第七章层析技术ppt课件.ppt

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1、,第 五 章,层析技术,生物化学与分子生物学教研室徐宏伟,层析法也称色谱法(chromatography)，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”。 1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提出了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展奠定了基础。,层析法最基本的特征是有一个固定相和一个流动相，当两相作相对运动时，由于混合物中各组分在物理化学性质 (如吸附力、溶解度、分子的形状与大小、分子的电荷性及亲和力等)上的差别，使各组分在两相间进行反复多次

2、的分配而得到分离。,层析类别 主要依据的理化性质 此类的层析方法举例吸附层析 吸附力 磷酸钙凝胶层析 分配层析 分配系数 各种薄层层析、纸上层析离子交换层析 分子的电荷性、极性 DEAE-纤维素柱层析凝胶过滤层析 分子大小 交联葡聚糖柱层析 亲和层析 亲和分子间的亲和力,层析技术可按两相的状态不同进行分类，如以气体为流动相的叫做气相层析（gas chromatography），以液体为流动相的叫做液相层析（liquid chromatography）。由于固定相也有液体和固体的不同，故气相层析还可细分为气液和气固层析两种，同理，液相层析即可细分为液液和液固层析两种。,根据流动相的形式： 液相层

3、析、气相层析,层析基本操作过程,上样均一性 洗脱装置,目的不同 检测方法不同活性检测,基质均匀性柱层析的L/d比值,4、层析装置的仪器化,HPLC,与微机、质谱等连用,层析前蛋白质处理,主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。,第一节 凝胶过滤层析技术,又称凝胶排阻层析或分子筛方法 利用某些化学惰性的多孔网状结构的物质(多为凝胶)为填料，使混合物中的各种物质按其分子大小不同得到分离。,优点：凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，温度范围广，不需要有机溶剂

4、，分离效果好缺点：样品被不断稀释，上样量不能太大，否则分辨率变差,一、凝胶过滤层析的基本原理,多孔性亲水性凝胶 一是随洗脱液垂直向下移动二是无定向的扩散运动。凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。,凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，小分子可以进入凝胶网孔，而大分子则排阻于颗粒之外。,大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，

5、先被洗出层析柱小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱,目 录,分配系数(kd),Ve为某一被分离成分被洗脱时所用洗脱液的体积，称为洗脱体积；Vo为凝胶颗粒间自由空间的总容积，称为空白体积或外水体积；Vi为凝胶颗粒内部孔穴的总容积，称为内水体积或进人体积。,体积参数,分子在柱中移动的速度取决于该分子在固定相和流动相间的分配系数Kd，Kd表示某一分子在特定的凝胶柱内的洗脱行为。Kd(Ve一Vo)Vi,Ve=Vo 该成分的分子全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中， 因而洗脱速度最快。即该成分的Kd0。ViVe-Vo 该成分不被排阻而可完成进入凝胶颗粒内部

6、, 因而洗脱速度最慢。即该成分的Kd=l。Kd值介于0-l之间，物质的洗脱速度随其Kd值的 增加而降低一般物质的Kd值是0Kd l。,洗脱行为可以有三种可能的情况:,Kd具有以下意义：,（1）对于完全被排阻的极端大分子，由于VeVo，因此KdO（2）对于能自由扩散凝胶颗粒内部的小分子物质，VeVoVi，Kd1（3）对于能部分扩散入凝胶颗粒内部的大分子物质，Kd在0 1之间（4）凡Kd1的物质，表明它们能被凝胶吸附或具有离子交换作用，而不仅仅是分子筛效应（5）Kd值越接近1，表明分子越小，洗脱越慢；相反，Kd值越接近0，表明分子越大，洗脱越快。,柱床体积 (Vt) 为凝胶基架的总体积 (Vr)

