青霉素应用最普遍。通常在培养液中的终浓度为20100U/ml。青霉素可以和链霉素（使用浓度为50 g/ml)联合应用抑制耐青霉素的菌株。,（5）谷氨酰胺溶液,（略）,（四）培养用液,实验课时间：从第

27、14周开始实验课地点：104馆三楼东边,注意事项：1.网上没有名字的 同学请不要填报实 验课名单。2.现在不能确定 自己时间的同学 不要填报，可以 下次上课时再报。3.一旦填报就不能 再更改时间。,、无污染的气、液相环境,、温度,、生长基质,O2CO2液相环境,多聚赖氨酸纤维连接蛋白胶原层粘连蛋白亲玻粘连蛋白韧粘素,（五）细胞在体外生长的其它条件,、无污染的气、液相环境,体外培养技术特别强调无菌操作。组织取材、细胞分离、种植、传代、孵育以及利用培养的细胞进行各种实验时，都必须在无污染环境下进行；培养所用的各种器具、液体以及其它用品都需严格消毒灭菌，以保证培养物不被污染。在无污染的前提下，必须为

28、培养物提供适宜其生存和生长的气、液相环境。,（五）细胞在体外生长的其它条件,、无污染的气、液相环境,气体环境是细胞生存的必要条件之一。供应气体的方式是向培养箱内通入含有一定比例CO2的空气。其中，与细胞生命活动密切相关的气体主要有O2和CO2。O2和CO2以气体扩散方式进入培养液和培养物内。O2(oxygen)参与细胞的能量代谢，为细胞生命活动提供能量。CO2（carbon dioxide）主要与维持培养液的酸碱度有直接关系。,（五）细胞在体外生长的其它条件,、无污染的气、液相环境,体外细胞生长的液相环境是各种平衡盐溶液或培养液。水和无机盐是其中最主要的成分，并由它们构成溶液的渗透压，也就是细

29、胞膜外的渗透压。在配制各种培养用液时，必须严格按照配方和配制方法的要求进行，以保证溶液为等渗。,（五）细胞在体外生长的其它条件,、无污染的气、液相环境,、温度,、生长基质,O2CO2液相环境,多聚赖氨酸纤维连接蛋白胶原层粘连蛋白亲玻粘连蛋白韧粘素,（五）细胞在体外生长的其它条件,、温度,无论来源于何种有机体的细胞培养都需要一个与体内生存环境尽可能一致的生长条件，其中最基本的条件之一是恒定的和适宜的温度环境。人和哺乳动物培养细胞的最适温度在3537，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。培养的细胞对低温的耐受力比对高温强。,（五）细胞在体外生长的其它条件,高温的影响：

30、温度上升不超过39时，细胞的代谢强度与温度成正比。细胞在3940中培养1h，即会受到一定损伤，但仍能恢复。当在4142的温度条件下培养1h，细胞则会受到严重损伤，但不致于全部死亡，部分仍可能恢复。当温度达43以上时，细胞大多死亡。,（五）细胞在体外生长的其它条件,、温度,低温的影响：对于温度低于正常范围的环境，总的来说，只要温度不低于0时，低温只能抑制细胞代谢，并无伤害作用。细胞在2535条件下仍能生存和生长，但速度缓慢。若将培养的细胞放在4下数小时后，再置37培养，细胞仍能继续良好地生长。细胞代谢随温度降低而减缓。温度降至冰点以下时，细胞胞浆结冰可以导致细胞死亡。,（五）细胞在体外生长的其它

31、条件,、温度,、无污染的气、液相环境,、温度,、生长基质,O2CO2液相环境,多聚赖氨酸纤维连接蛋白胶原层粘连蛋白亲玻粘连蛋白韧粘素,（五）细胞在体外生长的其它条件,、生长基质,（五）细胞在体外生长的其它条件,体外培养细胞的生长，除少数悬浮型生长的细胞外，一般需要粘附于一固相表面才能生长，这是由于在体外环境下，生存的细胞相互之间失去了在体内生存时所依托的组织学关系，只有附着于培养器皿的壁上生长。在很多情况下，培养器皿表面的材质不太适合于某些生长能力较差的细胞附着和生长，因而采用在培养液中添加或在培养器皿表面包被生长基质物质来帮助细胞黏附、贴壁和生长。,在培养器皿表面包被的这层能改善生长表面的特

32、性、促进细胞黏附和贴壁的物质，即生长基质（growth substratum）。生长基质物质主要是一些细胞外基质成分。,、生长基质,（五）细胞在体外生长的其它条件,（1）多聚赖氨酸 （poly-lysine）（2）纤维连接蛋白 （fibronectin)（3）胶原 （collagen）（4）层粘连蛋白 （laminin，LN）（5）亲玻粘连蛋白 (vitronectin)（6）韧粘素 （tenascins）,主要包括：,（六）清洗和消毒,体外培养工作需要使用大量消耗性物品，包括玻璃器皿、金属器械、塑料和橡胶制品以及布类纸类用品等培养用品。虽然很多在国外基本上都采用已消毒的一次性用品，但我国目前

