浙江大学细胞培养基础知识ppt课件.ppt

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1、培养前准备培养基培养设备,细胞培养基础知识,一、细胞培养物的生长生物学,体外细胞培养物的生长类型,(1)上皮型细胞(2)成纤维型细胞(3)游走型细胞(4)多形型细胞,（一）贴附(粘附)型细胞,粘附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式含义：细胞与细胞间接触，细胞与细胞外基质结合。结果：细胞与细胞之间相互结合形成组织，使细胞与其周围环境间始终保持联系，使有机体内几乎不存在“自由”的细胞。培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。,细胞的贴附过程,贴附物质带正电荷,细胞带负电荷,细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此

2、紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。,来源：来源于外胚层，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物，乳腺外胚层 消化道，呼吸道上皮内胚层 内皮 中胚层 上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞，但不完全相同,上皮细胞型,易相连成片相靠紧密相连成薄层铺石状生长时呈膜状移动很少脱离细胞群而单个活动,上皮细胞型生长特点,成纤维细胞型,名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形

3、态，梭形或不规则三角形，胞质向外伸出23个长短不等的突起，中有卵圆形核。,排列成放射状，漩涡状 不紧靠连成片，细胞与细胞接触易断开而单独行动 游离的单独的成纤维样细胞， 常有几个伸长的细胞突起,成纤维细胞型生长特点,体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞,具有类似巨噬细胞样的特征。经常处于较活跃的变形及游走状态，因此外形不规则且不断变化。当细胞密度增大相互连接成片时，游走受限，形状上类似上皮型细胞或成纤维细胞型的细胞。表现这种形态的细胞主要是具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肝枯否细胞(Kupffer cell)以及某些肿瘤细胞等。,游走型细胞,多形型

4、细胞是一些形态上不规则的细胞，细胞一般分胞体和胞突两部分：其胞突为细长形，似丝状伪足。胞体虽略呈多角形，但没有成纤维细胞型那样不规则。体外培养中呈现多形型的细胞最常见的类型是神经元和神经胶质细胞 。,多形型细胞,细胞形态并非固定不变，可随培养条件、生长时期、细胞数量等而变化 细胞形态只是对培养物判断或识别的参考指标若要确定某一培养物的确切细胞类型，必须借助更为特异的鉴定方法，如进行组织化学或免疫细胞化学染色鉴定。,注意：,培养细胞形态不稳定,（二）悬浮生长型,概念 培养时不贴附于基质而呈悬浮状态生长，或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源 自血，脾或骨髓，尤其血中白细胞，癌肿细胞也可能特点 在悬

5、浮中生长良好，细胞圆形，单个或小细胞团,优点 生存空间大，提供数量多 传代方便 (不需消化) 易于收获 可获得稳定状态缺点 观察不方便 很多细胞不能悬浮生长 (尤其正常细胞),二、培养细胞的生长和增殖过程,分裂增殖和生长发育是体外培养细胞的两大生命特征增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相仿,（一）组织培养细胞生命期 (Life Span of Culture Cells),在培养中持续增殖和生长的时间。 原代培养期、 传代培养期、 衰退期。,1、原代培养期 (Primary Culture stage),也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周。,特点：细胞

6、呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与 体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。,2、传代期 (passage stage),特点：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺 盛，并能维持二倍体核型。,传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。 初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。,原代培养传代培养,一代贴附生长细胞的生长过程,游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）,体外培养细胞一代生存期,潜

7、伏期指数增生期停滞期,所谓细胞的“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。,2.1 游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 10 min-4 h,2.2 贴壁期：细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟-4小时贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）,2.3 潜伏期： 此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624 h。,2

8、.4 对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。,2.5 停止期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性,a. 贴附,b. 接触抑制,c. 密度抑制,培养细胞的生长特点,3、衰退期特点：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖， 最后衰退凋亡。,（二）单个细胞的生长过程,（一）细胞的营养需要 -培养基,培养基的基本要求,基本营养物质：氨基酸、维生素、碳水化合物及一些无机离子促生长因子、激素、血清等物质渗透压：因细胞的类型及种族而异。人血浆渗透压约为290 mmol/L，可视为体外培养人类细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在320 mM

