第二章基因定位和遗传作图ppt课件.ppt

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1、1,第二章,基因定位和遗传作图,2,概述,细胞做图：利用三点测验法计算交换率或重组率，并以此作为基因间连锁关系和相对距离绘制连锁图，常以mu为单位染色体定位：利用同线法、缺失法、单体法、三体法把基因定位到特定的染色体上。细胞水平上的基因图又称细胞遗传图区域定位：利用染色体步行、FISH和基因克隆等方法从细胞遗传学水平，将基因定位到染色体的具体区带。分子定位：利用分子标记、DNA芯片技术，将基因确切定位在DNA上的具体位置上。,3,第一节 顺反子学说,一、重组试验和连锁图 1. 噬菌体突变型噬菌体T4的突变型r和野生型r+ 在不同菌株上的表现 噬菌体T4 E.coli B株 E.coli K（）

2、株 r +（大而清晰的噬菌斑） r+ +（小而模糊的噬菌斑） +（小而模糊的噬菌斑） 2. 噬菌体突变型间的杂交 图 3. 连锁图 r47 r104 r101 r106 | r51 r102 | 1.3 1.0 1.6 | 1.9 1.6 A区 | B区,4,第一节 顺反子学说,二、互补试验和顺反子学说1.顺反位置效应和互补试验（1）同一顺反子中的突变位点（等位） 基因型 表型 是否互补 m1 m2 | 顺式 + + 野生型 | m1 + | 反式 + m2 突变型 无 | （2）不同顺反子中的突变位点（非等位） 基因型 表型 是否互补 m2 m3 | 顺式 + + 野生型 | m2 + |

3、反式 + m3 野生型 + | 2. 顺反子学说内容（cistron、muton、recon） 例,5,第一节 顺反子学说,三、基因内互补intragenic complementation1 .概念和机理机制：可能是由于两个突变基因所产生的失活产物结合，成为具有活性的蛋白质。如果将两个有关纯合体的抽提物混合时看到互补现象，叫离体互补或体外互补。,6,第一节 顺反子学说,2 基因内互补与基因间互补的区别,7,第二节 遗传作图和染色体定位,一、有性杂交重组定位 (三点测交法) 例题二、细菌基因定位 例题1. 中断杂交作图2. 基因重组作图3. 转化基因定位4. 转导基因定位5. 性导基因定位三、

4、体细胞杂交定位物种间体细胞杂交杂种细胞各种clone 同线法基因定位四、 缺失定位1. 单体定位法2. 染色体缺失定位法图,8,第三节 染色体区域定位,一、染色体步行(chromosome walk) 法 1. 概念2. 类型：反向PCR、锅柄PCR、不对称PCR、SON PCR二、荧光原位杂交法 （florescence in situ hybridization，FISH）1. 概念优点：可用来作基因或特定DNA片段的染色体区域定位。缺点：必须在已知探针的情况下方可进行2.原位杂交的步骤 图三、基因克隆1. 功能克隆(functional cloning)2. 定位克隆(positiona

5、l cloning)：也叫图位克隆(Map-based cloning),第四节 分子标记,分子标记的类型：（1） 基于杂交的分子标记：RFLP标记，小卫星DNA标记（SSR）（2）基于PCR的分子标记：单引物PCR标记，如RAPD、ISSR标记；双引物PCR标记，如AFLP标记；双引物特异PCR标记，如SSR标记（3） 其他一些新型分子标记：如SNP标记、STS标记、EST标记 分子标记的优点（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各发育时期均可检测。（2）数量极高，遍及整个基因组。（3）多态性高，等位基因变异随处可见。（4）表现为“中性”，即不影响目标性状的表达。分子标记的意义,

6、10,第四节 分子标记,一、RFLP限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism）：1. 优点：RFLP是发展最早（Bosterin等1980）的分子标记技术。 无表型效应；一般表现为共显性；具有种族特异性，它对分析一个分离群体中来源不同的染色体片段具有重要价值；标记范围遍及全基因组；在不同的物种之间具有通用性。2. 缺点：操作复杂、成本高、费时等。二、RAPD随机扩增多态性DNA技术 （Random amplified polymorphic DNA)优点：（Willians1990） 能反映整个基因组的变化； 不需DNA探针，无需合

7、成特定序列引物； 高效灵活，可在短期内获得大量的多态性DNA片段，亲缘关系非常近的个体也能识别； 操作简单易行，不需要接触放射性物质，简便、快速、费用低、分子识别率高、对环境污染小等。缺陷：重复性和稳定性较差,11,第四节 分子标记,三、AFLP扩增片段长度多态性（Amplified fragment length plymorphism）优点：（ Zabeau和Vos，1992），(1) 可标记的数目是无限的； (2) 多数具有共显性；(3) DNA用量少，而且对模板浓度的变化不敏感；(4)扩增片段较短，分辨率高；(5)利用特定引物扩增，退火温度高，可靠性高。 缺陷：操作技术复杂，需要酶切、

8、连接等步骤。四、SSR标记 SSR，简单重复序列 （ Simple sequence repeat）又叫微卫星标记。应用：多态性分析和新基因的发现、定位与作图。特点：(1) 数量丰富，覆盖整个基因组；(2) 呈现多基因特点，信息含量高，表现为共显性遗传；(3) 可采用PCR技术进行检测，且重复性好；(4) 对DNA数量及纯度要求不高，即使是部分降解的样品也可；(5) 标记带型简单，条带一致、客观、明确。,12,第四节 分子标记,五、 SNP SNP（single nucleotide polymorphism单核苷酸多态性）优点：(1) SNP分布广泛，多态性丰富；(2) 易于实现自动化分析；

