第五部分光生物物理学ppt课件.ppt

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1、第六讲 光生物物理学,主要内容： 1）光生物学过程的特征; 2）生物分子水平的发光原初过程; 3）光对生物大分子的作用; 4）生物发光与化学发光作用,内容介绍,紫外光和可见光的特征:,1) 都属于电磁光谱，以光子为单位。2）光子的能量：E=h=h c/h, 普朗克常数= 6.62610-34 J s, 是频率， c是光速，波长,10nm200nm,200nm 380nm,380nm 780nm,780 nm 2.5 m,2.5 m 50 m,50 m 300 m,2、研究内容：,1）光的原初过程光化反应实际是包括两个步骤：第一是光量子的吸收，此过程是在光作用下直接产生的反应，叫做光反应。第二是

2、化学反应，它是光反应后的继发反应，所以叫暗反应 包括： 光吸收后的激发和激发态； 荧光和磷光的发射和衰减； 激发能的转栘； 光生电子的转移； 质子转栘； 自由基与单线态氧的形成以及瞬变产物的形成与转化等等,暗反应。,光反应,2）对光能转换过程的研究:光对机体的作用中，所有的过程都有感受光的生色团参与。这些生色团处在生物膜上，在光生物物理学中又叫光感受体，它们往往是色素与蛋白质的复合物。研究这些光感受体的结构与功能之间的关系，特别是瞬变产物的特点，是光能转换中的关键问题。,3、光生物学过程的特征（与辐射生物学的不同之处）：,1）辐射生物学是研究高能辐射，如x射线与射线等对机体的作用；而光生物学是

3、研究低能辐射(可见光、紫外光等）对机体的作用高能辐射因其能量大，与物质的相互作用会引起电离与激发，而主要是引起电离作用，从而启动一系列的原初与继发的复杂反应； 可见光、紫外光与物质的相互作用主要是引起激发，激发的分子由于比原来的分子有较高的能量所以不稳定，会发生一系列的弛豫过程，将多余能量以不同形式释放，分子本身又回到稳定的基态。这些激发分子的各种弛豫过程，就是光生物物理所要研究的一些基本的原初光反应及其规律。,2）光生物物理还有一特征，就是光对机体的照射，机体中必须有能吸收这些波长光的物质分子存在才能发生反应。这些能吸收相应可见光和紫外光波长的物质分子就叫做生色团(chromophore)。

4、生色团又叫光感受体，如光合作用中的叶绿素，植物光形态建成中的光敏色素，嗜盐菌的菌紫质，视觉过程中的视紫质等等。在高能辐射作用中，因为辐射能量大，只要撞击物质分子都会发生电离，无需机体中有特殊结构的物质分子来吸收。,传递途径,荧光,延迟荧光,磷光,辐射跃迁,无辐射跃迁,系间跨越,内转移,外转移,振动弛豫,S0,S1,T1,1、基态 一个分子在未吸收光能前所处的最低能量状态，叫基态。2、激发态 当吸收光能后分子就会使一个电子提高到高能量轨道，这种能量提高的状态叫做电子激发态，简称激发态。有最低的电子激发态叫第一激发态；有较高的电子激发态分别叫做第二、第三激发态等等。第二、第三激发态可将多余能量以热

5、能释放并降到第一激发态。,3、单线态 当吸收光子处于激发态时，虽然能量提高了，但电子自旋方向并没有改变，这时的激发态仍然是单线态。4、三重态 指分子中电子自旋量子数S=1，即原来两个配对的自旋方向相反的电子之一自旋方向改变，以至电子自旋之和不为0的情况。,驰豫过程：吸收光能后分子处于激发态，处于激发态的分子可以通过多种途径，将多余的能量释放，使分子又回到稳定的基态，这些释放多余能量的过程就是驰豫过程。,5、驰豫过程,内转换：当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，如第一激发单重态的较高能级与第二激发态单重态的某一较低能级位能相同会发生电子由高电子能级以无辐射跃迁的方式跃迁至低能级上，称为

6、内转换，转换速度10-1310-11 S（快）。,5、驰豫过程,系间跨越：指激发单重态与三重态之间的无辐射跃迁，原因：激发态电子自旋反转，造成多重复改变，可能单重态（S1）低振动能级与三重态T1的较高振动能量有重叠。,5、驰豫过程,外转换（猝灭）：激发分子与溶剂分子或其它溶液分子相互作用，发生能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失现象称为猝灭。,5、驰豫过程,荧光：处于电子激发态的分子回到基态时发射的光称为荧光。 磷光：某种物质被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发生波长比荧光波长更长的光，则称这种光为磷光。,5、驰豫过程,荧光：处于电子激发态的分子回到基态时发射的光。 磷光：某种物质被某种

