细胞培养培养物的观察和检测方法ppt课件.ppt

《细胞培养培养物的观察和检测方法ppt课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞培养培养物的观察和检测方法ppt课件.ppt（62页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、课 程 安 排 及 进 度,体外培养的原理与技术薛庆善 主编,广西医科大学组胚教研室何少健,电话：13367805949；0771-5358577(办),体外培养的基本原理与技术,一、从体内生存环境到体外生长条件,二、体外培养的基本方法和过程,三、体外培养物的生长生物学,四、细胞分离与纯化,五、细胞系（株）、细胞克隆,六、培养物的观察检测方法,无论是在进行体外培养的过程中还是在培养工作结束之后，经常需要对培养物（培养的细胞或者植块）进行观察检测，以了解培养物的生长状况，研究培养物的生命活动变化。这方面的内容涉及到形态学、细胞生物学、生理生化、遗传学以及分子生物学等多学科的技术手段。观察检测体外

2、培养物最常用的技术方法，包括：,培养物的观察检测方法,1.活细胞的观察检测方法,2.普通染色观察,3.细胞化学技术,4.免疫细胞化学技术,5.原位杂交技术,6.电子显微镜技术,培养物的观察检测方法,1.1 相差显微镜观察培养物的形态结构,由于培养的细胞在生活状态下，几乎是透明的，结构之间的反差很小，如果用普通光学显微镜观察，看不清活细胞的形态结构。若要观察其微细结构和变化，就须借助能够增强结构之间反差的特殊显微镜，此即相差显微镜（phase contrast microscope)。相差显微镜专门用于对体外培养的活细胞进行观察。用相差显微镜可直接观察到活细胞的形态结构、分裂增殖的动态变化及细胞

3、运动等各种生命现象。,1.活细胞的观察检测方法,相差显微镜的原理： 用一般光镜之所以难以看清活细胞，是由于活细胞无色透明，当光波通过它时，颜色和亮度变化不大。 相差显微镜则是利用细胞内各结构密度的不同而对光产生折射率有差异的原理，在折射率大的物体中比折射率小的物体中光波前进的距离较短，此距离差异叫光程差，由于光程差引起光的相位变化称为相位差或相差。使用相差显微镜可使用肉眼不能分辨的相位差变为可分辨的振幅差（即明暗差），故使无色透明的物体在镜下其结构的反差显著，影像清晰。,培养物的观察检测方法,1.1.1 相差显微镜,1.活细胞的观察检测方法,1.1 相差显微镜观察培养物的形态结构,Pale S

4、quamous Cells (scrapings from the inside of mouth) 1600 x Bright Field,Pale Squamous Cells (scrapings from the inside of mouth) 1600 x - Phase Contrast,培养物的观察检测方法,1.1.2 用相差显微镜观察活细胞的方法 （略）,1.活细胞的观察检测方法,1.1.1 相差显微镜,1.1 相差显微镜观察培养物的形态结构,1.1.3 活细胞的动态观察与缩时电影 （略）,培养物的观察检测方法,1.活细胞的观察检测方法,1.2 细胞计数法,细胞计数法（cel

5、l counting）是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用细胞计数板（即血细胞计数板）进行（见右图）。既可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。,计算公式：细胞密度(4大格细胞总数4) * 10,000(个ml),大格,对于压线的细胞只计算在上线和左线者,培养物的观察检测方法,1.活细胞的观察检测方法,1.3 细胞生长曲线,细胞生长曲线（cell growth curve）是观测细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标，它以培养时间（d)为横坐标、细胞密度为纵坐标作坐标图。,制作细胞生长曲线的过程：（1）培养细胞首先在培养板