7、与内水体积 (Vi) 及外水体积 (Vo) 之和。,实验室常用VtVo代替Vi来计算分配系数，所得值称为平均分配系数，用Kav表示，其定义为,对于某一特定的凝胶柱，Kav与kd之比是1个常数，它不随溶质的性质或浓度而改变，因此可代替kd来度量被分离物的洗脱行为。,影响分离效果的因素,流速加样体积样品浓度离子强度,二、常用凝胶的种类和性质,立体多孔网状结构，惰性 对pH和温度的稳定性 能反复使用 颗粒大小比较均匀 葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶及琼脂糖凝胶。,凝胶过滤层析的介质,葡聚糖系列琼脂糖系列聚丙烯酰胺系列 多孔硅胶,基本操作,凝胶的选择 凝胶柱的制备 上样洗脱凝胶柱的重复使用与保存,三、凝胶

8、过滤层析的实验技术,(一) 凝胶的选择与处理 根据被分离物质分子的大小、形状和分离目的进行选择 1.分离分子量相差悬殊的两种物质，如蛋白质脱盐2.纯化蛋白质时，则需要根据各组分的分子量分布范围及各种凝胶的分离范围选用合适的凝胶,粗粒 ，中粒 ：分离效果差，但流速快 ，可用于工业上物质的制备 细粒 ：洗脱曲线峰形对称、峡窄、分离度好 超细颗粒 ：能给予最好分离，但流速慢，实验时间长,(二) 层析柱的选择 柱子要直，内径均一；下端死区小 柱的有效长度越大，洗脱峰之间的距离则越宽，分辨率越高。 过细的柱子，会因管壁效应而影响分离效果,柱层析的L/d比值,2、凝胶柱的制备,用于分组分离 短而粗 L/D

9、值10 用于分级分离 L/D值比较大 对很难分离的组分一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在15cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。,柱L/D值的选择,装柱前，凝胶基质用蒸馏水或洗脱液中充分溶胀。凝胶柱填装后通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱，以检测凝胶柱的均匀程度。,(三)洗脱剂的选择 能完全溶解欲分离的样品而且对样品的稳定无影响；且不影响对样品的监测，并能很快去除。 洗脱剂的离子强度至少0.2mol/ L,(四)装柱 层析柱垂直 ，气泡排除 ，一次倾入层析柱 洗脱平衡 凝胶柱应均匀、无断层、无气泡 (五)上样 样品应预先离心 ，

10、均匀地加样,(六)洗脱 注意控制流速 降低流速通常能提高分辨率 流速过慢，则纵向扩散和对流反会限制分辨率的提高 流出液用人工或自动部分收集器定量地分部收集 (七)保存 加防腐剂或灭菌后，可置冰箱中保存数月,四、凝胶过滤层析的应用,1、主要用于大分子物质：如蛋白质、核酸、多糖等的分离2、脱盐 ，放射性同位素，荧光素3、蛋白质的分子量的测定 离心柱层析法 ：分子克隆,3、测定高分子物质的分子量,洗脱液中蛋白质浓度,4、高分子溶液的浓缩,5、蛋白质复性研究,五、注意事项,(一) 柱床支持物使用不当 (二) 凝胶膨胀过程中操作不当 (三) 凝胶柱、毛细管和流出口处有气泡 (四) 工作压过高 (五) 层

11、析柱的保洁差,第二节 离子交换层析技术,离子交换层析(ion-exchange chromatography) 是根据物质所带电荷的差别进行分离纯化的一种方法,一、离子交换层析的基本原理,离子交换剂是以纤维素或葡聚糖凝胶等不溶性物质为母体 引入阳性或阴性离子基团的特殊制剂 带有阳离子基团的交换剂，可置换吸附带负电荷的物质，称为阴离子交换剂 带阴离子基团的交换剂，则可置换吸附带正电荷的物质，称为阳离子交换剂,蛋白质分子是两性物质 不同的蛋白质有不同的等电点，与不同类型离子交换剂以不同的亲和力相互交换吸附。当缓冲液中的离子基团与结合在交换剂上的蛋白质相竞争时亲和力小的蛋白质分子首先被解吸而洗脱亲和