7、波长的光照射以后能在较长的时间内发生波长比荧光波长更长的光。 荧光与磷光的产生过程：激发态基态的能量传递途径： 荧光：10-710-9 s，第一激发单重态的最低振动能级基态； 磷光：10-410s，第一激发三重态的最低振动能级基态；,磷光,磷光产生的机制与荧光是不同的，磷光是从某种能量低于第一电子激发态最低振动能级的另一种亚稳能级三重态向基态的各振动能级以辐射方式产生跃迁时发出的光。,所谓三重态或三线态，是指处于第一电子激发态最低振动能级的分子，可能通过无辐射跃迁消耗部分能量，其中一个电子的自旋方向倒转，使分子中原来两个配对的自旋方向相反的电子之一自旋方向改变，以至电子自旋之和不为0的情况。从

8、而处于三线态。,由于三线态能量低于第一电子激发态最低振动能级，因此磷光的波长比荧光长。,光是一种电磁波，具有一定的能量，波长越短，能量越高。,光谱红移：任一物质的荧光光谱及其峰位的波长总是比它的吸收光谱及峰位波长要长，这现象称为光谱红移。 镜像规则：通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。,1、荧光光谱,2、荧光光谱与吸收光谱,镜像规则 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似； 基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。,4、生物分子水平的发光原初过程（分子的激发和激发态及各种弛豫过程）,1）分子的基态和激发态基态

9、：一个分子在未吸收能量前是处于最低能量状态，叫基态（groud state）激发态：当吸收一定能量后，分子就会使一个电子提高到高能量轨道。这种能量提高的状态叫做电子激发态，简称激发态（excited state）。由于有不同的能量状态，可以分为第一激发态，第二激发态例如：在植物光合作用最初的光反应中就包含叶绿素分子对光能的吸收。吸收光能后分子处于激发状态处于激发态的分子可通过多种途径，将多余的能量释放使分子又回到稳定的基态，这些释放多余能量的过程就是弛豫过程(relaxation process), 它包括释放热能,发光以及进行能量转移与光化学反应等。,弛豫过程,每一种激发态内还具有不同的振动

10、能级与转动能级。由于转动能级能量变化化范围小通常不予考虑。 振动动能像电子能级一样愈高愈不稳定，往往要通过内转换释放热能降到较低的振动能级。在激发态分子的弛豫包括：1）释放热能(即内转换和系间交叉）2）可以释放光即辐射弛豫，这种光辐射就是荧光、磷光释放荧光的是最低激发态(即第一激发态）磷光，第一激发态-外力作用释放部分能量-间稳态（三重态）-发出磷光返回基态。,激发态与电子能级的关系,通常用分子轨道来描述分子的能级。当一个电子发生跃迁时，它会从一个分子轨道转移到另一个分子轨道。原子中参与成键的电子组成新的分子轨道，这种成键电子和整个分子相联系而不属于某一原子核。两个成键原子的原子轨道组成一个能

11、量较低的成键分子轨道和一能量较高的反键分子轨道。由电子对组成的共价键可以分成键或键。当原子轨道头与头重叠时，形成 键；平行重叠时，形成 键. 一个成键 轨道必定有一个相应的*反键轨道，一个成键的轨道必定有一个相应的*反键轨道。分子中没有参与成键的电子称为非键电子或n电子。,有机化合物分子吸收紫外-可见光后产生的两种最主要的电子跃迁类型为：(1) 成键轨道与反键轨道之间的跃迁。(2) 非键电子激发到反键轨道。,生物荧光的一些特性,叶绿素a与b的吸收与荧光光峰,荧光光谱是用适合的波长做为激发光照射样品，将得到的不同波长的荧光强度记录下来。,1）任何物质的荧光波长总比其吸收波长长；这是因为荧光是发自