6、的21个孔内分别接种相同数量的细胞（如果使用培养瓶，则需接种21瓶）。计数并记录接种的细胞悬液之密度。接种时间记为 0 h。（2）计数细胞密度从接种时间算起，每隔24h计数3孔（瓶）内的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔（瓶）细胞可计数23次。如此操作至第七天结束。（3）绘制曲线以培养时间（d)为横坐标、细胞密度为纵坐标，将全部结果在坐标纸上绘图，即得所培养细胞的生长曲线（见下图所示）。,培养物的观察检测方法,1.活细胞的观察检测方法,1.3 细胞生长曲线,培养物的观察检测方法,1.活细胞的观察检测方法,1.4 体外活体染色观察与活体染料,体外活体染色就是在体外条件下用某种染色剂（即活

7、体染料）对活的组织或细胞进行染色，而不影响活细胞的生命活动的方法。利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，经染色的培养物还可以继续进行培养。能够使活细胞着色而不影响细胞生命的染料就是活体染料。真正的活体染料，既能固着在活细胞的某种结构上，又对细胞本身不产生明显的毒性作用。,活体染料可分为碱性活体染料和酸性活体染料两大类：,培养物的观察检测方法,1.活细胞的观察检测方法,1.4 体外活体染色观察与活体染料,体外活体染色一般使用碱性活体染料（带正电荷）。酸性活体染料多用于体内活体染色，体外活细胞难以着色。,1.4.1 活体染料的类别,培养物的观察检测方法,1.活细胞的观察检测方法,1.4 体外活体

8、染色观察与活体染料,1.4.2 工作浓度,体内活体染色时，注射的活体染料溶液浓度可高达1甚至2 。而体外活体染色一般使用2 、1 甚至0.1 ,0.05 或者更淡的染液。以1 0.3 的浓度较为合适。可以用平衡盐溶液、PBS或生理盐水等配制。,培养物的观察检测方法,1.活细胞的观察检测方法,1.4 体外活体染色观察与活体染料,1.4.3 染色步骤,1) 吸去培养液，将培养物用平衡盐溶液,PBS或生理盐水稍事洗涤。2) 加入活体染料溶液，在培养箱内静置染色0.5h或者12h。3) 在显微镜下观察（细胞将被淡染）或作其它处理 （作选择性标记等）。4) 倾去染液。用平衡盐溶液、PBS或生理盐水洗涤。

9、5) 加入培养液，继续培养。,培养物的观察检测方法,1.活细胞的观察检测方法,1. 活细胞的染料排除检测法,由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞呈色。而活细胞反之，能排出进入细胞内的染料，因而不易着色。此法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反应而区分开两种细胞。,15.1 台盼蓝排除检测法：（1）2台盼蓝溶液的配制：称取2g台盼蓝(trypan blue），加少量双蒸水研磨粉碎后，再加水至50ml，离心后取上清液，再加入1.8NaCI溶液至100ml，即成工作液。（2）活体染色与细胞计数1)将1滴细胞悬液（贴壁细胞可经0.25%胰蛋白酶溶液消化后，吹打制成

10、细胞悬液）与2滴台盼蓝液混合后，滴入细胞计数板。2)2 min后，在显微镜下计数至少200个细胞。未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞。计算活细胞的百分比。,培养物的观察检测方法,1.活细胞的观察检测方法,1. 活细胞的染料排除检测法,15.2 溴比乙锭和碘化丙锭排除检测法： 溴比乙锭（ethidium bromide, EB)和碘化丙锭（propidium iodine, PI）均为荧光染料，可与DNA特异性结合。（1）染液配制：取EB或PI 5mg , 枸橼酸钠0.1g , NP-40 0.3 ml, 共溶于100 ml蒸馏水中。避光保存。（2）荧光染色与计数：取细胞悬液和EB或PI染液各0

11、.5 ml，混匀。 静置1030 min后在荧光显微镜下计数。发橙红色荧光者为死细 胞。也可用流式细胞仪测定，激发光波长为488 nm。 2 h内荧光 保持稳定。,培养物的观察检测方法,1.活细胞的观察检测方法,1. 活细胞的染料排除检测法,培养物的观察检测方法,1.活细胞的观察检测方法,1.6 细胞增殖活性测定的3H-TdR掺入法,细胞增殖前必须复制DNA，而胸腺嘧啶是DNA的特异碱基。用3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（TdR）掺入到新合成的DNA中后，会均匀地分布于子细胞中。此时只要测定3H的放射性脉冲数便可比较不同细胞的增殖活性。,1.7 细胞活力测定的MTT比色法,此法的原理是活细胞的线粒