9、左右。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在260-320 mM。pH：大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4.无毒、无污染,培养基的种类,天然培养基：血清合成培养基：,主要是牛血清 胎牛血清：取自破腹产的胎牛 新生牛血清：取自出生24 h的新生牛 小牛血清：取自出生10-30 d的小牛主要成分 血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、 生长因子、激素、无机物等,血清：,主要作用 1）提供基本营养物质2）提供贴壁和扩展因子3）提供激素及各种生长因子4）提供结合蛋白5）对培养中的细胞提供某些保护作用,血清：,主要缺点 1）改变某种细胞在体内的正常状态2）血清中含有的某些物质对细胞有毒害作用3）每个批次血清的成

10、分不能保持一致4）取材过程中可能污染支原体、病毒等，对培养细胞产生潜在影响,血清：,使用前处理 56 oC灭活30 min。储存条件一般储存于-20 oC，避免反复冻融，购买大包装后，先灭活，然后分装冻存，使用前4 oC融化。使用浓度一般为5-20%，最常用为10%。,血清：,低限量Eagle培养基，仅含有12种2必需氨基酸、谷氨酰胺，8种维生素及必要的无机盐。成分简单，易于添加某种特殊成分适应某些特殊细胞的培养。,MEM (minimum essential medium)：,由Dulbecco等人研制，在MEM基础上增加了各成分的用量，分为高糖型（葡萄糖4500g/L）和低糖型 (葡萄糖1

11、000g/L)，高糖型有利于细胞停泊在一个位置生长，适合于生长较快。附着较困难的肿瘤细胞。,DMEM (Dulbeccos modified Eagle medium)：,由Iscove等人在DMEM基础上增加了许多非必需氨基酸及一些维生素，增加了HEPES，葡萄糖含量为高糖型。适合于细胞密度较低，细胞生长较困难的情况，如杂交瘤细胞的筛选培养，DNA转化后细胞的培养。,IMDM (Iscoves modified Dulbeccos medium)：,由Moor等人为培养小鼠的白血病细胞而设计，特别适合悬浮细胞，尤其是淋巴细胞的培养，组分较简单，目前配方适合多种细胞的生长。,RPMI1640：

12、,由Morgan等人为培养鸡胚组织而设计，几乎含有所有氨基酸、维生素、生长激素、核酸衍生物等。109比199效果更好。,199、109 medium：,由Ham针对小鼠二倍体细胞克隆化培养而设计，并逐步改良后也适合人二倍体细胞的培养，F12在F10配方基础上增加了一些微量元素和无机离子，特别适合进行单细胞分离培养。,HamF10、HamF12 medium：,由MeCoy 等人专为肉瘤细胞研制的培养液，后发现特别适合原代细胞培养，尤其是较难培养的细胞生长。,MeCoys 5A medium：,一般以HamF12和DMEM按1:1混合作为基础培养液；在基础培养液中添加促贴壁物质、促生长因子及激素

13、、酶抑制剂、结合蛋白和转运蛋白、微量元素等。,无血清培养基：,均不含有动物蛋白；CDM培养基中添加了一些已知结构和功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。,无蛋白培养基 (protein free medium, PFM)限定化学成分培养基 (chemical defined medium, CDM)：,培养基的选择,1）建立某种细胞株所用的培养基应是首选，可查阅文献或向卖家咨询；2）本实验室惯用的培养基，许多培养基可适合于多种细胞；3）根据细胞株的特点、实验的需要选择培养基； 如小鼠细胞株多选RPMI1640，进行细胞杂交、转染可选IMDM4）用多种培养基分别培养目的细胞，根据其生长状态选择

