法医病理学组织切片制作课件.ppt

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1、法医病理学,组织切片制作,法医病理学组织切片制作,HE,染色切片,HE染色切片,一、目的要求,掌握取材、固定、水洗、脱水、透明、浸,蜡与包埋，切片制作。,（一）取材,1.,取材快，新鲜，防止组织腐败。,2.,取材刀锋利，垂直地切取，严禁挤压或用钳镊,钳夹，以免使组织或细胞变形造成人为的破坏。,3.,取材大小，,lcm,3cm,1cm,2cm,0.3cm,0.5cm,。材料过大在短时间内不易固定透，影响,效果。,一、目的要求掌握取材、固定、水洗、脱水、透明、浸蜡与包埋，切,（二）方法：,1.,实质器官,心脏：,心房、瓣膜、心室。可分别取病变部位带正常,组织。可单独取心室肌，乳头肌，,3,5,块。

2、,肺脏：,左右两肺（五个肺叶）；可根据病变需要决定,取材块数，特殊情况下为区别在不同肺叶上取材，,可用形状做标志在记录时记清楚，,5,7,块。,肾脏：,取材包括被膜、皮质、髓质和肾盂，应区别左,右肾，,2,4,块。,胰腺：,取胰体部，必要时加取胰头、胰尾，,2,块。,肝脏：,取长方形或三角形，,2,3,块。,脾脏：,取材带被膜，,2,3,块。,（二）方法：1. 实质器官心脏：心房、瓣膜、心室。可分别取病,脑：,全脑（桥脑、延脑、小脑）、脊髓颈,段及脉络丛，十一块，或根据具体情况决定：,额极；前后中央回；海马；内囊；,丘脑；枕叶；脉络丛；桥脑；延,髓；中脑；,?,小脑。取材时要带上软脑,膜、脑室

3、膜或软脊膜因此刀要锋利。需要时,取脊髓。,垂体：,前、中、后叶和垂体柄，从前向后,横切。,脑：全脑（桥脑、延脑、小脑）、脊髓颈段及脉络丛，十一块，或根,2,管腔脏器：,取材时注意方向，取管腔脏器的全层构造。,大肠、小肠：,应考虑环行皱襞，沿肠管的长轴取,（纵切）。,食管、气管：,横切面为宜。,胃：,常规取胃底。,取材后应将被膜面铺在滤纸上，然后入固定液,内，防止或减少组织受压变形与收缩。,有病变的部位，应附带周围正常组织取材。,2管腔脏器：取材时注意方向，取管腔脏器的全层构造。大肠、小,二、固定,（一）意义：,是做好切片的重要步骤之一，如果,首次组织固定不良，再重新固定效果不佳。,检材固定的关

4、键：取材后尽可能地及时地将,所取的材料进行固定，以防止其“死后”变化的,进展，尽力使组织接近于生前状态。为了防止组,织结构及成份的破坏和溶解消失，需要使其转变,为不溶性物质，有利于组织结构保存,-,固定的基,本意义。,二、固定（一）意义：是做好切片的重要步骤之一，如果首次组织固,固定的目的：,1.,阻止死后变化，防止组织的自溶与腐败。,2,保存组织的结构及成份。,3,媒染作用，使不同的组织成份对染料有不同,亲和力，使细胞各部易于受色。,4,能使组织硬化，为制作薄切片奠定基础。,注意：,材料块不能过大，固定器皿不易过小，固,定液量不易过少，应是固定材料体积的,20,一,30,倍。,固定的目的：1

5、.阻止死后变化，防止组织的自溶与腐败。2保存,（二）固定液：,根据检验目的不同选择不同种类固定液，如糖原检查：不含水的固,定液；电镜检查：锇酸固定液等；,HE,染色：甲醛。,固定液：,用以固定组织的药剂。,固定液分类,：单纯固定液，由一种药剂组成；混合固定液（或复合），,由二种以上的药剂组成。,1,选择固定液的标准：,具有强的穿透力，固定均匀，能迅速渗透到组织内部使组织细胞结构,保持生活状态。,不使组织过度收缩与膨胀而变形。,能迅速使组织中的蛋白质、糖、脂肪等物质凝固成为不溶性物质。,使组织达到一定的硬度便于切片制作。,价格便宜，易购买，配制方便。,（二）固定液：根据检验目的不同选择不同种类固