12、体脱氢酶能将染料MTT（二甲基噻唑二苯基四唑溴盐）转变为不可溶性的紫色甲鐟(formazan )颗粒，后者被酸性异丙醇溶解后所呈现的色度（用OD值表示）反映出活细胞的代谢水平。死亡细胞则无此酶活性。,培养物的观察检测方法,2.普通染色观察,苏木精伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色和Giemsa染色是观察培养细胞一般形态的最常用方法，也是把细胞作为标本保存的主要方法。,对于贴壁培养的细胞，以生长于盖玻片和塑料培养瓶壁者便于操作。固定前先用Hanks液、PBS, BSS或生理盐水清洗培养物2次，去除妨碍染色的血清。固定后可将盖玻片用树胶贴于载玻片上，以利操作。对于悬浮培养细胞，

13、须先经离心沉淀(1000 r/min, 10 min),弃上清液后（留少量液体），将细胞悬液滴于玻片上做成涂片，冷风吹干。,培养物的观察检测方法,3.细胞化学技术,细胞化学技术（cytochemistry）可特异性地显示细胞内的细胞器和化学成分，其技术成熟，效果稳定，费用较低，即使在免疫细胞化学畅行的今天，也仍不失为有效的研究技术。,3.1 酸性磷酸酶,3.2 葡萄糖6磷酸酶,3.3 琥珀酸脱氢酶,3.4 DNA与RNA的吖啶橙荧光染色法,3.5 DNA的富尔根（Feulgen )染色法,几种最常用的方法：,培养物的观察检测方法,3.细胞化学技术,3.1 酸性磷酸酶,酸性磷酸酶（acid ph

14、osphatase）是溶酶体的特征性酶，故常用此法作为研究溶酶体的指标。其原理是该酶在酸性条件下分解甘油磷酸钠，释放出的磷酸根与醋酸铅的醋酸根置换，形成磷酸铅，后者与硫化胺作用，最终形成棕黑色的硫化铅沉淀物，于镜下清晰可辨。,3.2 葡萄糖6磷酸酶,葡萄糖-6一磷酸酶（glucose-6-phosphatase )为滑面内质网的标志酶。,琥珀酸脱氢酶（succinodehydrogenase）是线粒体的标志酶，参与细胞有氧呼吸，其活性与线粒体活性平行，在癌细胞中其活性常减弱。,3.3 琥珀酸脱氢酶,培养物的观察检测方法,3.细胞化学技术,3.4 DNA与RNA的吖啶橙荧光染色法,3.5 DNA

15、的富尔根（Feulgen )染色法,吖啶橙（acridine orange, AO）与细胞内的DNA, RNA都有亲和力，但结合后却发不同颜色的荧光，DNA呈亮绿色，而RNA呈橘黄色至火红色。此法极简便快捷，并可染活细胞与固定细胞。,此法原理是：在60条件下DNA分子中的嘌呤碱和脱氧核糖的连键可被1 mol/L盐酸水解打开，游离出的脱氧核糖醛基能与希夫（Schiff )试剂结合，形成紫红色复合物。在此过程中RNA不受影响，故染色具DNA特异性。准确的温度和盐酸浓度，适宜的水解时间是成功的关键。水解过度或不足均降低染色强度。,培养物的观察检测方法,4.免疫细胞化学技术,免疫细胞化学（immuno