33、绝大多数实验室因条件所限，一些培养用品仍在反复使用。因而体外培养中大量的工作是进行清洗和消毒。另外，与体外培养工作有关的培养室场地、工作台和培养液等也必须进行严格消毒和灭菌。清洗和消毒的主要目的在于去除培养用品上对组织生长有影响的各种杂质以及消除附着在其上的各种微生物。清洗和消毒是否彻底直接关系到体外培养的成败。操作者在培养工作中，要建立无菌观念，掌握无菌技术，防止在任何环节上发生污染。,1、培养用具的清洗,2、培养用具的 消毒和灭菌,玻璃器皿的清洗胶塞和塑料用品的清洗清洗后物品的包装,物理方法,化学方法,紫外线消毒压力蒸汽灭菌高温干热灭菌过滤除菌电离辐射灭菌,甲醛、环氧乙烷乙醇、氯已定戊二醛

34、、碘伏与碘酊抗生素,（六）清洗和消毒,1、培养用具的清洗,（六）清洗和消毒,（1）玻璃器皿的清洗：,玻璃器皿的清洗一般需经过浸泡、刷洗、浸酸和冲洗等四个步骤。,1、培养用具的清洗,（六）清洗和消毒,（1）玻璃器皿的清洗：,应以防酸、耐热、开口较大的容器盛清洁液。可选用塑料制品或玻璃制品。配制清洁液方法如下：1）按照上述配方，将需要量的重铬酸钾和水加到选用的容器内。2)向容器内缓慢、分次加入浓硫酸（工业用即可）。可轻缓搅拌溶液，以加快散热及使重铬酸钾溶解。加入浓硫酸切忌过急，以免液体骤热，发生危险。3)自然冷却。,清洁液的配制：,新配制的清洁液呈棕红色。配制清洁液和浸酸时，操作者须戴耐酸手套等。

35、浸酸的器皿一定要凉干，以免将水分带入清洁液而使其效力下降。放入器皿或浸酸后拿出器皿时，须小心操作，防止液体溅出，伤及皮肤和衣服。将器皿从清洁液中拿出时，应滴干清洁液。当清洁液的颜色变暗、发绿或混浊时，说明使用过久，效力降低，应重新配制。,1、培养用具的清洗,（六）清洗和消毒,（1）玻璃器皿的清洗：,清洁液的配制：,1、培养用具的清洗,（六）清洗和消毒,（2）胶塞和塑料用品的清洗：,使用后的胶塞要先在水中浸泡，然后用2% NaOH溶液煮沸10 min.，自来水冲洗晾干后，再用1%稀盐酸浸泡30 min。最后分别用自来水和双蒸水各冲洗3次，烘干备用。塑料器皿在使用后也要及时在水中浸泡。自来水冲洗干

36、净。一般不用刷洗以防划痕和损伤。洗干净的器皿先在2% NaOH溶液中浸泡过夜，自来水冲洗，再经1稀盐酸浸泡30 min.，最后分别用自来水和双蒸水冲洗3次。烘干备用。,1、培养用具的清洗,（六）清洗和消毒,（3）清洗后物品的包装：,洗净烘（晾）干的培养物品应及时包装，以备消毒灭菌。包装的物品便于消毒和贮存，同时可防止消毒灭菌后再受污染。包装常用牛皮纸、硫酸纸、纱布、平纹棉布、铝盒、搪瓷杯、专用金属消毒筒等。包装的方式可根据消毒灭菌的方法而有所不同：对于体积较大的瓶皿（如大烧杯、烧瓶）及滤器等其它容器，可进行局部包装。对于体积较小的培养用品如培养皿、吸管、注射器、金属器械、胶塞及棉球等可以先装入

37、铝饭盒、搪瓷杯或消毒筒等容器中，然后再用平纹布全部包裹起来。,1、培养用具的清洗,2、培养用具的 消毒和灭菌,玻璃器皿的清洗胶塞和塑料用品的清洗清洗后物品的包装,物理方法,化学方法,紫外线消毒压力蒸汽灭菌高温干热灭菌过滤除菌电离辐射灭菌,甲醛、环氧乙烷乙醇、氯已定戊二醛、碘伏与碘酊抗生素,（六）清洗和消毒,（六）清洗和消毒,2、培养用具的消毒和灭菌,（1）物理方法：,常用物品的消毒方法：,（六）清洗和消毒,2、培养用具的消毒和灭菌,（1）物理方法：,1）紫外线消毒（disinfection by ultraviolet light）,紫外线（ultraviolet）是一种低能量的电磁辐射，可以