12、于最低激发态的最低振动能级，而（吸光）激发往往使分子处于较高的激发态或较高的振动能级，它们总要通过内转换释放多余能量，所以发荧光的能量总比吸收的能量低，波长长。,2）吸收与荧光两个光谱是镜像对称的。 分子受激发从基态跃迁到激发态，只有一种跃迁即从基态的最低振动能级跃迁到激发态的最低振动能级，这时吸收与荧光的波长才是重合的。3）任一物质的荧光光谱不决定与激发光的波长但是荧光强度是与激发光波长有关的,非辐射共振能量转移,激发态将能量转移给与其相互作用的分子，回到基态，接受能量的受体分子则被激发，这种能量转移叫做非辐射共振能量转移（non-radiative resonance energy tra

13、nsfer）。不同于激发态分子与另一基态分子发生碰撞产生的能量转移；也不同于激发态分子释放光子、另一基态分子吸收光子而激发（重吸收）等形式的辐射能量转移。非辐射共振能量转移的产生原因：当两个分子具有相同的激发能量变化（或受体比供体激发能级稍低），达到一定的距离时，通过两个分子在空间产生的电磁相互作用，供体分子可以将其激发能转移给受体分子，即形成非辐射共振能量转移。,非辐射共振能量转移产生条件：,1）供体与受体的距离在50-100埃之间；2）供体的荧光必须与受体分子的吸收光谱要有重叠，重叠愈大转移效率愈高；3）供体必须是能发荧光的分子；,50埃是一般生物大分子的直径大小，也是生物膜的厚度大小，所

14、以在生物大分子和膜上可以进行能量转移,5、紫外光对生物大分子的作用,5.1 紫外光对生物大分子的物理作用主要是引起激发，继而引起一些其它反应，其作用大小决定于紫外光的波长与能量。 1）蛋白质的激发： 蛋白质发光决定于三种芳香氨基酸, 因为它们具有共扼结构易于激发. 芳香氨基酸的吸收与发光特征,蛋白质吸收280nm左右的紫外光，从而引起激发并发光核酸发光较弱。,蛋白质中的荧光生色团,5.2 紫外光对蛋白质与核酸的光化学作用1) 紫外光对蛋白质的化学作用:蛋白质的变性, 肽键的断裂, 氢键的断裂;蛋白质的氧化, 包括由氨基酸的氨基羰基化损伤;2)紫外光对核酸的化学作用:碱基的氧化损伤;DNA单链断

15、裂;DNA链间的交联等；嘧啶碱基比嘌呤碱基敏感,6、可见光的光敏化作用(光动力作用),1) 光敏化作用(photosensitization): 是指用可见光照射含有光敏化剂(sensitizer)的基质，在氧的参与下发生的光化学反应。它是通过光敏剂的三重态转移能量实现的.2) 光敏化剂的种类: 最有效的敏化剂是那些三重态寿命较长而量子效率又高的物质染料：亚甲基兰,玫瑰红,曙红等色素类: 如卟啉, 黄素等芳香碳氢化物: 如红烯以及一些蒽类化合物,3) 光敏化作用的类型光敏化剂吸收光能后,先激发到单线态, 通过系间交连形成三重态, 然后产生型反应和型反应:,sensitizer,吸收光能,1se

16、nsitizer,系间交连,3sensitizer,型反应,与基质作用, 产生氢原子或电子转移,自由基,型反应(是体外合成产生1O2的常用方法),将能量转移给O2, 产生单线态氧(1O2),与其它基质作用,单线态,三重态,4) 光敏化作用的生物学效应: 分子水平来讲，受作用的基质是蛋白质与核酸这些大分子。在细胞成分中生物膜是首当其冲的光敏化作用基质, 单线态氧等活性氧主要是破坏膜脂，使脂肪酸氧化从而使膜变得脆弱。过氧化物诱发的氧化作用则造成整个膜的破坏。对光敏化作用敏感的蛋白质是含有巯基的氨基酸(如半胱氨酸)与芳香氨基酸。核酸对光最敏感的组分是鸟嘌呤5) 光敏化作用（光敏化自动氧化作用）的治疗

17、作用新型光敏化剂的发现, 如卟啉衍生物等.,光动力作用的治疗机制 因特异亲和作用潴留于癌细胞里的血卟啉（HPD），在吸收光能后发生如下的变化过程：HPD吸收光子后被激发到三重态 3（HPD），再将能量转移给原来处于三重态基态氧分子3O2，使之激发成活泼的单态氧1O2。这种单态氧是瞬时存在的强氧化剂，它可与其所亲和的癌细胞的基质A结合，使之强烈氧化为AOX（AOX :Adsorbable organohalogens, a group of halogenated organic substances that are able to adsorb onto activated carbon ）