16、cytochemistry, ICC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，以标记抗体作为探针来显示细胞内抗原成分，主要是多肽与蛋白质（包括受体、酶、分泌物前体等各种基因表达产物），对其进行定位、定性及定量的研究。在体外培养技术方面，ICC是鉴定细胞类型的可靠手段。,4.1 常用免疫细胞化学技术原理,4.2 常用的显色标记物,4.3 免疫细胞化学方法及标记物的选择,4.4 免疫细胞化学的一般问题,4.5 免疫细胞化学染色的典型程序,培养物的观察检测方法,4.免疫细胞化学技术,4.1 常用免疫细胞化学技术原理,标记物二抗一抗抗原,标记物SPA一抗抗原,标记链亲和素生物素二抗一抗抗原,PAP复合物二抗

17、一抗抗原,间接法,SPA法,LSAB法,PAP法,常用免疫细胞化学技术原理示意图,4.1.1 间接法 indirect method,4.1.2 过氧化物酶抗过氧化物酶法peroxidase-anti peroxidase, PAP法,4.1.3 标记链亲和素 生物素法labeled streptoavidin biotin, LSAB法,4.1.4 葡萄球菌蛋白A法staphylococal protein A, SPA法,培养物的观察检测方法,4.免疫细胞化学技术,4.1 常用免疫细胞化学技术原理,4.1.1 间接法,最原始的ICC技术是在获得针对某抗原的特异性抗体后，各实验室自行对该抗体

18、进行标记，然后用标记抗体直接进行免疫染色。这种方法虽然步骤不多，然而标记抗体操作复杂，质量也不易保持稳定。由于种间的免疫球蛋白互具抗原性，这样可以制备如抗小鼠IgU的兔抗体，前者简称一抗，后者简称二抗。二抗可以与所有特异性不同的小鼠一抗结合，只需要标记二抗便解决了标记不同一抗的麻烦。目前，标记的二抗已完全商品化。这样，用二抗间接显示抗原的方法便取代了原始的直接法。间接法（indirect method）的另一优点是1个一抗分子上可以结合3-5个二抗分子，因此该方法的敏感度提高。,标记物二抗一抗抗原,培养物的观察检测方法,4.免疫细胞化学技术,4.1 常用免疫细胞化学技术原理,4.1.2 过氧化

19、物酶抗过氧化物酶法 （peroxidase-antiperoxidase, PAP法）,这里的过氧化物酶特指辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP）。该酶经细胞化学反应而呈色。HRP作为一种蛋白质可制备出相应抗体。PAP复合物即为3个酶分子与2个抗酶抗体结合形成的稳定的环状结构。此法的前提是抗酶抗体与一抗同源，即可与二抗结合。这样，1个二抗分子上间接地标记了3个酶分子。因此，PAP法的敏感度从理论上讲比间接法（酶标）提高了两倍。但由于PAP复合物分子大，穿透性差，其敏感度增强的实际效果可能要打折扣。,PAP复合物二抗一抗抗原,培养物的观察检测方法,4.免疫细胞化

20、学技术,4.1 常用免疫细胞化学技术原理,4.1.3 标记链亲和素生物素法（labeled streptoavidin biotin, LSAB法）,链亲和素是从链球菌提取的一种糖蛋白。生物素即维生素H。这两种物质有极强的亲和力，并且1分子链亲和素可结合多分子生物素。此法即利用生物素标记二抗，然后再加有不同标记物的链亲和素。对链亲和素的标记方法有多种，简单者如将链亲和素标记上HRP或荧光素，复杂者则制备出链亲和素（或亲合素）生物素PAP复合物（avidin-biotin PAP complex)，后者即ABC法。由于1个抗体分子上可结合多至150个生物素分子，于是，这类方法的敏感度便大大增强，

21、一抗的稀释度得以提高。,标记链亲和素生物素二抗一抗抗原,培养物的观察检测方法,4.免疫细胞化学技术,4.1 常用免疫细胞化学技术原理,4.1.4 葡萄球菌蛋白A法（staphylococal protein A, SPA法）,SPA具有与人、小鼠、猪以及猴等动物的抗体Fc段结合的能力。因此，利用HRP、荧光素或胶体金标记的SPA可以完成标记二抗的功能，堪称“广谱二抗”。SPA的分子量小，穿透细胞的能力强于抗体，这样可提高方法的敏感度。,培养物的观察检测方法,4.免疫细胞化学技术,4.2 常用的显色标记物,4.2.1 辣根过氧化物酶,4.2.2 碱性磷酸酶,用辣根过氧化物酶（horseradis

