抗体工程制药ppt课件.ppt

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1、抗体工程制药,2,抗体工程药物的概念,又称抗体药物、单克隆抗体治疗剂、抗体治疗剂。 通过细胞工程或基因工程方法制备，用于治疗的单克隆抗体、抗体片段、基因工程改造的抗体，以及抗体免疫偶联物或抗体融合蛋白,称为抗体工程药物。,3,美国FDA已批准的治疗抗体药物,OrthocloneReoProRituxanZenapaxSimulectSynagisRemicadeHerceptinMylotargCampath-1HZevalin,移植排斥心绞痛B细胞非霍奇金淋巴瘤移植排斥移植排斥婴儿呼吸道合胞病毒类风湿关节炎乳腺癌急性复发性髓性白血病难治性慢性淋巴细胞白血病难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤,1986

2、1994199719971998199819981998200020012002,4,抗体药物的重要地位,。,恶性肿瘤严重威胁人们的生命健康，是导致人类死亡的重要因素。全球每年有700万人死于肿瘤，且逐年增长。 传统的肿瘤临床治疗有三种：手术、放疗和化疗。近几年里，以单克隆抗体为基础的抗肿瘤导向治疗药物开发领域发生了突飞猛进的进展。单克隆抗体药物能特异识别肿瘤细胞，能有效提高药物杀伤力、减少毒副作用。 1997年以来，FDA已经批准10种单克隆抗体药物，占有市场所有生物技术药品的四分之一。一年的综合销售超过10亿美金。,5,随着生物技术的发展，单克隆抗体在疾病治疗方面的作用越来越受到人们的重视

3、。在同种异体免疫排斥、自身免疫反应抑制、抗血小板治疗、癌症治疗、感染性疾病治疗等方面应用最为广泛。目前全球从事人源化单克隆抗体开发的企业260家左右，研究中的产品达700多个，其中进入临床阶段的约100个，估计占研制中的生物技术药物的25%。据美国制药工业协会的调查报告显示，单克隆抗体药物居所有医药生物技术产品之首。,6,2000年底，在美国药品市场上生物技术药物有76种，其中抗体药物有15种；正处于临床研究阶段的369种生物技术药物中，抗体药物有70种。 中国已有2个治疗性单抗产品获准生产，3个治疗性产品处在临床试验阶段，多个抗体药物处于临床前研究阶段，已批准的诊断性单抗有31个。,7,抗体

4、分子的应用,抗体分子是生物学和医学领域用途最为广泛的蛋白分子。以肿瘤特异性抗原或肿瘤相关性抗原、抗体独特型决定簇、细胞因子及其受体、激素及一些癌基因产物等均作为靶分子，利用传统的免疫方法或通过细胞工程、基因工程等技术制备的多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体广泛应用在疾病诊断、治疗及科学研究等领域。完整鼠源抗体容易引起机体排异反应，而基因工程抗体由于分子量小，通过改造可以降低鼠源性，所以是生物技术制药领域研究的重点和热点。,8,目前正在进行开发和已经投入市场的抗体性药物主要有以下几种用途：1器官移植排斥反应的逆转；2肿瘤免疫诊断；3肿瘤免疫显像；4肿瘤导向治疗；5哮喘、牛皮癣、类风湿性关节炎、

5、红斑狼疮、急性心梗、脓毒症、多发性硬化症及其他自身免疫性疾病；6抗独特型抗体作为分子瘤苗治疗肿瘤；7多功能抗体（双特异抗体、三特异抗体、抗体细胞因子融合蛋白、抗体酶等）的特殊用途。,9,根据美国药物研究和生产者协会（ P hRMA）的调查报告，癌症是威胁人类健康的主要疾病之一，预防和治疗癌症是研究和开发抗体药物的主要目标之一。最初抗体主要被用于肿瘤体外免疫诊断和体内免疫显像，随着抗体工程技术的不断进步，近年来人们将更多的目光集中在治疗肿瘤的抗体药物开发上。第一个被美国批准用于人肿瘤治疗的基因工程抗体Rituxan（r）最初被用于非何杰金氏淋巴瘤，总有效率达60，现在正在探索用于治疗艾滋病相关淋