6、定液，如糖原检查,2,单纯固定液,乙醇（酒精）、甲醛（福尔马林）、重铬酸钾、苦味酸、锇酸、丙酮、,冰醋酸,（,1,）乙醇（酒精）（,alcohol,）,优点：,价格低，易购买，易溶于水，使用方便，,95,浓度，无水乙醇,100,；,市售有两种：,100%,；,95%,；,能硬化组织起固定作用；,也是一种最常用的脱水剂。,固定用浓度在,70,80,，酒精浓度愈大组织收缩愈严重，浓度过低起,不到固定作用。,缺点：,穿透力小，由于被固定的组织表面硬化，固定液不容易渗透到组织中去，,所以用乙醇固定的组织材料要小。,使组织严重收缩。,由于酒精能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，核蛋白的沉淀物易溶于水，,使细胞

7、核核色不佳。,溶解脂肪、血红蛋白和多种色素，脂肪染色必须制作冰冻切片。,2单纯固定液乙醇（酒精）、甲醛（福尔马林）、重铬酸钾、苦味,2,甲醛：（福尔马林）（,formalin,）,最常用的固定液,，一种还原剂，无色透明极易挥发有强,烈刺激性气味的液体，不能与氧化剂混使用。可应用于组织,学、组织化学、免疫组织化学等染色，最好用时现配。,商品甲醛：,37,40,甲醛水溶液。,固定液的浓度：,4,8,（习惯上称为,10,或,20,的福尔马,林）。,固,定,时,间,：,常,温,下,固,定,24h,48h,。,快,速,固,定,，,可,加,温,到,70,80,或者加温煮沸,10min,即可。快速固定，组织

8、块不宜,过厚或过大，缺点是组织收缩较严重。,固定液配制：,甲醛,1,份与,9,份自来水混合即为,10,（,4%,）浓度,的甲醛固定液。,2甲醛：（福尔马林）（formalin）最常用的固定液，一,优点：,渗透力较强；组织收缩小；细胞核染色较好。,缺点：,质量较差的,formalin,在低温下久存容易产生一种白色的沉,淀物称“三聚甲醛”（付醛），经氧化成为甲酸而使溶液呈,酸性，影响细胞核染色。可在备用甲醛溶液中放入适量的碳,酸钙或碳酸镁，简便的办法可在溶液中投入适量的大理石或,者白色粉笔作为中和剂。,酸性福尔马林固定的组织多易产生一种褐色或黑色细颗粒,状物，称为福尔马林色素，在切片上形成黑色小颗

9、粒，不溶,于水和酒精，影响染色效果和切片的观察。,优点：渗透力较强；组织收缩小；细胞核染色较好。缺点：,去掉福尔马林色素颗粒方法：,Schridde,法,25,氨水,75,酒精,l,ml,200,ml,切片脱蜡经,70,酒精时，用上液浸泡半小时或稍长一,些时间，然后水洗再行染色。,Verocay,法,l,氢氧化钾水溶液,70,酒精,l,ml,100,ml,切片脱蜡经酒精,80,时入上液处理,10,分钟，经,70,酒,精入水后即可染色。,去掉福尔马林色素颗粒方法：Schridde法25氨水75,（三）水洗,1.,用水道流水洗涤，彻底清除组织块中的固定液。,2.,水洗时间数小时至,24,小时。,3

10、.,根据材料多少、大小可灵活掌握水洗工具，可用水洗,筐或用纱布包裹，防止水流过大将组织块冲掉或丢失。,(,四,),脱水,组织块固定后虽然已经硬化，但达不到切薄片的硬度，,必须制成石蜡组织块，脱水是继固定后的重要步骤。,经固定和水洗后的组织含大量水分，在这种情况下首,先必须除去组织内部的水分，这种除水的过程叫做脱水，,脱水使用的药剂称为脱水剂。,脱水必须逐渐依次从低浓度酒开始到高浓度酒，否则,引起组织强烈收缩，变脆不利制片。脱水不彻底也很难浸,进石蜡。,（三）水洗1.用水道流水洗涤，彻底清除组织块中的固定液。2.,常用脱水剂：,溶于水和透明剂的试剂，如酒精、丙酮、正丁醇,等。,（,1,）酒精,步