22、h peroxidase, HRP）及其它酶（如碱性磷酸酶）作标记物的ICC常称为免疫酶方法。HRP经细胞化学反应后于标记部位形成稳定的有色终产物。,用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）代替HRP作标记物进行免疫酶染色，主要用于内源性过氧化物酶含量高的细胞，以避免非特异性染色。,培养物的观察检测方法,4.免疫细胞化学技术,4.2 常用的显色标记物,4.2.3 荧光素,用荧光素（(luorescein)作标记物的ICC常称为免疫荧光技术。异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC)和四甲基异硫氰酸罗达明( tetramethyl

23、rhodamine isothiocyanate, TMRITC）是最常用的荧光素。 用荧光素作标记物无需呈色反应，因而省时简便。但由于荧光会逐渐减退，故染色后应尽早观察和摄影。 近年启用的抗褪色剂DABCO1-4diaza-bicyclo(2-2-2) octane封固能有效延长染色后标本的可观察期至一周或更长。如封固后盖玻片四周用指甲油（非丙酮溶剂）密封，效果则更好。封固后的标本不观察时均应置于避光、4或低温处。,培养物的观察检测方法,4.免疫细胞化学技术,4.2 常用的显色标记物,4.2.4 胶体金与免疫金银技术,胶体金(colloid gold)即金的水溶液，为最常用的金属标记物。用胶

24、体金作标记物的ICC称免疫金技术。免疫金技术和免疫荧光技术一样，免疫染色后即可于镜下观察，无需标记物的显示程序。供光镜观察的免疫金染色使用的胶体金颗粒直径通常较大，为20nm，镜下呈粉红色。体积大的金颗粒与抗体的结合不十分稳定，这便降低了免疫金方法的敏感度。,培养物的观察检测方法,4.免疫细胞化学技术,4.2 常用的显色标记物,4.2.4 胶体金与免疫金银技术,尔后发明的免疫金银技术则有效地避免了这一缺陷。其原理是：使已在抗原位置沉积的金颗粒发挥催化作用，促进银离子被氢醌（hydroquinone）还原为银原子，后者围绕金颗粒形成一层银壳；银壳本身也具有催化作用，使更多的银离子还原沉积，银壳便

25、增大，镜下呈黑色颗粒。这样抗原的存在部位便显著放大。因而免疫金银技术可以使用与抗体结合牢固的510 nm胶体金。据认为，免疫金银技术敏感度高于PAP法。,4.3 免疫细胞化学方法及标记物的选择,培养物的观察检测方法,4.免疫细胞化学技术,理想的方法应是敏感、简便、快速以及经济，但主要取决于所研究的标本及其抗原的分布与含量。一般来讲，估计抗原含量中等以上的标本可应用间接法或SPA法。如果有荧光显微镜则可采用便捷的免疫荧光技术。估计抗原含量中等以下宜采用LSAB法、PAP法或者免疫金银技术。,4.3 免疫细胞化学方法及标记物的选择,培养物的观察检测方法,4.免疫细胞化学技术,ICC与免疫组织化学（

26、immunohistochemistry）的不同之处在于后者要做组织切片，细胞被切开后，核与胞质内的抗原暴露于抗体，二者极易结合。而ICC技术的染色对象一般为完整的细胞。细胞膜在固定后其通透性虽有所增强，但对于抗体这样的大分子仍嫌不够，需进一步提高。常用方法为以去垢剂Triton X脱去细胞膜中最主要的成分脂质。另一方面是要选择分子量较小因而穿透性较大的探针。用小分子量的荧光素或生物素标记的二抗均比酶标者穿透性大，用SPA代替二抗也是一种明智的选择。而用PAP与胶体金一般较适用于细胞表面抗原的染色。,培养物的观察检测方法,4.免疫细胞化学技术,4.4 免疫细胞化学的一般问题,4.5 免疫细胞化

