第六章酶工程制药ppt课件.ppt
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1、复习,1、简述多抗、单抗制备的主要程序?,2、简答鼠源抗体在免疫导向中存在的缺陷?,3、基因工程抗体、抗体组合文库的概念?,作业:1、酶和细胞的固定化? 2、酶在医药领域的应用?,第六章 酶工程制药,教学重点: 掌握固定化技术、酶的修饰、酶工程在制药工业的应用;了解酶特点及分离纯化。教学难点: 酶反应器 课时:6学时,主要内容,第一节 概述第二节 酶的分离纯化第三节 酶和细胞的固定化第四节 固定化酶和固定化细胞的反应器第五章 固定化酶产品介绍(自学),概述,一、酶工程简介二、酶的基础知识三、现代酶工程的主要内容四、酶的来源和生产五、酶在医药领域的应用,第一节 概述,一、酶工程简介 酶工程是酶学
2、和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能,并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。,酶工程的名称出现在20世纪20年代,主要指自然酶制剂在工业上的规模应用。1953年,德国人提出了酶固定化技术 。1969年,日本人用固定化技术拆分了DL-氨基酸。1971年,第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容:酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用。,二 、酶的基础知识,(一)酶是生物催化剂酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。催化高效性专一性:结构专一性;立体异构专一性酶具有不稳定性,8,(二)酶的化
3、学本质蛋白质,9,必需基团:这些基团若经化学修饰使其改变,则酶的活性丧失。,活性部位:酶分子中直接与底物结合,并和酶催化作用直接有关的部位。,必需基团,活性部位,维持酶的空间结构,结合基团,催化基团,专一性,催化性质,三、现代酶工程的主要内容:,1.酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发;2.酶和细胞的固定化及酶反应器的研究,包括酶传感器、反应检测;3.酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究;4.酶的分子改造和化学修饰,结构与功能的研究;,5.有机相中酶反应的研究;6.酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究;7.抗体酶、核酸酶的研究;8.模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。,1
4、2,四、酶的来源和生产,(一)酶的来源 酶的生产目前多数直接从生物体中提取分离。非常少的是合成,基因工程。早期酶的生产:以动植物为主要原料,如激肽释放酶(胰脏)、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶。近10年来,研究发展了动植物组织培养技术,但周期长、成本高。工业生产一般都以微生物为主要来源。,13,微生物生产酶的特点,1.微生物种类繁多,凡是动植物体内存在的酶,几乎都年从微生物中得到;2.微生物繁殖快、生产周期短、培养简便,并可通过控制培养条件来提高酶的产量;3.微生物具有较强的适应性,通过各种遗传变异的手段,能培育出新的高产菌株。,14,(二)酶的生产菌,1、对菌种的要求: (1)产酶量高、酶的性质符合
5、要求、最好是胞外酶;(2)不是致病菌;(3)稳定,不易产生变异退化,不易感染噬菌体;(4)能利用廉价的原料,发酵周期短,易于培养。,15,2、生产菌的来源:1)菌种保藏机构和有关研究部门,但大量的工作应是从自然界中分离筛选菌样采集、菌种分离初筛、纯化、复筛和生产性能鉴定等。2)改良(如基因突变、基因转移和基因克隆)。,16,3、目前常用的产酶微生物,E.coli:是应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶,经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、-半乳糖苷酶枯草杆菌:主要用于生产-淀粉酶、-葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。,17,啤酒酵母:用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包
6、等;曲酶(黑曲酶和黄曲酶):主要生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶。其他产酶菌:青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉菌等。,18,五、酶在医药领域的应用,1.在疾病诊断方面的应用由于酶具有专一性强、催化效率高、作用条件温和等催化特点,酶学诊断已经发展成为可靠、简便又快捷的诊断方法,具有广阔的应用前景。酶学诊断方法:1)是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病,2)利用酶来测定体内某些物质的含量,从而诊断某些疾病。,19,根据体内酶活力的变化诊断疾病:一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在某一范围的。当人们患上某些疾病时,则由于组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引起体内
7、的某种或某些酶的活力发生相应的变化。故此,可以根据体内某些酶的活力变化情况,而诊断出某些疾病。,胰腺癌:胰蛋白酶、胰型同工酶等升高肝炎:转氨酶升高,20,用酶测定体液中某些物质的变化诊断疾病:人体在出现某些疾病时,由于代谢异常或者某些组织器官受到损伤,就会引起体内某些物质的量或者存在部位发生变化。通过测定体液中某些物质的变化,可以快速、准确地对疾病进行诊断。酶具有专一性强、催化效率高等特点,可以利用酶来测定体液中某些物质的含量变化,从而诊断某些疾病。,21,2.在疾病治疗方面的应用-酶类制剂 酶可以作为药物治疗多种疾病,用于治疗疾病的酶称为药用酶。,药用酶具有疗效显著,副作用小的特点,在疾病的