18、，癌细胞因此遭破坏，而达到治疗癌症的目的。光敏反应过程为HPDhv3（HPD）3（HPD）3O21O2HPD1O2AAOX3O2单态氧是在光敏化反应中能量转移过程的由三重激发态血卟啉衍生物所促成，而单态氧是使肿瘤细胞灭活的物质，在上述的一系列反应中，癌细胞膜的反应居于首要地位。,7、光合作用,光合作用是光能转化为化学能的一个典型的光能转换过程。叶绿素是执行光合作用的光感受体.光合作用的原初光反应包括: 叶绿素吸收光能，激发能的传递以及在反应中心产生电荷分离,这以后则是暗反应或一系列的生化反应,8、植物光形态建成,概念：植物光形态建成是指与光合作用无关的，由光信号对植物的生长、发育与分化的调控过

19、程。 植物光形态建成有几个主要特性： 植物在形状和结构上的变化需要的能量是来自于代谢，而不来自于光信号。所以这种光信号实际上是一种触发机制。 光合作用需要大量的光子，以化学能形式把日光能贮存起来。光形态建成正好相反，只需要很少的光量子就能完成其作用这就说明光信号在植物体内，需要一系列的放大作用，最后才能表现为形态上的变化和产物的积累。 光形态建成可根据对光谱的反应分几种不同类型。如叶片扩展是对红光的反应；有些真菌中诱导色素形成是对蓝光和近紫外光的反应。 光形态建成的光信号往往要与体内的一些因素相互作用，从而影响反应大小。,8.1 植物的光敏色素,Flint等人研究了光对莴苣种子发芽的作用， 发

20、现当种子放在黑暗中很少会萌发， 但是给一些光照， 萌发就进行得很快。 进一步研究发现，发现红光（波长650680nm）促进种子发芽，而远红光（波长710740nm）逆转这个过程，对发芽有显著的抑制作用。,Borthwick等提出接收光的色素是一种具有两种不同形式的色素，即在红光区（660nm）具有最大吸收的 Pr，在远红光（730nm）区具有最大吸收的Pfr。两者是可以相互转换的。将感光的物质提取并纯化。这种物质是一种色素蛋白，称为植物光敏色素(phytochrome)，又叫植物色素或简称光敏色索。,植物光敏色素的发色团（辅基）,某些有机化合物分子中存在含有不饱和键的基团，能够在紫外及可见光区

21、域内（200800nm）产生吸收，且吸收系数较大，这种吸收具有波长选择性，吸收某种波长（颜色）的光，而不吸收另外波长（颜色）的光，从而使物质显现颜色，所以称为生色团，又称发色团(chromophore)。,8.2 光敏色素的感受机制,Song等人提出的模型： Pr与Pfr发色团具有相似的构像； Pr比Pfr与蛋白质结合得更牢固，后者更加暴露和易变； Pfr的蛋白表面是疏水性，易与疏水受体相互作用。,X 是Pfr的受体,细菌光敏色素（Bacteriophytochrome）的研究进展,Domain structure of various phytochrome sequences. Br Bp

22、hP, from Bradyrhizobium ORS278; RpBphP, from Rps. palustris; Cph1, from Synechocystis PCC6803; Dr BphP, from D. radiodurans; Ppr, from R. centenum; and At phyB, phytochrome B from Arabidopsis thaliana. CBD, chromophore binding domain; PAS, Per/Arnt/Sim repeats; PYP, photoactive yellow protein domain

23、. （引自NATURE，2002，417 ：202-205）,Proposed scheme for the function of BphPs in light perception. Active BphP cross phosphorylates the conserved histidine in the dimer and then transfers this phosphate to an aspartate residue (D) on an response regulator RR1. The RR1 then transfers the phosphate to a co

24、nserved histidine on a HPT(histidine phosphotransferase), which donates the phosphate to a RR2. RR2 is fused to a DNA-binding domain (DBD) and serves as a transcription factor to affect gene expression. （引自CELL & DEVELOPMENTAL BIOLOGY,2000，11: 511521）,Crystal structure of RpBphP3-CBD. (a) Domain str

25、ucture of the full-length Bph RpBphP3. (b) Ribbon diagram of the two RpBphP3-CBD molecules in the asymmetric unit. The PAS domain is in yellow, and the GAF domain is in green. (c) Superposition of the crystal structures of RpBphP3-CBD (in yellow and green) and DrBphP-CBD (in light blue). （引自PNAS, 20