27、学染色的典型程序,（略）,（略）,培养物的观察检测方法,5.原位杂交技术,免疫细胞化学是在翻译水平检测基因的表达结果（蛋白质），原位杂交（in situ hybridization, ISH)技术则是检测基因的有无及在转录水平检测基因的活性(mRNA)。ISH的原理是：应用带有标记物的已知碱基顺序的核酸探针与细胞内待测的核酸（DNA或RNA）按碱基配对的原则进行特异性原位结合，此即为杂交，然后通过对标记物的检测而获知待测核酸的有无及相对量。,5.1 探针与标记物的选择,5.2 原位杂交技术主要实验材料,5.3 杂交,5.4 显示标记物,5.5 设立对照,培养物的观察检测方法,5.原位杂交技术,

28、5.1 探针与标记物的选择,5.1.1 常用的探针,常用的探针有三种：5.1.1.1 cRNA探针：5.1.1.2 DNA探针：5.1.1.3 寡核苷酸探针：前两者的理想长度是100个左右的碱基或碱基对。,目前，cRNA探针应用最为广泛。一般认为，RNA-RNA杂交体的稳定性强于RNA-DNA杂交体，后者又强于DNA-DNA杂交体。但是，RNA易于被环境中普遍存在的RNA酶所降解而造成假阴性结果，因此操作要求十分严格。单链DNA探针由于PCR技术的推广，其合成与操作均比RNA探针简易，应用日渐增多。,培养物的观察检测方法,5.原位杂交技术,5.1 探针与标记物的选择,5.1.1 常用的探针,培

29、养物的观察检测方法,5.原位杂交技术,5.1 探针与标记物的选择,5.1.2 探针标记物,在上述探针的合成中，均要加入带有标记物的核苷酸。合成RNA探针用标记的三磷酸尿嘧啶（UTP），合成DNA探针用标记的三磷酸胸腺嘧啶（TTP）。应用的标记物有放射性核素以及半抗原等。,培养物的观察检测方法,5.原位杂交技术,5.2 原位杂交技术主要实验材料,（1） 标本的制备 （略）（2） 实验所用器具 （略）（3） 溶液配制 （略）,培养物的观察检测方法,5.原位杂交技术,5.3 杂交,（1）杂交前处理 （略）（2）杂交过程 （略）（3）杂交后清洗 （略）（4）使用RNA探针杂交的一般程序 （略）（5）使

30、用DNA探针进行杂交的特点 （略）（6）使用DNA探针杂交的一般程序 （略）,培养物的观察检测方法,5.原位杂交技术,5.4 显示标记物,半抗原标记物的显示：可按试剂盒说明进行。放射性核素的显示过程：（略）即放射自显影法（autoradiography）,培养物的观察检测方法,5.原位杂交技术,5.5 设立对照,由于探针能够与靶核酸以外的细胞成分非特异性结合，因此，设置适当的对照试验以证明结果的特异性是必不可少的。对照组应使用与实验组同一批传代培养的细胞。,常用的对照试验如下： 预先用RNA酶或DNA酶消化靶核酸，然后进入正常杂交程序。结果应为阴性； 使用cRNA探针时，应用与靶mRNA碱基序

31、列相同的同义RNA探针作对照。结果应为阴性； 对于检测mRNA的原位杂交实验，可同时做该mRNA翻译产物（蛋白质或肽）的免疫细胞化学检测。结果应为阳性； 用Southern或Northern印迹杂交法证明标本中含有原位杂交所要检测的DNA或RNA。结果应为阳性； 使用半抗原标记的探针时，应设不加探针进行杂交的对照，以证实半抗原的非内源性。结果应为阴性。,培养物的观察检测方法,5.原位杂交技术,5.5 设立对照,培养物的观察检测方法,6.电子显微镜技术,普通光学显微镜的分辨率是0.2m，而电子显微镜的分辨率约为0.2 nm，是光镜的一千倍。因此，用电镜观察细胞超微结构的变化，用电镜免疫组织化学观