11、骤：,70,80,90,95,100,100,，一般数小时到,12,小时，更换一次酒精。,配低浓度酒精时，可用市售,95,酒精配制。,70,酒精：,95,酒精,70ml,加蒸馏水,25ml,至,95ml,；,80,酒精：,95,酒精,80ml,加蒸馏水至,95ml,，依次类推。,（,2,）丙酮,脱水作用与酒精相似，虽其脱水作用比酒精强，但可引,起组织块的收缩较，价钱较贵，故不宜用于一般组织脱水，,它即有脱水作用又有透明作用，用丙酮固定的材料要小，脱,水,1,8,小时即可。,常用脱水剂：溶于水和透明剂的试剂，如酒精、丙酮、正丁醇等。（,（五）透明,目的：,因为酒精与蜡不能相交换需要借助石蜡诱导剂

12、的媒介作,用。石蜡诱导剂渗入之后组织块往往呈现透明状态，习惯上将,石蜡诱导剂渗入组织内的过程叫透明，用于透明的试剂称为透,明剂。,透明时间：,根据组织块的大小而定，,一般,20,分钟至,1,小时,。组织,块过大可延长透明时间，透明好的材料如同油炸的感觉呈透明,状。,透明剂：,二甲苯、氯仿、甲苯、香柏油等。,最常用二甲苯,。,二甲苯：,无色透明有机溶媒，有很强的刺激气味，易挥发，,长期接触对粘膜有刺激作用，透明作用很强，可使组织收缩变,形，透明时间不宜过长。如遇到组织块内部或某一个部位呈白,色混浊状态时说明脱水不彻底，如果造成透明不彻底应退回到,100,酒精中重新透明。,（五）透明目的：因为酒精

13、与蜡不能相交换需要借助石蜡诱导剂的媒,六、浸蜡与包理：,浸蜡的目的：,为了能制作薄切片做准备，将透明,好的组织块浸到融化的石蜡中，使石蜡渗透到组,织细胞内，将组织细胞内的二甲苯完全彻底地取,代出来，再用石蜡将组织包埋，冷却后，切成小,块，修整好切面，这一过程为浸蜡与包埋。,六、浸蜡与包理：浸蜡的目的：为了能制作薄切片做准备，将透明好,具体操作：,（一）浸蜡,石蜡箱温度,58,60,左右，内有标明、的蜡杯,或蜡缸，从透明的二甲苯取出组织块，放入号蜡杯中,2h,3h,，再将组织块移入号蜡杯（纯蜡）,2h,4h,，再,移入号蜡杯中（纯蜡）半天或者稍降蜡箱温度过夜，最,后用融化的纯蜡作为包埋用的蜡。,

14、注意：,浸蜡时蜡杯不要颠倒顺序使用，以免脱二甲,苯不彻底。如遇特殊情况需要延长浸蜡时间时可降低蜡箱,温度或关闭蜡箱，需要时再开。温度越高，时间越长组织,块收缩越严重，而且材料脆而不易制作切片。,具体操作：（一）浸蜡石蜡箱温度5860左右，内有标明,（二）包埋：,包埋方法：,石蜡包埋法、火棉胶包埋法、炭蜡包埋法、明胶,包埋法、环氧树脂包埋法（电镜用）等。,步骤：纯石蜡溶解后（,60,）倒入包埋框内或纸盒内，迅速,将浸好的组织块的切面向下、放平，依次摆入框内，待蜡逐,渐冷却凝固后，将组织材料凝结在石蜡内。然后按组织块大,小切成蜡块，组织四周蜡边留,0.1,厘米左右即可。,注意：,如果操作不熟练或在