14、培养基。,培养基的配制,1）认真阅读说明书；说明书中注明干粉中不包含的成分，如NaHCO3，谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等2）配制时要保证充分溶解。NaHCO3、谷氨酰胺等物质要在培养基完全溶解后才能添加；3）配制所用的水为双蒸水或三蒸水，离子浓度很低；4）所用器皿应洁净无菌；5）配制好的培养基应马上过滤除菌，存于-20 oC或4 oC。,制备1000 ml RPMI-1640培养基,RPMI1640干粉培养基10.4 g（1包） +蒸馏水400 ml 磁力搅拌至完全溶解 加三蒸馏水定容至1000 ml 滤过除菌，并分装成200 ml/瓶，-20 冻存,酚 红,大多数培养液中使用酚红作为pH

15、 指示(黄-红-紫)0.4酚红溶液：称取0.4 g酚红，置玻璃研钵中细研，逐滴加入0.1 mol/L NaOH边滴边研至酚红完全溶解，记好加 NaOH的量，共加11.28 ml，将研好的酚红液用吸管移入烧瓶中加三蒸水88.72 ml，高压灭菌。在一些特殊培养液中不含酚红哺乳细胞培养液：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用流式检测细胞培养液：酚红干扰检测,维持液与生长液,维持液：合成培养基中不加血清或加低浓度（如 2）血清，仅能维持细胞生存，细胞不能很好生长。生长液：合成培养基中加入10-20血清，有利于细胞生长。,附 RPMI-1640生长液和维持液配法,维持液： RPMI-1640 9

16、5 小牛血清 2 谷氨酸胺（100） 1 双抗（100） 1 用NaHCO3调pH至7.0-7.2。,生长液： RPMI-1640 88 小牛血清 10 谷氨酸胺（100） 1 双抗（100） 1 用NaHCO3调pH至7.0-7.2。,其它培养用液,平衡盐溶液消化液pH调整液抗生素液谷氨酰胺补充液,几种常用的平衡盐溶液的配方 (g/L),胰酶 (trypsin)溶液一般浓度为0.1-0.5%，配制时用平衡盐溶液，溶解的最佳pH是8-9，充分溶解后过滤除菌，可再调整pH至7.5或不调。EDTA溶液一般浓度为0.02%，配制时加碱助溶，可过滤除菌，也可高压灭菌。胶原酶溶液一般为0.1-0.3 m

17、g/L或20万U/L，最佳pH为6.5，胶原酶不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制，配制时可用PBS。,消化液,常用浓度为0.25% （0.1%-0.5%）称取所需胰蛋白酶，用少许D-Hanks液调成糊状再补足D-Hanks液，搅拌混匀，置室温4 h或冰箱过夜，不断搅拌振荡次日，滤过除菌，分装， -20 冻存,胰蛋白酶液配制,消化液- EDTA2Na 溶液,一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便常用工作液浓度为0.02%。注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA会影响细胞生长EDTA 溶液配制：用D-Hanks 液溶解后，高压蒸汽灭菌

18、，小瓶分装，4 保存,H调整液,为了营养成分稳定和延长贮存时间，在配制营养液时一般不预先加入NaHCO3，而在使用前再加入。故NaHCO3都是单独配制，高压灭菌。此外，为了维持培养液恒定的pH，以利于细胞的生长和增殖，还可利用Hepes强缓冲液。,H调整液- NaHCO3 溶液,常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，滤过除菌或高压灭菌，分装，4 保存调节pH时，NaHCO3要逐滴加入，并不时摇动培养液，以防止加入过量。当pH值过高后，可用灭菌的10醋酸溶液或通入CO2气体调节。,H调整液- Hepes液,一种弱酸，中文名为4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸，分子式为：C8H18O4N2S，分子量为23