6、巴瘤和中枢神经系统淋巴瘤。,10,目前在临床中使用的肿瘤治疗药物多数存在“敌我不分”的问题，即在杀死肿瘤细胞的同时，也破坏了人体正常细胞。“生物导弹”为解决这个难题提供了一个理想的思路。“生物导弹”，即将各种毒素、放射性同位素、化疗药物与识别肿瘤特异抗原或偶联肿瘤相关的抗原后，能够特异杀伤肿瘤细胞的一类药物。这种药物经由静脉注入人体内，药效分子集中作用于肿瘤细胞，既增强疗效又减少对机体的毒副作用。放射性同位素与抗体的偶联物在体内能将前者运至药靶部位，并通过其放射性活性杀伤靶细胞，还可通过 X射线照相机拍摄核素放射线图像，用于体内治疗和定位诊断。,11,抗体与化疗药物分子的偶联方法一般采用化学法

7、。 这些偶联物对结肠癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤、肾癌、卵巢癌、宫颈癌、乳癌、肺癌、骨肉瘤等有一定的抗癌效应。抗体与生物毒素交联制备的偶联物称为免疫毒素。免疫毒素抗体部分对相应抗原有特异识别作用，及免疫毒素部分具有对细胞毒作用，对肿瘤细胞具有杀伤效应，是很有潜力的免疫治疗方法。,12,抗肿瘤血管生成抗体治疗肿瘤的研究最近也取得了很大的进展。在动物模型中用抗血管生成因子、抗体封闭血管内皮生长因子取得了抑制肿瘤生长作用；抗癌基因产物抗体Herceptin（r）作为生物技术药品已经在美国上市，配合化疗用于乳腺癌和卵巢癌的治疗，并获得较好疗效。,13,1单克隆抗体（McAb）抗体作为免疫治疗的生物制剂，在

8、临床应用已有一个世纪。以前抗体主要来自于经抗原免疫的异种动物（如马）的血清。淋巴细胞杂交瘤技术，可以大量制备针对任何抗原决定基的单克隆抗体。,14,抗T细胞及其亚类的抗CD3、抗CD4、抗CD8单克隆抗体，它们在移植排斥及某些自身免疫病的应用中，已取得了明显的疗效。抗各种细胞表面分子的单克隆抗体，如抗IL-2受体的单克隆抗体，抗粘附分子的单克隆抗体都有明显的免疫调节作用，在自身免疫病的治疗，防止肿瘤转移等方面都有重要的使用潜力。,15,单克隆抗体的另一重要应用是肿瘤诊断及分型。在过去10多年来，抗各种人肿瘤相关抗原的单克隆抗体得到了广泛的研究。针对各种人肿瘤细胞的单克隆抗体都能较特异地识别肿瘤

9、细胞，而基本上不与正常组织起反应。抗肿瘤单克隆抗体在肿瘤的诊断及分型方面是一种有用的工具；但在肿瘤的治疗上，由于大多抗肿瘤单克隆抗体不能直接杀伤肿瘤细胞，所以单独应用肿瘤没有明显效果。,16,2导向药物（targeteddrug）利用抗肿瘤单克隆抗体特异识别肿瘤细胞的特点，将它作为导向载体与各种杀伤分子，如毒素、抗癌药物、放射性核素等，进行化学交联，可以构建成一种对肿瘤细胞具有高度特异的强杀伤活性的杂交分子，称为导向药物。,17,抗肿瘤单抗与毒素的交联物又称免疫毒素(IT)。用于制备IT的毒素主要有：植物毒蛋白这类毒素主要有篦麻毒素（ricin）、相思子毒素（abrin）以及苦瓜毒素（morm