8、治疗方面的应用越来越广泛。,溶菌酶:抗菌消炎和镇痛,22,1)消化类: 研究最早,是品种最多的一类酶.在这一类酶中主要有胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木瓜酶、凝乳酶、无花果酶、菠萝酶等。,健美生消化酶帮助肠胃蠕动,23,2)抗炎净创类:目前在治疗上发展最快,用途最广的一种。多数是蛋白质水解酶,分解发炎部位纤维蛋白的凝结物,消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。其中有些酶能够分解脓液中的核蛋白使成简单的嘌呤和嘧啶,降低脓液的粘性、达到净洁创口、消除痴皮、排除脓液抗炎消肿的目的。主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶,-淀粉酶、胰脱氧核糖核酸酶等。,24,3)血凝和解凝类:都是从血液中提取出来的。凝血酶的
9、作用:促使血中纤维蛋白原变成不溶性纤维蛋白,从而促使血液凝固,防止微血管出血。例如:蛇毒抗凝酶、促凝血酶原激酶。纤维蛋白溶解酶的作用:是溶解血块,为目前临床上最新的一种酶制品,治疗血栓静脉炎、冠状动脉栓塞等。例如:东菱克栓酶抑肽酶作为肽酶抑制剂:广泛应用于体外循环手术,大剂量抑肽酶可明显减少心脏外科手术后的渗血,消除因心脏外科手术后渗血而导致的死亡。,25,4)解毒类:主要作用是解除体内或因注射某种药物产生的一种有害物质。主要品种有青霉素酶、过氧化氢酶和组织胺酶等。青霉素酶能够分解青霉素分子(青霉噻唑)中的一内酰胺环,使变成青霉素铜酸,消除因注射青霉素引起的过敏反应。,26,5)抗肿瘤的药用酶
10、:L-天冬氨酸酶是第一种用于治疗白血病的酶;癌细胞缺乏天冬氨酸合成酶,自身生长时不能合成天冬氨酸, L-天冬氨酸酶可以切断外来的天冬氨酸供给。,27,3.在药物生产方面的应用利用酶的催化作用将前体物质转变为药物。这方面的应用日益增多。现已有不少药物包括一些贵重药物都是由酶法生产的。4.在分析检测方面的应用酶法检测或酶法分析如:ELISA,免疫组织化学,Western blot中的HRP,28,1、细胞破碎2、酶的提取3、酶的分离方法4、酶的组合分离纯化策略5、酶的浓缩、干燥与结晶,第二节 酶的分离纯化,一、酶的分离纯化技术路线,细胞破碎,酶提取,酶分离纯化,酶浓缩,酶贮存,动物、植物或微生物细
11、胞,发酵液,离心分离,过滤分离,沉淀分离,层析分离,电泳分离,萃取分离,结晶分离等。,30,二、酶的提取,(一) 细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶,首先需要对细胞进行破碎处理。1)机械破碎2)物理破碎3)化学破碎4)酶解破碎,JY92-II D超声波细胞粉碎机,细胞破碎珠,高压细胞破碎机,DY89-I型 电动玻璃匀浆机,31,1.采用缓冲体系:防PH大幅度变化而失活2.添加保护剂:防活性基团活性中心受影响3.抑制水解酶的作用:加酶抑制剂4.其他保护措施:温度,PH,搅拌,光照,氧化等影响,为了保护目的酶的生物活性,常采取下列保护措施:,32,(二)酶的抽提,将酶从生物组织或细胞破
12、碎液以溶解状态最大限度释放出来的过程。,33,(三)沉淀分离,粗提物:经细胞破碎和抽提后,得到的含目的酶的无细胞抽提物。,34,(四)、酶的纯化,过滤与膜分离电泳离子交换层析,35,第三节 酶和细胞的固定化,一、固定化酶的制备1、固定化酶的定义:指限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理,使酶变成不易随水流失即运动受到限制,而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定化所采用的酶,可以是纯化的酶,也可以是结合在菌体(死细胞)或细胞碎片上的酶或酶系。,36,2、固定化酶的特点,(1)可以多次使用,酶的稳定性提高;(2)反应后,酶与底物和产物易于分开,产物
13、中无残留酶,易于纯化。(3)反应条件易于控制,可实现转化反应的连续化和自动控制;(4)酶的利用率高,单位酶催化的底物量增加,用酶量少;(5)比水溶性酶更适合于多酶反应。,酶和细胞的固定化方法,热处理(细胞),载体结合法,交联法,包埋法,网格型,微囊型,3.酶的固定化方法与技术,38,39,(1)载体结合法:将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。A.物理吸附法:用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。活性碳,多孔玻璃,树脂等优点:操作简单,可选用不同电荷和不同形状的载体,有可能固定化和纯化过程同时实现,酶失活后载体仍可再用。缺点:最适吸附酶量无规律可循,吸附量与酶活力不一定呈平行关系,酶与载
14、体结合力不强,酶易于脱落,导致酶活下降并污染产物。,40,B、离子结合法:酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。DEAE-纤维素等优点:操作简单,处理条件温和,酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏。缺点:载体和酶的结合力弱,易受缓冲液种类或pH的影响,离子强度高时,酶易脱落。,41,C、共价结合法:酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。优点:酶与载体结合牢固,稳定性好,不易脱落。缺点:反应条件苛刻,操作复杂,反应条件剧烈,酶易失活和产生空间位阻效应。,42,(2)交联法:用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方
15、法。交联法交联酶法酶与辅助蛋白交联法吸附交联法载体交联法常用的交联剂:戊二醛、双重氮联苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。,43,酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子;(a)酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶;(b)酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶,44,(3)包埋法:,A、网格型:将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶,多用于固定化细胞。,45,B、微囊型:将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百
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