15、冬天包埋时最好用酒精灯。在材,料包入石蜡之前，稍在酒精灯上过一下加温，以免材料与包,埋蜡温度不符造成材料与包埋蜡间遗留缝隙，切片时产生分,离现象。,蜡块背面要标记例号等字样的纸片，以长期保存。切完,的蜡块表面要用烫片板，烫一下封闭材料面，隔离空气接触,可长期保存材料不干。,（二）包埋：包埋方法：石蜡包埋法、火棉胶包埋法、炭蜡包埋法、,（三）蜡的种类：,1,蜂蜡：是动物体内提取的蜡，颜色微黄故也称为黄蜡，,溶点在,54,左右。特点是润滑带有粘性，冬天用量比夏天,多。,2,石蜡：是由矿物质中提取，质地较疏松，色白。根据,蜡的溶点不同又可分为软蜡及硬蜡。,软蜡：,50,以下的石蜡。硬蜡：溶点在,50

16、,以上的石蜡。,两种蜡可以混合在一起使用。石蜡熔点有,52,54,，,56,58,，,58,60,，,60,62,。,（三）蜡的种类：1蜂蜡：是动物体内提取的蜡，颜色微黄故也称,七、切片,工具：,切片刀、磨刀机、切片机、水浴锅，干燥箱等；载,薄片、手术刀、毛笔、弯镊子、托盘、大平皿（展片使,用）、烤片盒、蛋白甘油等。,（一）切片机种类：,轮转式切片机、滑行式切片机（滑动,式）、冰冻切片机、超薄切片机等（电镜用）。,（二）构造：,由四个基本部分组成：刀台、标本台、旋转,轮、控制切片厚度的微动装置（标有,l,25,或,1,50,的数字，,每一数字代表一个微米）。根据需要调节厚度，,一般采用,5,m

17、,7,m,。,蛋白甘油：,用鸡蛋清（不要鸡蛋黄）用玻璃棒充分搅拌后,用数层纱布过滤后加等量的甘油搅均匀加数颗麝香草酚。,七、切片工具：切片刀、磨刀机、切片机、水浴锅，干燥箱等；载薄,（三）切片制作,1,将洁净的载薄片涂薄层蛋白甘油放人烤片盒内待用。,2,将切割修整好的蜡块用普通刀片先将蜡块的组织切面暴露,出来修平，固定在切片机上的标本台上并拧紧螺旋。,3,蜡块先固定在标本台上切片刀固定于刀台上，拧紧固定刀,的螺丝同时调整刀与蜡块的切片距离使刀与蜡块贴紧后再固定,刀台螺丝，刀的角度为,25,度角。,4,调节微动装置，调至切片所需厚度（一般为,5,m,7,m,）。,5,修材。右手握旋转轮摇把按顺时

18、针方向均匀地摇动直到组,织块切面完整暴露为止。,（三）切片制作1将洁净的载薄片涂薄层蛋白甘油放人烤片盒内待,（四）展片,水浴锅上平皿内水温升至,45,左右，将已切好的连续,薄片切分成数片，放在水面，轻漂，水中展平，未展平时,可用小弯镊子轻轻展开，然后用涂有蛋白甘油的载片在水,中选择完整的切片进行捞片。,（五）注意事项,1,切片刀要锋利，否则切片有切痕或组织破碎，甚至不能,制成切片。,2,展切片时水温要适当，水温低，展不平切片，切片有皱,折，影响效果；如果水温过高，切片入水后可发生溶化,。,（四）展片水浴锅上平皿内水温升至45左右，将已切好的连续薄,实习四,法医病理学,组织切片染色,实习四法医病

19、理学组织切片染色,目的要求：,掌握切片染色、封片等技术及操作过程。,一、染色前准备工作,1,染色：准备的工具：染色缸或者,12,个盛各种不同浓度的,酒精染色筐广口瓶，染色缸及脱蜡、透明用的各二个二甲苯,染色缸，盖片，带磨口盖树胶瓶一个，镊子,1,把。,2,染色需要的试剂及染色液的配制：,0.5,1,盐酸,酒精：,用于细胞核染色分色。,配制：,100ml,的,70,80,酒精中加人,0.5ml,或者,1ml,的浓,盐酸。,苏木素（,hematoxylin,）及伊红（,eosin,）,苏木素：,细胞核的染料，氧化后的苏木素具有染色能力,的。苏木素的配方：二种，一是自然氧化的苏木素；二是加,入氧化剂