10、ordin）、商陆抗病毒蛋白（PAP）、天花粉蛋白等。它们都可以通过灭活核糖体，阻断蛋白质合成，杀伤靶细胞。,18,细胞毒素主要有白喉外毒素（DT），绿脓杆菌外毒素（PE）等。它们主要通过抑制延长因子-2阻断蛋白质合成，杀死靶细胞。上述这些毒素都具有极强的毒性，1个分子的篦麻毒素进入细胞，就足以杀死该细胞,19,抗肿瘤单克隆抗体与抗癌药物的交联物，又称免疫交联物(immunoconjugate)。用以制备这类导向药物的抗癌药物主要有阿霉素（adriamycin）、氨甲蝶呤（MTX）等。它们主要通过阻断DNA合成来杀死靶细胞。抗癌药物杀细胞作用比毒素低得多，增加抗体分子携带的药物分子数，可以增强

11、其杀伤活性，但常会导致抗体活性的下降与丧失。这类导向药物的优点是分子较小，同时如有非特异杀伤不会有严重后果。缺点：杀伤力不高，临床应用前景不被看好。,20,、放射性免疫交联物可用于肿瘤的诊断。 与肿瘤细胞结合的放射性免疫交联物放出的射线，可以用照像机摄像，获得清晰的肿瘤显像。此技术称为放射免疫显像。、放射性免疫交联物也可用于肿瘤治疗。 标记了大量高能核素的抗肿瘤单克隆抗体与肿瘤细胞结合后，可以通过辐射损伤杀死靶细胞及其周围的肿瘤细胞。此技术又称为放射免疫治疗。用于与抗肿瘤单克隆抗体交联的放射性核素主要有125、131、111In等。,21,（四）肿瘤疫苗肿瘤疫苗与传统疫苗在概念上不同，它主要不

12、是用于肿瘤的预防，而是通过瘤苗的接种来刺激机体对肿瘤的免疫应答来治疗肿瘤。由于人肿瘤相关抗原的免疫原性很弱，不足以有效地刺激机体的免疫应答，因此单纯用自身或同种肿瘤细胞作瘤苗治疗肿瘤的效果不好。用肿瘤细胞卡介苗等佐剂联合应用，能提高免疫应答效果，在一些晚期肿瘤患者取得了一定的治疗效果。,22,肿瘤疫苗主要有二类：第一类对肿瘤抗原表位性质的研究，导致了肿瘤分子疫苗的产生。具有肿瘤抗原决定基的肽疫苗和多糖疫苗已在研制，有的已在临床试用。第二类，确定了抗肿瘤免疫应答的主要效应细胞是TC细胞，导致了基因转染的肿瘤细胞疫苗的出现。,23,TC细胞识别肿瘤表面的肽抗原（peptide）与MHC类分子的复合

13、物，必需要有第二信号才能活化。这个第二信号可以由TC细胞表面的CD28分子与粘附分子B7的结合来提供。（B7分子主要存在于活化的B细胞和抗原呈递细胞表面。）在通常性况下，肿瘤细胞合成的胞内抗原经胞内降解、处理后，形成的肿瘤肽抗原与MHC类分子结合复合物，共表达于瘤细胞表面。,24,大多数肿瘤细胞由于没有B7分子，因此肿瘤细胞虽具有肽抗原与MHC类分子的复合物，但由于不能提供第二信号，所以不能活化TC细胞。IL-2、IL-4、IL-6、IFN-等基因转染的肿瘤细胞本身可以分泌细胞因子，导致抗肿瘤免疫应答的产生。实验研究发现，接种了工程化的肿瘤细胞后，原先已生长的亲本野生型肿瘤细胞开始消退；并且以

14、后再接种野生型的肿瘤细胞也不再生长，这说明工程化的肿瘤细胞具有典型的抗肿瘤疫苗效应。有意义的是，用放射线将这种工程瘤苗杀伤死后，仍然可以获得相同的抗肿瘤效果。,25,免疫网络学说的提出这一学说是Jerne（1972）根据现代免疫学对抗体分子独特型的认识而提出的。这一学说认为在抗原刺激发生之前，机体处于一种相对的免疫稳定状态，当抗原进入机体后打破了这种平衡，导致了特异抗体分子的产生，当达到一定量时将引起抗Ig分子独特型的免疫应答，即抗体的产生。,26,抗体分子在识别抗原的同时，也能被其他抗体分子所识别。在同一动物体内一组抗体分子上独特型决定簇可被另一组抗独特型抗体分子所识别。而一组淋巴细胞表面抗