19、8.31。主要作用: 防止培养基pH迅速变动。使用终浓度一般为10-50 mmol/L常配成1 M 储存液：用100 ml 双蒸水溶解23.8 g Hepes，滤过除菌或高压灭菌，分装小瓶，4 保存。使用时可向100 ml培养液中加入1 ml Hepes储存液，终浓度为10 mmol/L,青链霉素溶液 俗称双抗溶液，青霉素对G+菌有效，使用终浓度为10万U/L，链霉素对G-菌有效，使用终浓度为0.1g/L。一般配成100倍浓缩液，可用PBS或培养基配制。,抗生素液,各种抗生素使用情况,使用终浓度为2 mM。一般配成100倍浓缩液，配制时加温至30 oC，充分溶解后过滤除菌，分装后-20 oC储

20、存。,谷氨酰胺补充液,（二）细胞培养的设备条件,一定的密闭性通风透气良好，但不会因此造成室内污染适合于消毒方便进出但不会因此而影响无菌室的“无菌性”，保证工作空间的“绝对”无菌一般包括：准备室、培养室和缓冲室,无菌室的条件,准备室：用于进行培养器皿的清洗、包装、培养物质的准备和消毒以及供应物品的保藏等。培养室：用于进行细胞培养和各种无菌操作的实验室。其基本条件是：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。缓冲室：（更衣室）,专用培养实验室布局示意图,普通细胞培养室内走廊,宽敞的细胞培养区,超净工作台，CO2培养箱，倒置显微镜干燥箱，滤器，自动双重纯水蒸馏器，纯水仪，压力蒸汽消毒器离心机及天平

21、冰箱，细胞冷冻存储器 (液氮容器或低温冰箱) 常用培养器皿：培养瓶，培养皿，多孔培养板，吸管，加样器其它用品：离心管，冻存管，酸缸，细胞计数板/仪，烧杯，注射器，量筒等,无菌室内的设备,培养设备,常用培养器皿,玻璃培养器皿为主，一次性培养器皿为辅。,玻璃器皿 玻璃瓶、培养瓶、培养皿、移液管和吸管、离心管、其它塑料器皿培养瓶、培养皿、多孔培养板、移液管、离心管、注射器、其它,超净工作台(clean bench),利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气以微流方式徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。注意检查是否堵塞！（看酒精灯）,外流式 （基本不用）侧流式

22、 直流式,超净工作台结构和模式图,生物安全柜,CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2，85%湿度。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：,用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净，定期消毒（紫外线、酒精）。箱内水槽中加灭菌蒸馏水3 L以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。,学生正在进行细胞观察,倒置显微镜,倒置显微镜,用于烘干和干热消毒玻璃器皿（160 ，2 h）。,电热干燥箱,滤 器,Zeiss滤器：过滤除菌，大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌,自动双重纯水蒸馏器 纯水仪,紫外灯,紫外线消毒。 主要用于培养室空气、操作台、塑

23、料培养皿和培养板等表面消毒,大容量高压蒸汽灭菌器,全自动手提式灭菌器,移液器,含有两个室，每个室被划分为9个方阵，其中4个方阵有16个小方格，为0.1 mm3 或 110-4 ml，细胞浓度取决于已知体积中的细胞数。,细胞计数板,精密pH计 微孔板震荡器,磁力搅拌器,高速离心机,超速离心机,液氮罐,四、细胞培养物的污染及防止,凡混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物，都应视为污染。,污染对细胞的影响,根据污染物和污染程度的不同，对细胞的影响不同在细胞受有害物污染时间短、污染程度轻、并能及时排除污染物的情况下，细胞有可能恢复。当污染物持续存在于培养环境中时，轻者细胞增殖生长缓慢、

24、分裂相减少、细胞变得粗糙、细胞轮廓增强，重者细胞停止增殖，分裂相消失，细胞质中出现大量堆积物，细胞变圆或崩溃从瓶壁脱落。,无 毒：无毒是培养细胞的必需条件。凡与细胞 直接或间接接触的东西都必须是无毒的。,空气/器材/操作/血清/组织样本,污染途径,污染来源,不洁的动物组织标本很多动物组织本该是无菌的，但取材时不小心也会有污染的机会。组织本身含有细菌，如取材时不用浓的抗生素洗液洗涤浸泡，也会带菌，造成细胞污染。空气如果操作室与外界隔离不严或消毒不充分，很容易造成污染。另外，净化工作台使用过久，滤板未定期更换或长久不更换，滤网受尘埃堵塞，工作时不带口罩或外界气流过强，污染空气进入操作区，也会导致污