20、加速氧化的。,目的要求：掌握切片染色、封片等技术及操作过程。一、染色前准备,3,苏木素的配方,自然氧化（,Ehrlieh,）苏木素：,苏木精,铵明矾,无水酒精,2g,3g,100ml,甘油,蒸馏水,100ml,100ml,将上述药品配在一起后装入玻璃瓶中，瓶口罩上数,层纱布以防灰尘落入染液，暴露于阳光中或空气中自然,氧化（成熟过程），约,6,周,8,周以上，染液配制越久其,染色能力越强，可以一次大量配制以备用。,3苏木素的配方自然氧化（Ehrlieh）苏木素：苏木精铵,自然氧化（,Delafield,）苏木素：,苏木素,无水酒精,4g,25ml,铵明矾饱和水溶液,矾加蒸馏水,11,份。,400

21、ml,铵明矾饱和水溶液配法：,10,铵明矾水溶液，或,1,份铵明,配制过程：,苏木素溶入酒精后，加入铵明矾液，倒入玻,璃瓶中敞开瓶口，罩以数层纱布，置光线充足处,3,5,天,后过滤，再加入,甘油,100ml,、,甲醇,100ml,。置光线充足处,经,l.5,2,个月后成熟。染液可保存多年，染色时多采用蒸,馏水稀释的染色液。,自然氧化（Delafield）苏木素：苏木素无水酒精4g2,加氧化剂的苏木素配制,Harris,苏木素：,液,苏木精,无水酒精,液,钾（铵）明矾,蒸馏水,氧化汞,l,g,10,ml,20,g,200,ml,0.5,g,冰醋酸,8,ml,配制方法：,先将液用玻璃棒搅拌使苏木素

22、溶解，再将,液煮沸溶化去火，速加入液，再加火，煮沸后去火，立,即加入氧化汞,0.5g,，再煮沸，迅速冷却后加入冰醋酸,8ml,过,滤使用，组织学常用染色液。,加氧化剂的苏木素配制Harris苏木素：液苏木精无水酒精,4,伊红（,eosin,）,最常用的细胞质染料之一，外观为红色粉末。分两种：,酒溶性伊红；水溶性伊红,。,配法：,0.5,水溶性伊红,伊红,0.5g+,蒸馏水,100ml,，溶解后使用。,0.5,酒精溶性伊红,伊红,0.5g+70,酒精,100ml,，溶解后使用。,一般病理组织学切片染色，染细胞核用苏木素，染细,胞质用伊红，故一般称这种染色法为,HE,染色（苏木素,伊,红染色法）。

23、,4伊红（eosin）最常用的细胞质染料之一，外观为红色粉末,二、染色方法及步骤,1.,脱蜡：二甲苯,10min,20min,；二甲苯,10min,20min,。,2,脱苯：,100,无水乙醇脱苯,2min,5min,；,100,无水乙醇,2min,5min,。,3,水化：,95,酒精,90,酒精,80,酒精,70,酒精各数秒至,1min,，水,浸洗数分钟。,4,染细胞核：切片移入苏木素染液中染,10min,20min,。,5,水洗（水洗一下将浮在表面的染液去掉）。,6,分化：,l,盐酸酒精分化时间数秒钟，观察切片组织材料呈粉红色。,7,水洗：水道流水洗,0.5,数小时，切片从粉红色转变为鲜艳

24、的蓝色（蓝,化过程）。,8,染细胞质：,0.5,或,l,伊红溶液复染,1min,5min,。,9,脱水：切片脱水由低浓度酒到高浓度酒精。将切片入,70,酒精,80,90,95,。切片在酒精内几秒钟，时间长，伊红易脱色。应注意,伊红与苏木素的对比染色的色调适合。,10.,脱水：,100,酒精,5min,10min,；,100,酒精,5min,10min,11.,透明：入二甲苯,2min,5min,；二甲苯,2min,5min,。,二、染色方法及步骤1.脱蜡：二甲苯10min20min；,三、封片与染色结果,用中性树胶进行封固切片，细胞核经苏木素染成鲜艳,的蓝色，细胞质核仁、肌纤维、胶原纤维、红细