12、力大的蛋白质则后被解吸与洗脱因此，依靠增加缓冲液的离子强度和/或改变酸碱度，可改变蛋白质的吸附状况，使不同亲和力的蛋白质得以分离。,目 录,离子交换剂的基质,琼脂糖离子交换剂,离子交换交联葡聚糖,聚苯乙烯,离子交换纤维素,二、常用离子交换剂的种类及其性质,1、离子交换纤维素树脂 以纤维素为母体，结合一定的离子基团而成。 离子交换纤维素上的交换基团排列疏散，对蛋白质等大分子的吸附不太牢固，用温和的条件便可将其洗脱下来，因此不会引起大分子变性，是分离蛋白质、核酸、抗生素等不太稳定的生化物质的理想介质。,常用：DEAE-纤维素（二乙基氨基纤维素） CM-纤维素（羧甲基纤维素）,开放性长链和松散的网状

13、结构，有较大的表面积，大分子可自由通过，使它的实际交换容量要比离子交换树脂大的多。亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢，用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的，因此不致引起生物大分子物质的变性和失活。 回收率高,优点：,2、离子交换葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶为母体，结合一定的离子基团而成交换容量大，一般为离子交换纤维素的3-5倍 由于其是网状结构，因而其不仅具有离子交换能力，还同时兼有分子筛的作用。,基本操作,三、离子交换层析的实验技术,（一）离子交换剂的选择与处理有阴阳离子之分外，还有强弱之分 应根据被分离物质的物理化学性质，即根据其所带电荷的种类、数量及所处的环境，尤其是环境中是否有其它

14、离子，这些离子的电性、数量等因素进行选择。,对吸附性强的离子或不稳定的物质，常选用弱酸性或弱碱性离子交换树脂，这样易于洗脱和再生，也不易破坏被分离物质对于吸附性弱的离子，常选用强酸性或强碱性离子交换树脂，这样可利用碱性或酸性条件增强被吸附物的离子化作用。,分离蛋白质时若在高于其等电点的pH条件下不发生变性，则可选用阴离子交换剂；若在低于其等电点的pH条件下，不发生变性，则可选用阳离子交换剂；如果某蛋白质在高于或低于其等电点1个pH单位的条件下都很稳定，则选用两种离子交换剂中的任何一种均可达到分离目的。,2、离子交换剂的处理,酸碱浸泡 进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子，一般阳离子

15、交换剂最后用碱NaOH处理，阴离子交换剂最后用酸HCl处理。,膨化将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的配基充分暴露出来。,水悬浮去除杂质和细小颗粒,(二) 装柱 一般以直径与长度之比为1：15为宜 当样品量多且组分复杂时，可选用稍长的柱子 用起始缓冲液充分滴注洗脱，至流出液与进柱前溶液有相同的pH 应注意离子交换树脂在柱中均匀分布 (三) 加样 加样前，样品应预先对起始缓冲液充分透析平衡,(四) 洗脱 增加缓冲液离子强度 改变pH 同时改变离子强度与pH,洗脱的方式 一步洗脱法 分段洗脱法 梯度洗脱法：用浓度(或pH)连续改变的洗脱液进行洗脱。,洗脱速度,洗脱速度

16、通常要保持恒定洗脱速度慢比快的分辨率好如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。,洗脱液的监测收集及组分鉴定,监测 用紫外检测仪进行，在280nm处观察洗脱液的光吸收收集 用分布收集器收集，可以自动收集，也可以手动收集鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳、测定活性等,离子交换剂的清洗、再生和保存,可溶于碱的污染物 0.1 mol/L NaOH洗涤 Milli-Q纯化的蒸馏水洗涤 结合缓冲液洗涤 可以除去诸如脂类、蛋白质和核酸这类的污染物。对于疏水性污染物 乙醇溶液（如70%的乙醇）或非离子型的去污剂洗涤 可以除去

17、脂类和其他的疏水性物质。,金属污染物 EDTA饱和的10 mmol/L HCL（即pH=2）处理柱子沉淀物杂质 去污剂、尿素和盐酸胍，可将柱子在6 mol/L 的尿素中平衡和温育，然后用去离子水和缓冲液洗涤。,再生 对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。 酸碱交替浸泡保存 处理洗净蛋白等杂质后，加入适当的防腐剂，一般加入0.02 %的叠氮钠，4C下保存。,第三节 亲和层析技术,亲和层析(affinity chromatography)是利用生物分子间的亲和吸附和解吸而设计的层析方法，即通过固定于水不溶性的固相支持物(载体)上的互补物(配体)的特异性，可逆性的吸附而使物质分离。该