15、原受体分子亦可被另一组淋巴细胞表面抗独特型抗体分子所识别。这样在体内就形成了淋巴细胞与抗体分子所组成的网络结构。网络学说认为：这种抗体的产生在免疫应答的调节中起着重要作用。使受抗原刺激增殖的克隆受到抑制，而不至于无休止地进行增殖，藉以维持免疫应答的稳定平衡。,27,抗体药物的特异性,特异性与相关抗原的特异性结合对肿瘤等靶细胞的选择性杀伤作用多样性抗原的多样性抗体结构的多样性抗体活性的多样性免疫偶联物的多样性制备时的定向性针对特定的靶分子定向制备抗体药物根据需要选择抗体药物的“效应分子”,28,单克隆抗体针对特定的单一抗原表位，具有高度的特异性，这是抗体药物发挥治疗作用的重要基础。单克隆抗体技术

16、由英国剑桥的科学家米尔斯坦（Milstein）和科勒（Kohler）于1975年首度研制。单抗作为治疗剂的研究经历了比较曲折的发展过程，上个世纪 80年代迅猛发展；90年代初期又一度处于低谷；近年再度成为生物技术药物领域研究的热点。目前，单抗药物的品种数量位居前列。,29,单抗药物具有下列重要特点：其一，特异性。单抗针对特定的单一抗原表位，具有高度的特异性，这是单抗药物发挥治疗作用的重要基础。对于抗肿瘤抗体药物的研究表明，其特异性主要表现为特异性结合、选择性杀伤、体内靶向性分布以及具有更强的疗效。其二，多样性。主要表现在抗原的多样性、抗体结构的多样性，作用机理的多样性等方面。,30,其三，制备

17、单抗药物的定向性。单抗药物的重要特点之一是可以定向制造。即根据需要，可以制备具有不同治疗作用的单抗药物。可以针对特定的靶分子，定向制备相应的抗体；也可以根据需要选择相应的“效应分子”，制备相应的免疫偶联物或融合蛋白。,31,抗体工程的发展简史,多克隆抗体阶段，早在1890年，培林 (von Behring)和北里(Kitasato)，就在实验室制造出抗白喉杆菌外毒素的血清用于治疗白喉。1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出均一性的单克隆抗体，叫细胞工程抗体。在80年代初，抗体基因结构和功能的研究成果与重组DNA技术相结合，产生了基因工程抗体技术，1984年第一

18、个基因工程抗体人鼠嵌合抗体诞生。1994年，Winter等人的抗体库技术：噬菌体抗体库技术；核糖体展示抗体库技术。,32,抗体工程发展历程,抗体作为疾病预防、诊断和治疗的制剂已有上百年的发展历史。早期制备抗体的方法是将某种天然抗原经各种途径免疫动物，成熟的 B细胞克隆受到抗原刺激后，将抗体分泌到血清和体液中。实际上血清中的抗体是多种单克隆抗体的混合物，因此称之为多克隆抗体。多克隆抗体是人类有目的利用抗体第一步。多克隆抗体的不均一性，限制了对抗体结构和功能的进一步研究和应用。,33,这种单克隆抗体多是由鼠 B细胞与鼠骨髓瘤细胞经细胞融合形成的杂交瘤细胞分泌的，具有鼠源性，进入人体会引起机体的排异