26、07,104: 1257112576）,9、菌紫质的光能转换,嗜盐菌是一种非常嗜盐的盐生杆菌，有鞭毛。嗜盐面的质膜是红色的，在其上有紫色的斑块，故叫紫膜在这些紫膜的斑块上含有唯一的一种蛋白质复合物，就是菌紫质(bacteriorhodopsin, BR)菌紫质行使的是与光合作用相同的功能，即将光能转化为化学能, 通过质子泵造成的质子梯度与膜电位一起构成的电化学电位，由它提供能量将光能转化成化学能ATP.,10、 生物发光与化学发光,生物发光是光生物学中与其它由光作用产生的生物效应相反的过程，它是由代谢反应形成的发光。它是生物体系将化学能有效地转化为光的过程生物发光是化学发光的一种特殊情况。近年

27、来，生物发光与化学发光已经广泛地应用于研究和实践。如萤光素酶在报告基因标记的应用； 发光细菌在环境污染方面的应用；,生物发光的进化意义：,生物发光起源的本身是和进化联系在一起，生命起源的原始地球上大气是处于还原状态含有许多甲烷及其他碳氢化合物等，那时大气中的氧只有现在的千分之一，而且主要是靠近紫外光光解水而产生；生物要维持其生命，必须要依靠氧化一些易氧化的物质获取能量，但是也可以利用含氧的活性基团，如OH来氧化不易氧化的碳氢化合物，在这个过程中有些反应就可产生生物学上的化学发光；另一种看法认为生物发光的起源是由于氧对厌氧生物的毒害；此外，在进化过程中需要有较高光效率的生物发光，例如，细菌（群体

28、感应）与腔肠动物的发光就是如此，它们可利用高度发荧光的受体分子，有效地敏化它的化学发光。,生物发光的生理意义：,生物发光具有重要的生理功能上的意义 例如，萤火虫的闪光就是一种吸引异性的信号，这种发光信号是有精细结构的，它相当于密码，代表不同的种，雄性发光约2秒钟后雌虫就有反映。曾经将发光与不发光的鞭毛虫及其捕食者放在一起选择适宜的实验条件观察，结果是发光的那一种存活的较多，这说明闪光可以逃避被捕食。,10.1 生物发光（Bioluminescence）的分类：,1）按发光的强弱：生物体的强发光, 发光强度可达1010 光子/cm2 S;超微弱(化学)发光（ultraweak chemilumi

29、nescence）,发光强度10 3 104 光子/cm2 S.,2) 按反应是否需要酶的催化：酶促反应发光，如萤光素-萤光素酶体系；还原黄素单核苷酸（FMNH2）的酶促氧化体系。非酶促反应发光，生物大分子氧化引起的发光；,10.2 酶促反应生物发光,(1) 生物发光（bioluminescence）典型例子为萤火虫发光。是酶促的化学发光。酶的主要作用是加速化学反应。在萤火虫尾部发光细胞中存在着荧光素酶 (luciferase, E-LH)，反应底物为萤火虫荧光素（luciferin, LH ）。,荧光素酶酶促反应结果使 ATP(三磷酸腺苷) 与 E-LH 先偶联，偶联的高能中间产物 LH2-

30、AMP 在氧气存在时会生成激发态的氧化荧光素（oxyluciferin), 回复到基态时可释放出能量，并以荧光的形式发射出来。萤火虫正是借助于 ATP 提供的能量发出荧光的，这种荧光是萤火虫求偶的信号。,荧光分光光度术中的参量,5、荧光探剂,生物化学中主要的可分为两类。,荧光分光光度术中的参量,5、荧光探剂,荧光物质：通常都具有环状共轭双键（）,天然生物分子：的只有芳香族氨基酸、核黄素、维生素A、叶绿素和NADH等少数分子。,蛋白质：只有含苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸时才具有荧光特性。,核酸：除碱基外也不发荧光。,脂质（脂组成的膜系统）：无荧光特性。,荧光分光光度术中的参量,5、荧光探剂,天然荧光