9、(3) 具有稳定的遗传特性。 (4) SNP基因座的片段更短，更适合PCR扩增；(5) 易于对复杂性状进行关联分析。SNP标记可与DNA芯片技术结合：将不同的寡核苷酸固定在芯片上，标记待测DNA，一次就可检测很多SNP标记。六、STS序列标签位点 （Sequence-tagged site，M.Olson，1989)1. 类型：（1）特异DNA序列；（2）无序的DNA片段：未知片段序列标签2. 特点：产生的信息十分可靠。对基因的研究、新基因的克隆以及基因图谱向物理图谱的转化研究具有重要意义。,13,第四节 分子标记,七、SCAR（Sequence-character amplified reg

10、ions，特异序列扩增区域标记）是在RAPD的基础上发展起来的。优点：可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来。八、ISSRISSR （inter-simple sequence repeat,简单序列重复区间扩增多态性）：是对SSR的发展，由Zietkiewicz等(1994)创建优点：稳定性好、所需DNA样品量少，技术简单，多态性高。可用于遗传多样性分析、遗传作图、品种鉴定、基因定位及分子标记辅助育种等研究。九、基因与氨基酸同源序列比对图（蛋白质分子标记）,14,第五节 DNA芯片技术,一、概述1. 基本概念 DNA芯片（DNA Chip Technology） 、DNA微阵列（DNA

11、microarray）、寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）。生物芯片包括：DNA芯片、蛋白质芯片2. DNA芯片的主要类型（1） 根据探针的来源分原位合成芯片：采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡核苷酸而制备的芯片。探针较短DNA微集阵列：将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。探针的来源较灵活（2）根据探针的大小分 Oligo-Chip 8 n or 20 n expressioncDNA-Chip 50,000 n genomic analysis,15,第五节 DNA芯片技术,二、DNA芯片技术的基本步骤1. 芯片制备（1）支

12、持物的预处理：支持物(硅芯片、玻片或瓷片)预处理，使其表面衍生出羟基、氨基活性基团。（2）DNA芯片阵列的制备：将制备的基因探针（已克隆的基因片段PCR或人工合成的DNA片段）、打印（喷墨打印或针式打印） 2. 准备样品:分离纯化cDNA , mRNA扩增标记(荧光、生物素、放射性标记） 3.分子杂交样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交(30min) 4. 检测分析软件进行进行图象分析和数据处理,16,第五节 DNA芯片技术,三、DNA芯片技术的应用1. DNA测序2. 基因表达分析3. 基因组研究：作图、测序、基因鉴定、基因功能分析4. 基因诊断：寻找和检测与疾病相关的基因四、基因芯片技术的

13、优点1. 规模大2. 高度平行性3. 快速高效4. 高灵敏度5. 高度自动化,17,顺反子的测定,用T4噬菌体一个特殊基因区的不同突变株研究互补作用，获得下列资料，请判断，本区应有几个顺反子？各包括哪些突变型？ 1 2 3 4 5 6 ,18,顺反子的测定,E.coli 的8个用T4突变株都不能在没有组氨酸的培养基上生长(his-),两两进行重组测验，发现所有的顺式杂合体都能在基本培养基上生长。而反式杂合体中，有的能在基本培养基上生长(+)，有的则不能(0)，如下表所示，确定这8个突变位点分属于几个不同的顺反子？突变体 7 88 0 0 0 0 0 0 + 07 + + + + + + 06

14、0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 04 0 0 0 03 0 0 02 0 01 0,19,顺反子的测定,假如上题的8个突变体测试产生了下列结果，结论是什么？反式杂合体在基本培养基上的生长情况突变体 1 7 88 + + + + + + 0 07 + + + + + + 06 + + + + 0 0 5 + + + + 04 + + 0 03 + + 02 0 01 0,例题,普通生物的基因定位ABC42 abc42 Abc8 aBC8 ABc92 abC92 AbC358 aBc358 1000细菌基因定位某杂交：Hfr ABC strs F abc strr 经检测后代的基因型和

15、菌落数分别是：ABC ABc AbC Abc aBC aBc abC 总计 800 30 80 40 10 40 40 1040,21,体细胞杂交定位,根据不同杂种细胞保留或丢失的人染色体的情况，进行基因定位,22,缺失作图,AJ系是顺反子Y的一系列缺失。突变品系110同AJ分别进行杂交，得到下列结果（+和0表示后代能否产生野生型）。指出顺反子Y中从左到右的突变品系110的顺序。 | 顺反子Y | 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 | A | A 0 0 0 0 0 + 0 0 + 0 | G | B + 0 0 + + + 0 0 + 0 | B | C + 0 0 + + + 0

16、+ + 0 | H | D + + 0 + + + 0 + + + | C | E 0 0 + 0 + + + 0 + 0 | I | F + + 0 + + + + + + + | D | G 0 + + + 0 0 + + 0 + | E | H 0 + + 0 0 0 + 0 0 0 | F | | J | I + + + + 0 0 + + 0 + J + + + + + + + + 0 +3 7 2 10 8 4 1 5 6 9,23,FISH步骤,制备中期染色体 在载玻片上DNA原位变性 杂交（在载玻片上，将放射性标记探针与之杂交） 复性 洗膜 放射自显影 检测、结合染色体形态进行基因定位,