19、反应；完整抗体分子的分子量较大，在体内穿透血管的能力较差；生产成本太高，不适合大规模工业化生产。 1975年Kohler和Milstein首次用 B淋巴细胞杂交瘤技术制备出均一性的单克隆抗体。杂交瘤单克隆抗体又称细胞工程抗体。杂交瘤技术的诞生被认为是抗体工程发展的第一次质的飞跃，也是现代生物技术发展的一个里程碑。,34,基因工程抗体的优点：,1通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；2基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位；3根据治疗的需要，制备新型抗体；4可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达方式，大量表达抗体分子

20、，大大降低生产成本。,35,自从1984年第一个基因工程抗体人鼠嵌合抗体诞生以来，新型基因工程抗体不断出现。如人源化抗体、单价小分子抗体（Fab、单链抗体、单域抗体、超变区多肽等）、多价小分子抗体（双链抗体，三链抗体，微型抗体）、某些特殊类型抗体（双特异抗体、抗原化抗体、细胞内抗体、催化抗体、免疫脂质体）及抗体融合蛋白（免疫毒素、免疫粘连素）等。用于构建基因工程抗体的抗体基因最初来源于杂交瘤细胞，因此同样必须经过动物免疫，细胞融合及克隆筛选这样一个长期、复杂的工艺流程；仍然不能制备针对稀有抗原的抗体和人源性抗体，无法改善抗体的亲和力。,36,这些缺点限制了基因工程抗体更为广泛的应用。噬菌体抗体

21、库是应用最为普遍的抗体库技术。采用噬菌体抗体库技术筛选抗体不必进行动物免疫，易于制备稀有抗原的抗体、筛选全人源性抗体和高亲和力抗体。,37,噬菌体抗体库技术是生命科学研究的突破性进展之一，同时也将抗体工程的研究推想了一个新的高潮。在噬菌体抗体库基础上，近几年又发展了核糖体展示抗体库技术。利用核糖体展示技术筛选抗体的整个过程均在体外进行，不经过大肠杆菌转化的步骤，因此可以构建高容量、高质量的抗体库，更易于筛选高亲和力抗体和采用体外进化的方法对抗体性质进行改造。核糖体展示抗体库技术代表了抗体工程的未来发展趋势。,抗 体,39,抗体的概念,定义一：抗原诱导由淋巴细胞合成和分泌的，具有特殊氨基酸序列和

22、结构的免疫球蛋白分子(lg)。定义二：能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。,40,人体中主要的抗体及性质, 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.,41,抗原,抗体由抗原诱导产生，抗原是抗体药物的靶分子。抗体所针对的抗原可包括：半抗原。蛋白如糖蛋白或脂蛋白。多糖如脂多糖。人体疾病相关基因及其编码的蛋白。各种病原体如病毒、支原体、细菌、原虫、寄生虫。,42,抗体的主要作用,结合抗原中和毒素促进吞噬功能,43,结合抗原和中和毒

23、素, 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.,44,促进吞噬功能,45,自然界中可作为抗原的物质数不胜数，机体中可产生大量的抗体来对付各种抗原，每个浆细胞每秒钟可分泌2000多个抗体，免疫蛋白占血浆总蛋白的20，是血液中丰度最高的蛋白。,46,抗体的结构, 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and P

24、eter Walter.,47,Lg分子是由二硫键连接起来的约4条（2对）多肽链构成，长的一对称为重链H，有450-570个Aa残基，短的一对称为轻链L，约有214个Aa残基。,48,抗体多样性-抗体编码基因较多,Sources from Molecular Cell Biology 9. Molecular Structure of Genes and Chromosomes 9.4. Functional Rearrangements in Chromosomal DNA,轻链L编码区由V、J和C区组成，其中V、J组成可变区,49,抗体多样性,Sources from Molecular

25、Cell Biology 9. Molecular Structure of Genes and Chromosomes 9.4. Functional Rearrangements in Chromosomal DNA,重链H编码区由V、D、J和C区组成，其中V、D、J组成可变区,50,抗体多样性,Lg分子氨基端L链12与H链的14区段的氨基端组成及排列顺序多变，称为可变区（V区）。Lg分子氨基端L链12与H链的34区段的氨基端组成及排列比较恒定，称为恒定区（C区）。可变区中互补决定区CDR 具有很大的变异性，而恒定区中FR 保守。,51,抗体多样性,Sources from Molecul