31、生色团结构特点,碳原子骨架,分子具有共轭双键体系，大多含有芳香环或杂环,任何有利于提高电子共轭度的结构改变，都将提高荧光效率。如：对苯基化，间苯基化等。,荧光分光光度术中的参量,5、荧光探剂,天然荧光生色团结构特点,分子的几何排布,具有刚性平面结构,5、荧光探剂,天然荧光生色团结构特点,取代基的类型,加强荧光的基团：给电子取代基，如，-NH2、 -NHR、 -OH、-OR、 -CN、-OCH3、-OC2H5,减弱荧光的基团：得电子取代基，如，-CO2H、-COOH、-C=O、-NO2、-NO、-SH、-F、-Cl、-Br、-I,影响不明显的基团：-R、-SO3H、-NH3,5、荧光探剂,天然荧

32、光生色团结构特点,取代基的位置,邻位、对位荧光增强,间位荧光减弱（-CN基例外）,绿色荧光蛋白（GFP）,Johnson等早先报导多管水母整体发光以及提取的颗粒发光都有绿色发光，后来在粗提液中发现有绿色荧光蛋白(简称GFP)，这种蛋白发光在510nm有一肩峰。蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用 .多管水母与海三叶蔓的GFP已经提纯，其氨基酸序列也已搞清楚。,GFP之所以能够发光,是因在其包含238个氨基酸的序列中，第65至67个氨基酸(丝氨酸酪氨酸甘氨酸)残基,可自发地形成一种荧光

33、发色团。 当蛋白质链折叠时，这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段，得以“亲密接触”,导致经环化形成咪唑酮，并发生脱水反应。但此时还不能发射荧光，只有当有分子氧存在的条件下，发生氧化脱氢，方能导致绿色荧光蛋白发色团的“成熟”，形成可发射荧光的形式。,三位科学家分享2008年诺贝尔化学奖(发现和研究绿色荧光蛋白方面做出贡献 ),马丁沙尔菲 下村修 钱永健 Martin Chalfie Osamu Shimomura Roger Y. Tsien Columbia University Boston University UC San Diego,现在有蓝色荧光蛋白（EBFP, EBFP2, Azur

34、ite, mKalama1）、青色荧光蛋白（ECFP, Cerulean, CyPet）和黄色荧光蛋白（YFP, Citrine, Venus, Ypet）。蓝色荧光蛋白除mKalama1外，都包含Y66H替换。青色荧光蛋白则主要包含Y66W替换。YFP衍生物是由T203Y突变实现的。,(2) 酶促生物发光的应用荧光素酶发光的应用技术:将荧光素酶基因连接于启动子下游，稳定整合到细胞染色体内，使荧光素酶得到持续表达。在体内，荧光素酶在ATP、氧气存在的条件下，与外源注入的特异底物反应产生发光现象。因此仅在活细胞内才会出现荧光，且荧光强度与标记细胞数目线性相关。,应用范围: 基因、细胞和活体动物都

35、可被荧光素酶基因标记。将荧光素酶的基因插到预期观察的细胞的染色体内，通过筛选, 培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。将标记好的细胞注入小鼠体内后, 观测前需要注射荧光素酶的底物荧光素。荧光素脂溶性非常好, 很容易透过血脑屏障。注射一次荧光素能保持小鼠体内荧光素酶标记的细胞发光30-45分钟。这是肉眼无法观察到的，应用一个高度灵敏的制冷CCD相机及特别设计的成像暗箱和成像软件，可观测并记录到这些光子。,（1）标记细胞i. 癌症与抗癌药物研究 直接快速地测量各种癌症模型中肿瘤的生长和转移，并可对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估.ii. 免疫学与干细胞研究将荧光素酶标记的造血干细胞移植入脾及骨

36、髓，可用于实时观测活体动物体内干细胞造血过程的早期事件及动力学变化。 iii. 细胞凋亡 (2) 标记病毒i. 病毒侵染以荧光素酶基因标记的HSV-1病毒为例，可观察到HSV-1病毒对肝脏、肺、脾及淋巴结的侵和病毒从血液系统进入神经系统的过程。ii. 基因治疗 基因治疗包括在体内将一个或多个感兴趣的基因及其产物安全而有效的传递到靶细胞。观察目的基因是否能够在试验动物体内持续高效和组织特异性表达。荧光素酶基因也可以插入脂质体包裹的DNA分子中, 用来观察脂质体为载体的DNA运输和基因治疗情况。,（3）标记细菌利用细菌荧光素酶基因可以分别标记革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。 常用的几十种细菌都已被标记