18、层析条件温和，过程简单，纯化的倍数高，,对分离含量低又不甚稳定的生物活性物质极为有效 专门的吸附剂，并寻找一种专门的层析条件方能进行工作。,一、亲和层析的基本原理,生物大分子具有和某些相对应的专一分子(一般为结构上与其相应的分子)相结合的特性 这种结合既是特异性的，又是可逆性的；改变条件又能使这种结合解除 生物分子间的这种结合能力，称为亲和力,酶的活性部位和底物、抑制剂、辅助因子酶的变构中心与变构因子(或称效应物)之间抗原与抗体之间激素与受体之间核糖核酸与其互补脱氧核糖核酸之间,亲和力 生物分子间存在很多特异性的相互作用，如抗原抗体、酶底物或抑制剂、激素受体等，它们之间都能够专一而可逆的结合。

19、分离原理 通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。,二、亲和层析的实验技术,载体活化、配体偶联、样品吸附、解吸分离 (一)载体的种类与选择 必须有高亲水性，使生物大分子容易与它接近它的非特异性吸附要十分小它必须具有大量可供活化而能与配体结合的基团,纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃等纤维素：有比较强的非特异性吸附作用葡聚糖凝胶网孔孔径较小，通透性差，应用最广的是琼脂糖凝胶制品。,珠状琼脂糖凝胶(Sepharose 2B、4B和6B) 溴化氰(CNBr)活化 适于偶联各种含游离-NH2的配体珠状琼脂糖凝

20、胶亲水性强，理化性质稳定，具有疏松的网状结构,在亲和层析中，常用小分子物质作为配体亲和吸附与其相配的大分子物质。 在载体与配体之间引入一“手臂”(间臂)，配体就得以伸人溶液，从而可大大提高吸附效率。间臂的长度要恰当，太短效果不显著，太长易造成弯曲折叠，反而减小吸附能力,(二)配体的选择,好的配体是亲和层析的基础 1、配体必须有对所纯化物质的特异性和可逆性的亲和作用亲和力太弱，不足以用于亲和层析有效地纯化所需要的物质亲和力太强，要想使被结合物不失活而被洗脱，则可能很困难 2配体必须具有在活性部位以外的化学上可修饰的基团：通过这些基团，配体可与载体偶联，而不破坏其与亲和分子结合的活性。,(三)载体

21、活化与配体偶联 充分膨胀与洗涤后 ，在搅拌下滴加溴化氢 pH保持在11 ，偶联反应在pH810范围最有效回旋偶联2小时，或4偶联过夜 封闭载体上未被配体偶联的所有活性位点,配体与待分离的物质有适当的亲和力与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性与载体稳定的共价结合自身应具有较好的稳定性,配体的分类,特异性配体 只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体 eg. 抗原和抗体、酶和它的抑制剂 通用性配体 特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体 eg. 凝集素可以结合各种糖蛋白,蛋白质亲和层析中的合适配体,基本操作,选择适当的配体将配体固定化到基质上将目的蛋白混合液加样到基

22、质上除去非特异性结合的蛋白质洗脱纯的目的蛋白,上样,层析柱较短，通常10cm 左右样品液的浓度不宜过高上样时流速比较慢样品缓冲液中有一定的的离子强度上样时选择适当较低的温度,(四)层析 为使样品吸附完全，亲和层析可反复上样 当被分离的混合液通过亲和层析柱时，相应的分子与配体发生特异性亲和反应而被吸附，其它杂质则流出柱外。然后，需要用适当的洗脱缓冲液将被吸附的物质解吸下来。 1. 专一性洗脱 ：用于亲和结合力相对弱的物质 ，洗脱剂是通过竞争性的与配体结合而将被分离物解吸洗脱下来的,2非专一性洗脱： (1) pH变化 ：用pH梯度洗脱比用单一pH洗脱更为有效 （2）离子强度变化 ：NaC1是最常用