26、ar Biology of the Cell V. Cells in Their Social Context 24. The Adaptive Immune System B Cells and Antibodies,恒定区FR 保守,恒定区,52,抗体独特性,编码重链和轻链的基因重排后，进行表达生成细胞表面受体并能与抗原发生作用。只有这些B cell表达的表面Lg与一个外源抗原结合后才会引发进一步的反应。在这些识别过程中将自身抗原识别掉排除。识别外源抗原的B cell被诱导增殖并分泌抗体，在此过程中，可变的结构域CDR的特定部位被诱导发生随机突变，B cell在反向于那些与抗原有高亲和力的

27、突变抗体的分泌。这个过程非常高效，使免疫系统具有产生对抗任何外来分子抗体的能力。可变区这种独特的装配方式叫做抗体的独特性。,53,抗体多样性,体细胞突变，B细胞分化过程中点突变可反复进行，使分化中的B细胞受抗原压力选择。体细胞内重组。基因转换。核苷酸掺入。,54, 2002 by Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter,抗体多样性其他机制,杂交瘤技术和单克隆抗体,56,单克隆抗体的概念,杂交细胞：在诱导物的作用下同一细胞或不同细胞间的融合，融合的细胞

28、具有双亲本细胞的染色体和全部或部分特性。杂交瘤细胞：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后产生的杂交细胞。单克隆抗体：具有分泌抗体能力的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞经无性繁殖形成的细胞系分泌产生的活性、亲和力均相同的抗体。,57,单克隆抗体的特点,多克隆抗体的不足：假阳性、制备困难、产量低。单抗中抗体分子在Aa序列和空间构型上均相同。单抗具有高度的特异性。产生单抗的细胞系可长期传代并保存，可持续生产同一性质的抗体。,58,制备针对特异抗原的单克隆抗体,制备抗原凡具有抗原性的物质均可免疫时抗原纯度可不高纯度高的抗原利于以后筛选,骨髓瘤细胞常用的骨髓瘤细胞系小鼠的BALB/c细胞系大鼠的Lou

29、细胞系免疫动物应与骨髓瘤细胞供体相一致,59,制备针对特异抗原的单克隆抗体,一般选40-50%的PEG 进行诱导。细胞融合后培养液中有脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤、脾、瘤等细胞。常用的选择性培养基为HAT培养基。,60,制备针对特异抗原的单克隆抗体,将经融合的混合细胞用HAT培养液悬浮稀释。一般在含有饲养细胞的96孔板中进行。在融合后7d用HAT选择培养基培养，7-14d用HT培养基培养，14d后用完全培养基培养。,61,制备针对特异抗原的单克隆抗体,选择培养后，只有杂交瘤细胞才能生存。但不是所有的杂交瘤细胞均能产生所需的抗体。产生特定抗原的抗体的B细胞只占所有脾细胞的5左右。用抗原对所有小孔的培养

30、上清进行抗体检测，筛出能产生目的抗体的杂交瘤细胞。,62,制备针对特异抗原的单克隆抗体,将能产生目的抗体的培养小孔中的杂交瘤细胞进行稀释。可用有限稀释法和软琼脂法。有效稀释时，将细胞稀释液分加到96孔板中，使每个小孔在理论上只有一个细胞。软琼脂法。,63,制备针对特异抗原的单克隆抗体,培养后，取上清进行抗体检测，获得能产生目的抗体的杂交瘤细胞系。大量生产目的单克隆抗体。体外培养法，10 g/ml。动物体内诱生法， 5-20 mg/ml。,64,小结,1. 用特定的抗原免疫动物,2. 从脾中取出B淋巴细胞,2. 骨髓瘤细胞,3. 获得杂交瘤细胞,4. 培养并筛选能产生抗体的单个杂交瘤细胞,5.