25、染。春夏季南方地区多雨，空气湿度大，含菌量多，工作不注意也易污染。,污染来源,清洗消毒培养用物品、材料洗刷不净，灭菌不彻底也会引入微生物和有毒物质。操作 - 来自操作者的污染主要有以下几方面：器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过，或者是否已经消毒灭菌处理过，或者虽经处理，时隔已久又末重新处理操作者未戴口罩、帽子，呼气中排出细菌和支原体。培养瓶口未用75%酒精擦和烧灼操作者不当心，动作不正确而将吸管或无菌器具碰到了污染的物品，如手上皮肤和瓶子外壁等操作者操作时大声说话，来回走动扬起灰尘等,污染的类型 - 细菌污染,细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂

26、量)，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有G+菌，其中又以白色葡萄球菌较常见，其次枯草杆菌，大肠杆菌、假单胞菌等G-菌。受细菌污染后，培养液会出现变混浊，pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。,污染的类型 - 真菌污染,真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发

27、生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。,污染的类型 -病毒污染,用组织细胞培养法生产疫苗，如没有除去潜在病毒的组织培养物，会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病毒，B淋巴细胞含EB病毒，细胞会发生变

28、异、转化，形成异倍体细胞系。潜在病毒是细胞大量生产疫苗、干扰素等生物制品中的难题。,污染的类型 - 支原体污染,培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。,污染的类型 - 非同种细胞污染,由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，操作不当，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。,真菌感染 支原体污染 电镜照片,细菌污染,荧光染色法(33258)显示染色体，细胞周围亮点为支原体,Giemsa染色法，附于胞质上黑点为支原体,扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆形颗粒为支

29、原体,污染的鉴别-细菌、真菌污染的检测,肉眼观察 细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到。如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。镜下观察 在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。接种观察 采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。,污染的鉴别-支原体污染的检测,相差显微镜观察 将细胞接种于事先放置于培养瓶内的支持物(一般用长形盖玻片)，24小时后取出支持物，用相差油镜观察；若不用支持物培养法，直接取少许培养液滴在载

30、物片上，再盖上盖片观察亦可。支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间。,污染的鉴别-支原体污染的检测,荧光染色法观察 荧光染料Hoechst33258能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，荧光显微镜观察。染色方法：将细胞接种在盖片上，在细胞汇合前取出玻片，用不含酚红的Hanks液漂洗，1:3醋酸甲醇固定10 min，再用生理盐水漂洗后置于50 g/mL的Hoechst 33258(生理盐水配制)中染色10 min，蒸馏水漂洗1-2 min，向细胞面滴加数滴pH5.5磷酸缓冲液，然后置荧光显微镜下观察。荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。,污染的鉴别-支

31、原体污染的检测,电镜检测 用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48-72 h，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行。需经过固定、包埋、切片后才能进行观察。培养检测 将2.5109/L细胞悬液5 mL加入45 mL支原体肉汤培养基，培养14 d后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5 ml加入已冷却到50 的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37 培养3 d观察有无“荷包蛋”菌落出现。,污染的清除,培养细胞一经污染，多数较难处理。污染细胞价值不大，宜弃之；有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采

32、取以下办法清除。使用抗生素加温处理使用支原体特异性血清其他方法动物体内接种除菌法、巨噬细胞吞噬法、污染培养瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及过滤法等，但均较麻烦，且效果不确定。所以一旦支原体污染，除非有特别重要价值，一般均弃之重新培养。,污染的清除 - 使用抗生素,抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双抗生素(青霉素100u/mL加链霉素100 g/mL)污染后清除用药需采用大于常用量5-10倍的冲洗法，于加药后作用24-48 h，再换常规培养液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品种除青霉素、链霉素外，还可用庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素