23、于增加离子强度的试剂 (3)改变洗脱液的极性 (4)变形洗脱剂 在洗脱后必须立即除去变性剂，以避免其长时间的变性作用而使生物分子失活,(五)纯化产物脱盐 (六)亲和吸附剂的再生与贮存 三、注意事项1溴化氰活化Sepharose 4B的反应，最适pH是112应绝对避免使用电磁搅拌，以免引起载体珠形结构的破坏 3应采取适当低的流速4用极性pH进行洗脱时，为防止极性pH对生物分子活性的影响，每收集一管洗出液，即进行pH调整，使接近中性。5. 对于结合弱的物质，可以待样品进入胶柱后，关封出口，让样品在柱中停留一段时间（甚至过夜），使其能被充分结合,专一性洗脱,优点： 特异性强，可以进一步消除非特异性吸

24、附的影响，从而得到较高的分辨率。 可避免蛋白质变性缺点： 较常的时间、较大的洗脱条件。改善方法： 选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度,专一性洗脱,非专一性洗脱,与配体亲和力较小 连续大体积平衡缓冲液冲洗，不影响活性，但洗脱体积较大，待分离物质浓度较低。配体结合较强时 适当的pH、离子强度洗脱，注意尽量不影响待分离物质的活性与配体结合非常牢固时 使用较强的酸、碱或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂，使蛋白质等待分离物质变性，洗脱后再复性,(五)纯化产物脱盐,洗脱所得的亲和层析产物常含有盐类等小分子物质，可经SephadexG-25柱层析除去。用变性剂洗脱时，为保护生物活性，洗脱后应将被纯化的物质立

25、即转移到温和的条件，或立即进行透析，以除去变性剂等。,(六)亲和吸附剂的再生与贮存,通常亲和层析后，经10个柱床体积的含0.5mol/L NaCl的pH8.5的0.1mol/L Tris-HCL缓冲液和10个柱床体积的含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L、 pH4.5的醋酸钠缓冲液洗涤后即获再生，用起始缓冲液平衡后即可再用。暂时不用的冻干的亲和产物应该贮在8以下或冰冻；但是，已经溶胀的亲和产物不能冰冻，而应加上防腐剂后贮于8以下。,第四节 吸附层析技术,吸附层析：（adsorption chromatography) 是以吸附剂为固定相，使混合物随流动相流经固定相时，按其吸附力的大小

26、而得到分离的技术；物质的这种物理吸附作用，能量比较低，洗脱比较容易，吸附剂比较容易获得,一、吸附层析的基本原理,在表面上聚集的现象称为被吸附 (adsorption)凡能够将其它物质聚集到其表面的物质称为吸附剂 而被聚集到吸附剂表面的物质就称为被吸附物一种吸附剂不仅对不同的物质具有不同的吸附力，而且在不同的条件下，对同一种物质的吸附作用也不相同。在相同条件下，吸附过程和解吸（附）过程是同时进行的，即是可逆的。,各种待分离的分子在不断解吸、吸附，再解吸，再吸附的过程中下移，它们移动的速度与吸附剂对该分子的吸附力的强弱及洗脱剂对该分子的溶解能力有关。,二、吸附层析实验技术,(一) 吸附剂的选择及处

27、理 氧化铝、活性炭、硅胶、硅酸盐、磷酸 具有最大的表面积和吸附能力对待分离的各种物质有不同的吸附力，,(二) 装柱与上样 ：脱气处理 (三)洗脱剂与洗脱 ：不起化学反应 ，对样品的溶解度大而又易从样品中除去；粘度小流动性好 羟基磷灰石柱层析在分离单链与双链DNA中的应用,羟基磷灰石柱层析在分离单链与双链DNA中的应用,多聚核苷酸骨架上的磷酸基团可与羟基磷灰石中的Ca2+相互作用，而使核酸与羟基磷灰石结合。结合的核酸在高温 (60) 条件下，可被磷酸缓冲液洗脱。单链核酸与羟基磷灰石的结合不如双链核酸，易被较低浓度的磷酸缓冲液洗脱，因而可以用羟基磷灰石柱层析于单链DNA与双链DNA或与DNA：RNA杂交链的分离。,