25、胞等呈红,色。,HE,染色简化程序：（脱蜡、水化）二甲苯,二甲苯,无水酒精,无水酒精,95,90,80,70,水洗,苏木素染色（染细胞核）（,10min,20min,）,自来,水洗一下,1,盐酸酒精分化,自来水洗（核分化）,伊红,染色（染细胞质）,直接脱水,70,80,90,95,（各稍停片刻）,100,100,（彻底脱水）,透明，,二甲苯,二甲苯，中性树胶封片。,三、封片与染色结果用中性树胶进行封固切片，细胞核经苏木素染成,常规涂片染色的操作方法：,基本与石蜡切片染色程序一样。,不同点：固定液不同，操作时间短。,步骤：,涂片自然干燥或加温干燥后甲醇固定，待固定液干燥,后，苏木素染色,2min

26、,5,min,水洗一下去浮色,1,盐酸酒,精分化（浸,1,2,次）,流水洗切片（,5min,以上）。,伊红染色,2min,5,min,脱水：,70,酒精,80,90,95,各数秒，,100,100,各稍停片刻（彻底脱水）,透,明：二甲苯,二甲苯，中性树胶封片。,常规涂片染色的操作方法：基本与石蜡切片染色程序一样。不同点：,四、两种常用的特殊染色方法,（一）,Mallory,染色,配方：,酸性复红,苯胺兰,桔黄,G,磷钼酸,蒸馏水,3,克,1,克,3,克,1,克,200ml,四、两种常用的特殊染色方法（一）Mallory染色配方：酸性,染色方法：,1,石蜡切片常规脱蜡至水。,2,入,3,重铬酸钾

27、媒染,12h,24h,，如果固定的材料含升,汞可省此步骤，但需脱汞。,3,蒸馏水洗二次。,4,入,Mallory,染色液中染,5min,。,5.,蒸馏水洗。,6,95,酒精分化约,3min,5min,，显微镜下控制染色程,度。,7,100,、,100,酒精脱水。,8,二甲苯、二甲苯透明。,9,树胶封片。,结果：,胶原纤维及粘液呈深蓝色，红细胞呈红黄色，,肌组织呈红色，弹力纤维呈玫瑰红色。,染色方法：1石蜡切片常规脱蜡至水。2入3重铬酸钾媒染1,Contused myocardial fibers stained by Mallorys trichrome method,Contused myo

28、cardial fibers sta,（二）,Weigert,染色（弹力纤维染色法）,配方：,盐基品红,间苯二酚,2g,4g,蒸,馏,水,200ml,配制方法：,将上述药品一起放入烧杯内，加热煮沸，再,加,29,FeCl,3,水溶液,25ml,，用玻璃棒搅匀，继续煮沸,2min,5min,，冷却后过滤。倾去滤液不用，将滤纸及沉淀物一同放,入烧杯内，放在干燥箱内烘干，取出加,95,酒精,200ml,，加,水煮至沉淀物溶尽，拿出滤纸冷却后过滤并补足蒸发失去的,酒精，最后加入浓盐酸,4ml,即可，此液可保留数月。,（二）Weigert染色（弹力纤维染色法）配方：盐基品红间苯,染色方法：,1,切片脱蜡

29、至酒精。,2,Weigert,氏液染色,20min,60min,。,3,用,95,酒精洗去剩余染液，在显微镜下观察结构细节，,不清晰时可用,1,盐酸酒精分化。,4,自来水洗。,5,以,l,中性红做对比染色或用明矾苏木素染后，再用稀释,伊红或用,Van Gieson,液染色。,6,用,95,酒精分化，无水酒精脱水。,7,二甲苯、透明。,8,树胶封片。,结果：,弹力纤维显示兰黑色。用中性红做对比染色，肌组织,呈红色。,染色方法：1切片脱蜡至酒精。2Weigert氏液染色20,Elastic fibers,Elastic fibers,Collagen and elastic system in the remodelling process of,major types of idiopathic interstitial pneumonias (IIP),Histopathology 2019, 46, 413,421,Collagen and elastic system in,