37、, 用来进行细菌侵染和抗生素药物的研究。 i. 细菌侵染研究: 可以用标记好的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌侵染活体动物, 观测其在动物体内的繁殖部位、数量变化及对外界因素的反应。目前已有多种全细胞生物传感器用来进行环境监测。它们可以检测多种普通的胁迫条件，有毒物质，氧化剂，金属和组织寄生物 ii. 抗生素药物:利用标记好的细菌在动物体内对药物的反应，进行药物筛选和临床前动物实验研究。,（4）基因表达和蛋白质相互作用i. 组织特异性基因表达： renilla荧光素酶和firefly荧光素酶分别识别不同的底物, 一种细胞可被这两种荧光素酶标记: renilla 荧光素酶基因由一组成性稳定表达的启动子

38、驱动, 作为内参，反应细胞数量的变化; firefly荧光素酶基因由要研究组织特异性启动子驱动。这样firefly荧光素酶发光信号的变化，在消除细胞数量变化的影响后就可反应特定的启动子在动物体内的表达活性。ii. 蛋白质相互作用： 观察细胞中或活体动物体内两种蛋白质的相互作用，是将荧光素酶基因分成两段，应用此原理亦可用于研究细胞信号传导途径。,Using a single-molecule method, we directly distinguish among oligomers from monomers to tetramers and determine their quaterna

39、ry structures. Using this method, we found that RecR forms a stable dimer and its oligomeric form is modulated by its own concentration and the interaction with RecO.,C. Kim et al., Chem. Commun., 2012,48, 1138-1140,（5）转基因动物模型i. 基因表达将荧光素酶基因插入目的基因启动子的下游，并稳定整合于实验动物染色体中，形成转基因动物模型。ii. 各种疾病模型研究者根据研究目的，将靶

40、基因、靶细胞、病毒及细菌进行荧光素酶标记，同时转入动物体内形成所需的疾病模型，包括肿瘤、免疫系统疾病、感染疾病等等。可提供靶基因在体内的实时表达和对候选药物的准确反应，还可以用来评估候选药物和其它化合物的毒性。为药物在疾病中的作用机制及效用提供研究方法。,技术研究进展:,发光分析信号的高度可侦测性使得它非常适合于微小化的生物分析装置（如微矩阵，微流设备和高密度的微孔板）以用于小量样品体积的基因和蛋白的高通量筛选。 这些发展方便了体外和体内持续检测生物过程, 可应用于临床、诊断、和药物开发等。,新的生物发光报告基因报告基因技术代表了分子生物学最近主要的进展之一。报告基因是一段DNA序列，编码一个

41、很容易被侦测到的蛋白或酶。它们可以人工引入到一个细胞内来监测基因的表达，以得到整体细胞生物传感器或细胞定位的作用。目前，细菌荧光素酶基因（如陆上的Photorhabdus luminescens和海洋中Vibrio harveyi细菌的lux基因），真核的来自于萤火虫和海参Renilla reniformis的luc和ruc基因是广泛应用的报告基因。此外，一些新的基因cDNAs也已克隆和表达。如能够发射红光和绿光的Phrixothrix hirtus荧光素酶，各种突变的发不同波长光的萤火虫荧光素酶。,活细胞的共振能量转移（RET，resonance energy transfer）技术,利用这

42、种方法可以非侵入性地监测特异蛋白质蛋白质之间的相互作用。在一个发光或荧光供体和一个荧光受体之间会发生能量转移。Renilla的荧光素酶（Rluc）在有底物腔肠素的存在下能够发出蓝光（480nm），能够转移能量到黄色荧光蛋白(EYFP), 随之后者发出530nm的绿光。这两个蛋白的相互作用可以通过Rluc融合蛋白和EYFP融合蛋白两者的相互关系来进行评估。它们间的能量转移只有在Rluc和EYFP的两个融合蛋白接近到足够近（100 A）的距离时才能发生。BRET的信号可以通过比较EYFP发出的绿光和Rluc发出的蓝光的量来进行测量。,生物发光共振能量转移,Renilla luciferase em

43、its blue light at 480 nm upon addition of its substrate co-elenterazine.,Activation of receptor (conformation change, attachment of G-protein) due to binding of ligand.,-arrestin / eYFP fusion protein attaches to receptor enabling energy transfer between Renilla luciferase and the eYFP moiety result

44、ing in a rising peak of green light at about 530 nm.,10.3 超微弱化学发光 化学发光（chemiluminescence）：在常温下由化学反应产生的光的发射。化学发光是多步骤的过程，其机制为某些化合物（发光剂或发光底物）可以利用一个化学反应产生的能量(吸收化学能)使其产物分子或反应中间态分子上升至激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量（即发光). 任何一个化学发光反应都包括两个关键步骤: 即化学激发和发光。因此，一个化学反应要成为发光反应，必须满足两个条件：第一：反应必须提供足够的能量， 第二，这些化学能必