38、杀灭多种微生物：其中以革兰氏阴性菌最为敏感；其次是革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌等；再次为芽孢；真菌孢子的抵抗力最强。紫外线的作用机制是通过对微生物核酸及蛋白质等的破坏作用而使其灭活的。目前多用紫外线灯直接照射培养室内空气、地面、工作台表面等进行消毒。其用法简便，效果好。,（六）清洗和消毒,2、培养用具的消毒和灭菌,（1）物理方法：,2）压力蒸汽灭菌（pressuresteam sterilization）,压力蒸汽灭菌是目前最常用的一种灭菌方法。其通过高温高压及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而使微生物死亡。布类衣物、玻璃器皿、金属器械、胶塞和某些培养用液等都可

39、应用这一方法。,（六）清洗和消毒,2、培养用具的消毒和灭菌,（1）物理方法：,3）高温干热灭菌（dry heat sterilization）,体外培养中的干热灭菌主要是用电热烤箱内160以上的高热，并保持90120min，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的的方法。主要用于不便在压力蒸汽灭菌器中进行灭菌且不被高温损坏的玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶等）、金属器械以及不能和蒸汽接触的物品（如粉剂、油剂等）。,（六）清洗和消毒,2、培养用具的消毒和灭菌,（1）物理方法：,4）过滤除菌（filtration sterilization）,过滤除菌是将液体或气体用具有微孔的薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微

40、生物颗粒阻留，从而达到除菌的方法。在体外培养中，过滤除菌大多用于遇热易发生变性而失效的试剂或培养用液。,（六）清洗和消毒,2、培养用具的消毒和灭菌,（1）物理方法：,5）电离辐射灭菌（sterilization by ionizing radiation）,电离辐射灭菌是以放射性核素产生的射线或电子加速器产生的加速粒子辐照物品以杀灭细菌等微生物的方法。其灭菌的优点：一是辐射灭菌不使物品升温，对于不耐热物品的灭菌尤其适用；二是辐射的穿透力强，经密封包装的物品进行灭菌后，可长期保存，随取随用。辐射灭菌方法简便，不须考虑多种控制因素。培养工作中所用的许多一次性器械与物品，如培养瓶皿、培养板、注射器、

41、移液器吸头、离心管等，都可以经辐射灭菌。由于电离辐射需要专门的设备，一般实验室不具备条件。灭菌时须经专业人员指导和操作。,（六）清洗和消毒,2、培养用具的消毒和灭菌,（2）化学方法：,化学方法消毒是利用化学消毒剂来消毒那些不能用物理消毒等方法进行消毒的物品和场地，如无菌室的空气、台面，操作者的皮肤等。体外培养常用的化学消毒剂包括甲醛、环氧乙烷、乙醇、氯己定（洗必泰）、戊二醛和碘伏等。此外，市场上以各种商品名所称的化学消毒剂多为复合类制剂，可用于台面、地面等的消毒，使用时须参照其说明书。,（六）清洗和消毒,2、培养用具的消毒和灭菌,（2）化学方法：,1）甲醛（methyl aldehyde）甲醛

42、是一种广谱灭菌剂，其水溶液和气体对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。,2）环氧乙烷（ethypene oxide）环氧乙烷气体具有广泛的杀菌作用，它不损害消毒物品，且有穿透力强的优点。主要用于消毒塑料用品以及其它不耐高热高压以及不能受潮湿的物品。,（六）清洗和消毒,2、培养用具的消毒和灭菌,（2）化学方法：,3）乙醇（ethanol）乙醇是一种广泛应用的消毒剂，消毒效果可靠，且它对其它灭菌剂例如戊二醛、碘伏、氯己定（洗必泰）等有增效或协同作用。由于乙醇的挥发性好，常用于需要快速发挥作用而不必持续时间太久的消毒，如操作者的手与手术野的皮肤消毒，台面或物体的表面消毒。,4）氯己定（洗必泰）

43、 (hibitane)氯己定（洗必泰），化学名为1，6-双（正-对氯苯双胍）己烷，是广谱杀菌剂。其毒性低，刺激性小，不产生耐药性，是目前广泛应用的消毒剂之一。主要用于皮肤及创面的消毒。,（六）清洗和消毒,2、培养用具的消毒和灭菌,（2）化学方法：,5）戊二醛(glutaraldehyde)戊二醛是一种广谱、高效灭菌剂。具有水溶液稳定，对金属腐蚀性小，低毒安全等优点。,（六）清洗和消毒,2、培养用具的消毒和灭菌,（2）化学方法：,6）碘伏(iodophor)与碘酊碘伏是一种广谱杀菌剂，能杀死细菌、芽孢、真菌、病毒等，且杀菌的速度很快。近年来已在临床广泛使用，医用碘伏是聚烯毗咯烷酮-碘（PVP-I），它可用来进行操作者的手消毒和手术野的皮肤消毒。,OVER,