32、察蛋白质的超微定位变化、以及应用其它电镜技术，都可为细胞的研究提供有价值的信息。,6.1 超薄切片技术,6.2 电镜免疫细胞化学技术,6.3 其它电镜技术简介,培养物的观察检测方法,6.电子显微镜技术,6.1 超薄切片技术,制备超薄切片，以透射电镜观察细胞的超微结构，是最主要、最基本的电镜技术。,6.1.1 对培养物的预处理,（1）悬浮培养细胞的处理（2）贴壁细胞的处理,培养物的观察检测方法,6.电子显微镜技术,6.1 超薄切片技术,6.1.1 对培养物的预处理,（1）悬浮培养细胞的处理,终止培养后，首先将细胞转入锥形管离心5min，使之形成既不松散又不过于紧密的细胞团块，然后像组织块那样处理

33、。移动细胞团块时用力宜轻，切勿挟碎。,培养物的观察检测方法,6.电子显微镜技术,6.1 超薄切片技术,6.1.1 对培养物的预处理,对于在塑料培养瓶中贴壁生长的细胞，可先行原位固定后再收获细胞进行包埋。对于在玻璃培养瓶内培养的细胞或者在盖玻片上培养的细胞，一般先将细胞消化下来，经离心后再固定制片。细胞若是生长在软质薄膜上，可原位固定并原位包埋。,（2）贴壁细胞的处理,培养物的观察检测方法,6.电子显微镜技术,6.1 超薄切片技术,6.1.1 对培养物的预处理,（2）贴壁细胞的处理,1) 塑料培养瓶：对于在塑料培养瓶内培养的细胞，可经原位固定后再进一步制片。细胞在瓶内原位接受戊二醛固定，冲洗后用

34、电烙铁将培养瓶水平割开，然后用头端宽扁锐利的淀帚铲(policeman)将细胞刮下。离心后，用锇酸固定。绝大部分细胞的基底面结构保存完好。,培养物的观察检测方法,6.电子显微镜技术,6.1 超薄切片技术,6.1.1 对培养物的预处理,（2）贴壁细胞的处理,2) 玻璃培养瓶和盖玻片：终止培养后，首先用冷PBS (4，无Ca2+、Mg2+）冲洗细胞2次后，加入冷的含2 mmol/L EDTA的PBS,置于冰盒中，10 min后换新的EDTA消化液。然后，用吸管吹打约10 min，使细胞脱壁成为细胞悬液。于4离心后固定。此法能获得成片细胞，细胞形状保存完好，但超微结构受到一定影响。,培养物的观察检测

35、方法,6.电子显微镜技术,6.1 超薄切片技术,6.1.1 对培养物的预处理,（2）贴壁细胞的处理,3) 聚苯乙烯薄膜：厚度与盖玻片相仿，无毒、柔软，是盖玻片的良好替代物。可与细胞一起包埋切片。处理时，在戊二醛固定后，将其剪成1mm宽、23mm长的适合包埋的小块。这是理想的培养细胞的原位包埋法。,培养物的观察检测方法,6.电子显微镜技术,6.1 超薄切片技术,6.1.1 对培养物的预处理,（2）贴壁细胞的处理,4) 微孔滤膜：有多种材料制成的微孔滤膜（millipore filter membrane），如纤维素、胶原、聚苯乙烯等，均可进行原位包埋。由于生长在滤膜的细胞可从上下两个途径获取营养

36、，其生长状态可能有别于一般贴壁细胞。,培养物的观察检测方法,6.电子显微镜技术,6.1.2 标本制备,大部分程序在带盖的青霉素小瓶中进行。各种液体均须用双蒸水配制。所有玻璃器皿的内壁均应用双蒸水冲洗内壁后高温干燥。,常规使用戊二醛-锇酸双重固定法。戊二醛(glutaraldehyde）主要用于固定蛋白质。而锇酸(osmic acid)还能够良好地保存脂类，特别是形成膜结构的脂类，并有电子染色的作用。,（1）固定:,培养物的观察检测方法,6.电子显微镜技术,6.1.2 标本制备,（1）固定:,商品戊二醛是其25%或50%水溶液。开瓶后如不一次用完，可在贮存瓶中加少量活性炭，去除氧化物。对已贮存长