31、优化培养目的杂交瘤细胞,6. 纯化单克隆抗体,65,单克隆抗体的不足,目前单克隆抗体均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（human antimouse antibody, HAMA)人体的排斥反应人体内半衰期只有5-6小时到达靶组织的药量仅有1完整的抗体分子的相对分子量较大，穿透力不强，难以到达病灶的核心部位,基因工程抗体,67,基因工程改造抗体的目标,降低免疫原性。降低相对分子量，增加穿透力。,68,人鼠嵌合抗体(human-mouse chimeric antibody),在基因水平上将鼠源性单克隆抗体的可变区和人源性抗体恒定区连接起来，并在适当的宿主细胞中表达形成的抗体。,69

32、,人鼠嵌合抗体,鼠源性,鼠源性,人源性,人源性,70,人鼠嵌合抗体构建,能产生目的抗体的杂交瘤细胞系,mRNA,cDNA,根据VL和VH基因两端序列设计引物,PCR扩增,VH基因,VL基因,连人Ig的CH基因,连人Ig的CL基因,等量混合后，通过脂质体介导共转染骨髓瘤细胞SP2/0,筛选获得共转染细胞,71,人鼠嵌合抗体不足,虽然人鼠嵌合抗体与鼠源性抗体相比，在一定程度上减弱了人抗鼠抗体反应，但仍不能完全消除。,72,抗体的CDR区,Sources from Molecular Biology of the Cell V. Cells in Their Social Context 24. T

33、he Adaptive Immune System B Cells and Antibodies,框架区,框架区,CDR,73,改形抗体又叫CDR移植抗体。将鼠单抗的CDR移植到人Ig分子的骨架区中，换下其CDR序列而形成的抗体。,改形抗体(reshaped antibody),74,具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。抗体分子中鼠源部分只占很小的比例，可基本消除免疫原性。到目前，约有100种鼠单抗通过CDR移植获得人源化的改形抗体，其中超过40种已进行或正在进行临床试验。,改形抗体的特点,75,构建改形抗体除较复杂、费时费力外，最大的问题是人Ig分子的框架区中的一些氨基酸与鼠单抗的CDR区

34、不协调，从而使改形抗体的亲和力下降，甚至丧失活性。,改形抗体的不足,76,在人鼠嵌合抗体的基础上，将来自鼠单抗可变区中决定免疫原性的暴露于抗体表面的Aa，用相应位置的人Ig的Aa代替而形成的抗体。,镶面抗体（resurfacing antibody）,77,1991年，Padlan等分析了大量鼠单抗可变区Aa和人抗体可变区Aa的表面暴露情况，发现抗体表面所暴露的Aa位置和数量都很保守，不因种属和型别而改变。抗体表面暴露的Aa是鼠源可变区免疫源性的主要来源。,镶面抗体的理论基础,78,小分子抗体,79,Fab片段和重组Fab片段,Fab片段由重链Fd段和完整轻链通过链间二硫键形成的异二聚体，整个

35、分子约占整个抗体分子的1/3。如果Fab片段的恒定区为人源性的，则称为重组Fab片段。,SS,VL,CL,VH,CH,80,小分子抗体抗体的片段化,Fab: Fragmentation of antigen binding,81,Fv和单链抗体(single-chain Fv, scFv),Fv片段由重链可变区VH段和轻链可变区VL通过非共价键结合在一起，是抗体中具有抗原结合活性的最小功能片段。scFv是指在DNA的水平上用一段长度合适的寡核苷酸序列将重链可变区和轻链可变区连接起来，形成单一链的分子。,VH,82,双体分子(diabody),一条单链抗体分子上的VH和VL与另一条相同的单链抗体