45、须能被某种物质分子吸收而产生激发态。到目前为止，所研究的化学发光反应大多为氧化还原反应，包括活性氧的形成反应.,生物体的超微弱化学发光,特征：从细菌到高等生物活体都有超微弱化学发光, 波长范围180-800nm, 强度较低: 10-104 光子/cm2 S, 与许多生物过程联系, 如氧化代谢、细胞分裂等。在所有生物发光反应中都应包括分子氧，过氧化物甚至超过氧化物的氧化。 氧化还原反应，释放超氧阴离子自由基、H2O2、Fe2+， 进行自由基反应，如岐化反应， 脂质过氧化反应等， 同时产生化学发光。产生部位：线粒体， 肝细胞， 叶绿体，微粒体 等； 吞噬细胞在吞噬作用中的化学发光（呼吸爆发）； 呼

46、吸爆发:中性粒细胞吞噬异物或受刺激活化时,短时间内耗氧量显著增加,同时产生大量氧自由基, 是发挥杀菌作用重要机制之一. 细胞培养过程中的有丝分裂；,化学发光反应中的激发态1）二氧丁环，在裂解时羰基形成激发态；2）电子转移反应系统，阴离子自由基和阳离子自由基扩散发生电子的转移，使受体分子处于激发态。3）辣根过氧化物氧化酶（HRP）与异丁醛底物产生的丙酮三重态。,化学发光技术的应用:,1）活性氧自由基的检测；2）各种DNA杂交诊断技术，例如，通过与地高辛-地高辛抗体标记结合的基因探针杂交检测越来越多的应用到DNA检测中；CL 现在已经越来越多的在蛋白分析的western杂交中使用。例如球蛋白（显性

47、）印迹检测。 克隆和纯化的重组辣根过氧化物酶（HRP）成为一个新的生物技术工具，实际上，高效的HRP的底物已经商业化。HRP是与CL检测组合应用最广泛的酶之一。,化学发光免疫测定,化学发光反应参与的免疫测定分为二种类型。第一种是以发光剂作为酶免疫测定的底物，通过发光反应增强测定的敏感性；第二种是以发光剂作为抗体或抗原的标记物，直接通过发光反应检测标本中抗原或抗体的含量。 化学发光酶免疫测定（chemiluminescentenzymeimmunoasssay，CLEIA）属酶免疫测定。酶反应所用底物为发光剂，通过化学发光反应发出的光在特定的仪器上进行测定。两种常用的标记酶，辣根过氧化物酶（HR

48、P）和碱性磷酸酶（AP）均有其发光底物，由此建立的CLEIA均在临床检验中应用。,相比同位素检测，CL检测以其更加灵敏和可检测性获得越来越多的应用。依赖于碱性磷酸酯酶（AP）的CL检测和依赖于辣根过氧化物酶的增强性CL检测是最常用的形式。,化学发光标记免疫测定化学发光标记免疫测定亦称化学发光免疫测定（chemiluminescentimmunoassay，CLIA），是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定方法。用作标记的化学发光剂应符合以下几个条件：能参与化学发光反应；与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物试剂；偶联后仍保留高的量子效应和反应动力；应不改变或极少改变被标记物的理化特性，特

49、别是免疫活性。鲁米诺类和吖啶酯类发光剂等均是常用的标记发光剂。,10.4 生物发光和化学发光技术的应用前景,生物发光和化学发光检测已经被证明是一种有效的、多功能的生物学分析工具，适用于多种应用。包括：报告基因技术，基因探针检测。BL/CL技术还可以与目前高通量分析仪器的小型化，生物分析等趋势相吻合。新的BL报告基因的发现、克隆和测序，进而推动多重标记系统的研究。可同时检测不同发光探针的彩色CCD等技术在检测仪器上的应用，BL/CL应用技术将得到进一步发展。BL/CL技术同样也有一些缺陷。从实践的观点来看，BL/CL技术与传统的分光光度测定和荧光技术相比，更容易受基质的影响。BL/CL检测中的化学反应会被基质中的成分影响（通常是淬灭）。此外，酶或发光蛋白也和CL底物一样，相对荧光分子不稳定。,Thanks！Email：,