37、久的戊二醛亦可如此处理。常用的2.5%戊二醛0.1mol/ L磷酸盐缓冲液（PB）固定液，配制方法如下：（1）0.2mo1/L PB(pH7.4） A液：取NaH2PO42H2O 1.56 g,加水至50 ml。 B液：取Na2HPO412H2 O 7.16g,加水至l00ml。 取A液19 ml与B液81 ml混合，调节pH值至7.4即成。（2）2.5戊二醛PB固定液：取0.2 mol/L PB 50m1与25%戊二醛10 ml混合，再加水至100 ml。,培养物的观察检测方法,6.电子显微镜技术,6.1.2 标本制备,（1）固定:,锇酸为淡黄色结晶，0.5g或1.0g安培包装。锇酸溶解缓慢

38、，至少应在使用前24 h配液。配液前要用酸性洗液浸泡安培数小时，再经自来水与蒸馏水先后洗涤，然后用磨砂轮划痕（切勿手触安培，可用纸巾包裹其一端操作），放入棕色的密封性好的瓶内。用玻棒将安培击破后，迅速加人双蒸水。室温下约一天方可溶解。锇酸用于后固定。细胞经戊二醛前固定后，对后固定液的酸碱度等已不敏感。,培养物的观察检测方法,6.电子显微镜技术,6.1.2 标本制备,（1）固定:,两种固定剂均具有很强的挥发性。锇酸对人黏膜损伤尤大，故均应在通风橱内操作，于4保存。配好的锇酸固定液如暂不用，可于一20冻结以尽量减少挥发。戊二醛固定在室温条件下进行，一般30 min即可。饿酸固定在4下进行，1h，不

39、必中途换液。如细胞团块较大，可酌情延长固定时间。,培养物的观察检测方法,6.电子显微镜技术,6.1.2 标本制备,（1）固定:,（2）脱水与置换： （略）（3）环氧树脂包埋法： （略）（4）具体操作程序： （略）（5）超薄切片染色： （略）,培养物的观察检测方法,6.电子显微镜技术,6.2 电镜免疫细胞化学技术,又称免疫电镜技术(immunoelectronic microscopy)。 旨在对细胞表面及内部的蛋白质、肽等具有抗原性的物质进行超微定位，亦可进行半定量的研究。其难于光镜免疫细胞化学之处在于，进行免疫染色前的处理既要保存抗原活性，又要保存超微结构，而后者极易受到损伤。,6.2.1

40、显示细胞表面抗原 （略）,6.2.2 显示细胞内抗原 （略）,培养物的观察检测方法,6.电子显微镜技术,6.3 其它电镜技术,6.3.1 扫描电镜技术：,扫描电镜技术（scanning electron microscopy）可用来观察培养细胞的外部三维形状及其表面的微细结构，故无需切片而是力图保持细胞的完整性。要进行扫描电镜观察的细胞最好培养在易于移动的支持物（如盖玻片、聚苯乙烯薄膜）上。终止培养后须充分清洗。用2.5%戊二醛固定1h。乙醇或丙酮脱水后（程序可与超薄切片制备相同），送临界点干燥器干燥。然后用导电胶将支持物黏在扫描电镜专配的标本台（注意有细胞面朝上）。再放入真空喷镀仪先后喷镀碳膜与金或铂膜，标本制备即告完成。,培养物的观察检测方法,6.电子显微镜技术,6.3 其它电镜技术,6.3.2 冷冻蚀刻复型技术：,冷冻蚀刻复型技术（freeze etch replica）虽可用于显示细胞超微结构的立体影像，但最主要的价值在于显示细胞膜内部的结构，如构成缝隙连接和紧密连接的蛋白颗粒的分布状态、核孔等。,