33、、四环素、制霉菌素等。,巨噬细胞在体外培养条件下仍然可吞噬微生物并将其消化。利用96孔培养板将极少量的培养细胞与巨噬细胞共培养，可以在高度稀释培养细胞、极大地降低微生物污染程度的同时，更有效地发挥巨噬细胞清除污染的效能。本方法与抗生素联合应用效果更佳。,污染的清除 - 与巨噬细胞共培养,污染的清除 - 加温处理,将污染的组织培养物在41 培养18 h，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。所以在处理前要进行预试验，确定能最大限度杀死支原体又对细胞影响最小的加热时间。此法有时不可靠。若先用药物处理后，再以41加温处理效果更佳,污染的清除 -使用支原体特异性血清,用5%的兔支原体抗血清(血凝效价1:3

34、20以上)可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。此法比较麻烦，不如用抗生素方便、经济。,污染的预防,预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到最小程度一般预防可从以下几方面着手：从物品、用品消毒灭菌着手从操作者做起防止细胞交叉污染,重在预防，排除困难！,污染的预防 - 从操作者做起,操作者责任心要强，要细心稳重，操作技术要熟练。进无菌室前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5 min，按规定穿隔离衣。进入后关好门，坐下来尽量少走动。实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射0.5-1 h

35、灭菌，以70% 乙醇擦拭无菌操作台面，开启无菌操作台风扇约运转10 min。事先要严格检查器材、溶液和培养物，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大批污染。先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。实验完毕及时收拾，保持实验室清洁整齐，最后用消毒水浸泡的纱布擦台面。,污染的预防-防止接触细胞物品污染,无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品（试管架、吸管或吸管盒等）可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%乙醇擦拭后带入

36、无菌操作台内。小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验，实验操作都应该在酒精灯的周围进行。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。操作时要常更换吸管，切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。,污染的预防-防止细胞交叉污染,在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好做上标记便于辨别。并按顺序进行操作，避免一起进行时易发生混乱。所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，均应及早留种冻存，一旦发生污染可弃之复苏，重新培养。每次操作只处理一株细胞株，即使培养基相同亦不

37、共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70% 乙醇擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10 min以上，再进行下一个细胞株之操作。,根据建筑材料的差异选择合理的消毒方法。每日（使用前）紫外照射(1-2 h)，每周甲醛、乳酸或氧乙酸熏蒸（2 h）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次。防止无菌室的污染。,3.1 无菌室,造成污染的可能原因：送入无菌室的风没有被过滤除菌进入无菌室时使外界空气直接对流进无菌室的操作间在操作间开启被污染的培养器皿或将污染液体、器物洒落在操作间无菌室有未被消毒的死角等。,侧流式、直流式：在净化气流与外界气流的界面处无菌程度较低；外

38、流式：气流直接流向操作者。,3.2 超净台,超净台的使用和保养：安装在无菌室内；台面内风速不宜过大或过小；使用前开启紫外灯照射15 min左右，然后让超净台预工作10-15 min；使用完毕，用70%酒精擦拭台面和台内四周；定期用福尔马林熏蒸超净台。,3.3 培养用品的清洗,在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长。微生物产品附带杂物上次细胞残留物非营养成分的化学物质需要清洗的培养用品玻璃器皿的清洗胶塞的清洗塑料制品的清洗,1）玻璃器皿的清洗,浸泡：清水浸泡，软化和溶解附着物。新器皿用自来水简单刷洗，然后5%盐酸浸泡过夜；用过的器皿在用后应立即浸入清水中；刷洗