36、分子上的VL和VH分别配对形成的双价抗体分子。,83,单域抗体,比Fv更小的亚单位结构组成的具有抗原结合活性的分子，重链可变区是典型的单域抗体，其具有较高的抗原结合活性。,84,最小识别单位,比单域抗体更小的分子，如CDR3仍能与抗原结合，只是其亲和力相当低。,CDR3,85,小分子抗体的优点,分子质量小，免疫原性低。易于进入实体瘤周围的微循环甚至进入实体瘤的内部。无Fc片段，不易与具有Fc受体的非靶细胞结合，用于免疫诊断时成像清晰。构建较简单，易于操作和改造。可在细菌中表达，易于大量生产。可与多种效应分子如毒素、前体药物转化酶等构建多种双功能抗体分子。,86,小分子抗体的缺点,多为单价抗体，

37、与抗原结合活性相对较弱。半衰期短，能很快从血液中清除，从而可能影响治疗的有效浓度。,87,抗体库技术(antibody library),用基因克隆技术克隆全套抗体的重链和轻链的可变区基因，然后重组到特定的表达载体中，转化特定的宿主细胞表达有功能的抗体分子，并通过亲和筛选获得特异性抗体可变区基因的技术。利用抗体库技术筛选到的抗体可变区基因可被用于构建基因工程抗体。,88,抗体库优点,越过了细胞融合的步骤，省时省力。扩大了筛选容量，易于获得高亲和力抗体。不需进行人工体内免疫。,89,抗体库技术的发展,1989年，组合抗体库(combinatorial immunoglobulin library

38、)技术。1991年，噬菌体抗体库展示技术。最近几年，核糖体展示抗体库。,90,组合抗体库,克隆抗体轻链全套基因,克隆抗体重链Fd段全套基因,构建到噬菌体表达载体,轻链全套基因库,重链Fd段全套基因库,随机重组到同一表达载体中,组合抗体库,特异性抗体筛选,具有目的抗原结合活性的Fab片段,抗体重要应用,92,双功能抗体,是指具有两种结合特性的抗体，即两个抗原结合位点可同时结合两个不同的抗原或抗原决定簇，又称双特异性抗体(bispecific antibody, BsAb) 。广义上讲，双功能抗体也包括各种抗体免疫偶联物。,93,双功能抗体构建的方法,化学交联法生物学方法（杂种杂交瘤方法）基因工程

39、方法,VL,VH,VL,94,双功能抗体应用举例,构建一个抗原结合位点是针对肿瘤细胞的表面抗原，另一个是针对免疫活性细胞CTL表面的特征性分子CD3或CD28。这种双特异性抗体可以识别并连接肿瘤细胞和CTL细胞，对肿瘤细胞产生特异性的杀伤作用。,95,药物毒素酶同位素,抗体免疫偶联物(immunoconjugates),导向装置,弹头,96,与单抗偶联的常用的“弹头”,植物毒素微生物毒素抗代谢类药物蒽环类药物烷基化类药物抗有丝分裂药物抗生素,蓖麻毒素、相思豆毒素、皂角苷绿脓杆菌外毒素、白喉毒素氨基喋呤、阿糖胞苷、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、5-氟脱氧尿苷阿霉素、柔红霉素、去甲氧柔红霉素、吗啉阿霉素

40、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、丝裂霉素C、顺铂长春花碱、秋水仙碱、鬼臼毒素新制癌菌素、博莱霉素、平阳霉素、博安霉素、力达霉素、加力奇霉素,97,单抗偶联物的特点,在体内显示特异性分布，在靶组织浓度最高。对靶细胞有选择性的杀伤和治疗作用，对正常细胞作用弱。比游离药物有更好的疗效并较低的副作用。,98,已上市的治疗肿瘤的抗体药物,抗CD20嵌合抗体Rituxan抗HER2人源化抗体Herceptin抗CD33人源化抗体抗生素偶联物Mylotarg抗17-1A抗独特型嵌合抗体Panorex抗CD20人源化抗体核素偶联物Zevalin,99,抗体药物研究的趋向,寻找新的分子靶标抗体人源化抗体药物的高效化抗体药物分子的小型化抗体融合蛋白,100,抗体药物研制新药的先锋,化学合成药物,天然来源药物,放射性核素,基因组、蛋白组研究,抗原、药物靶点,细胞因子、活性蛋白,祝大家快乐！,