39、：将浸泡后的器皿放入洗涤剂（不能用含砂粒的洗衣粉）水中，用软毛刷反复刷洗，然后洗净洗涤剂，晾干。浸酸：将晾干的器皿浸泡到酸液中不少于6 h，应充满并完全覆盖；取出时应沥干并将器皿放入合适容器运输。清洗：手工清洗浸酸后的每件器皿都至少重复“灌满-倒空”15次以上，然后用蒸馏水浸洗2-3次，烘干后包装。,清洁液的配制,配制时，操作者必须小心认真，佩戴耐酸手套和防护眼镜，严格按步骤进行。1、按配方称量重铬酸钾，完全溶入水中2、按配方把浓硫酸缓慢加入1液中，并边加边搅动3、自然冷却，备用。新配制的酸液呈棕红色，使用时间过久则变暗、发绿或浑浊,清洁液的配方,原则1、酸倒入水中2、慢，有耐心（主要散热，搅

40、拌）3、没必要在室外配制，最好附近有水源，万一酸溅到身上要尽快冲洗。,2）橡胶制品的清洗,新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理 常规清洗方法用0.5M NaOH 或洗衣粉煮沸15 min（以除掉培养中的蛋白质），流水冲洗，0.5M的HCl煮沸15 min，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20 min，晾干备用每次用后立即置入水中浸泡，清洗方法基本同玻璃器皿，胶塞的洗刷重点是胶塞使用面，应逐个刷洗。,3）塑料制品的清洗,塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品若需反复使用，清洗步骤：,流水充分冲洗晾干浸酸(24 h)流水充分冲洗沥

41、水蒸馏水漂洗23次晾干备用流水充分冲洗晾干2% NaOH 浸泡过夜流水充分冲洗5%盐酸溶液浸泡30 min流水充分冲洗沥水蒸馏水漂洗23次75%酒精浸泡过夜晾干备用,4）不锈钢除菌滤器的清洗,洗涤剂刷洗新的或用过的滤器-流水冲洗15 min-离子水冲洗-去离子水浸泡24 h-三蒸水浸泡24 h-干燥备用。,3.4 培养用品的消毒和灭菌,通过消毒灭菌（将已存在的微生物杀死）和无菌操作技术（防止已消毒灭菌的用品被污染）来防止培养的细胞被污染,对细胞培养用品进行消毒前要进行严格包装。,1） 包装,常用的包装材料：牛皮纸、锡箔纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、特制消毒筒、较大的培养皿等。,金属器械等用牛皮纸包

42、装后再放入饭盒内，较大的器皿可进行局部包扎。,2） 常用消毒方法及选择,高压蒸汽灭菌：对生物材料有良好的穿透力，造成蛋白凝固变性而使微生物死亡。1.5个大气压（121 oC），15-30 min。布类、衣物、玻璃器皿、金属器械、胶塞及某些培养用液高温干热灭菌：将电热烤箱的物品室加热到160 上，保存1.5-2 h。玻璃器皿、金属器械及不能与蒸汽接触的物品紫外线：波长240-300 nm的紫外线具有杀菌作用,260-266 nm杀菌作用最强。空气、手术室、传染病房、细菌实验室、不耐热物品表面电离辐射：射线和加速离子照射。金属、塑料、橡胶、玻璃、一次性用品等过滤：遇热而发生变性失效的试剂或培养用液,物理消毒法,用化学消毒剂来消毒那些不能用物理消毒等方法进行消毒的物品和场地。甲醛：无菌室内的空气和物体表面环氧乙烷：塑料用品、不耐热及不能受潮湿的物品，不可空气消毒乙醇：70-75%的乙醇水溶液氯已定：皮肤及创面消毒戊二醛：2%的碱性戊二醛溶液，浸泡金属器械、温度计、橡皮塞、塑料管等新洁尔灭：0.1%水溶液对器械、皮肤、操作表面擦拭和浸泡消毒碘伏与碘酊：能杀死细菌、芽孢、真菌、病毒等,化学消毒法,使用前处理 56 oC灭活30 min。储存条件一般储存于-20 oC，避免反复冻融，购买大包装后，先灭活，然后分装冻存，使用前4 oC融化。使用浓度一般为5-20%，最常用为10%。,血清：,